全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2008, 35 (4) : 481 - 486
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2007 - 10 - 19; 修回日期 : 2008 - 03 - 11
基金项目 : 国家林业局重点科学技术研究计划林业新技术开发与储备专项 (2006216) ; 湖南省教育厅科学研究项目 ( 07C229) ;
湖南省科技计划项目 (00JZY2155) ; 中南林业科技大学青年科学基金项目 (0700913)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: tanxiaofencn@yahoo1com1cn)
梨 S基因芯片的试制及分子杂交条件的优化
江　南 1, 2 , 谭晓风 13 , 陈　洪 1 , 王秀利 2 , 张　琳 1 , 曾艳玲 1
(1 中南林业科技大学经济林育种与栽培国家林业局重点实验室 , 长沙 410004; 2 湖南工业大学绿色包装与生物纳米技
术应用湖南省重点实验室 , 湖南株洲 412008)
摘 　要 : 为研究寡核苷酸芯片在确定梨品种 S基因型中的应用价值 , 根据梨自交不亲和基因的结构特
点设计了部分 S基因的检测探针 , 并制成寡核苷酸芯片 ; 采用引物 Cy3荧光标记法标记检测样品的 PCR产
物并进行杂交 , 以检测不同样品的 S基因型。结果表明 : 通过对不同杂交温度、杂交时间等的探索获得了
较好的反应条件并用制备的芯片检测了已知 S基因型的梨样品 , 检测结果与各品种的已知基因型相符。证
明寡核苷酸芯片检测梨品种的 S基因型是一种切实可行的检测方法 , 若对芯片进一步完善 , 则在今后梨自
交不亲和性状的机理研究及梨自交不亲和性状的利用等方面将有着广阔的应用前景。
关键词 : 梨 ; 自交不亲和性 ; S2RNase基因 ; 基因芯片 ; 分子杂交
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2008) 0420481206
Prepara tion of Prototype S 2RNa se M icroarray and M olecule Hybr id iza tion
Cond ition
J IANG Nan1, 2 , TAN Xiao2feng13 , CHEN Hong1 , WANG Xiu2li2 , ZHANG L in1 , and ZENG Yan2ling1
( 1 Key Laboratory of N on2W ood Forest Product of S tate Forestry A dm inistra tion, Central2Sou th U niversity of Forestry and Technolo2
gy, Changsha 410004, China; 2 Key Laboratory of Green Packaging and B iologica l N anotechnology, Hunan U niversity of Tech2
nology, Zhuzhou, Hunan 412008, China)
Abstract: To exp lore the app lication of oligonucleotide m icroarray in identification of pears S 2genotype,
some p robes for S 2RNase detection were designed according to the structure characteristic of self2incompatibili2
ty gene, and oligonucleotide m icroarray was p repared. The PCR p roducts of S 2RNase were amp lified by Cy32
labeled p rimer and hybridized with the m icroarray in order to detect the S 2genotype of pears. Op tim ized reac2
tion conditions were gained by exp loration of hybridization temperature and hybridization time. The m icroarray
results of S 2genotype of pear were sim ilar with the RFLP and sequenced results. In conclusion, the oligonucle2
otide m icroarray was an effective method in detecting S 2genotype of pear. W ith the future imp rovement, it
could be widely used in the study of self2incompatibility of pear.
Key words: pear; self2incompatibility; S 2RNase gene; gene chip; hybridization
植物自交不亲和性是显花植物生殖过程中一种常见现象 , 根据花粉的自交不亲和表型的遗传控制
方式可将植物自交不亲和性分为配子体自交不亲和和孢子体自交不亲和两类 (薛勇彪和孟金陵 ,
1995)。梨是典型的配子体自交不亲和植物 (徐义流和张绍铃 , 2003)。自交不亲和性是由单一基因
位点的复等位基因 ( S 基因 ) 控制 , S 基因的产物具有 RNase活性 , 能分解来自相同基因的花粉
rRNA和 mRNA ( Kao, 1994) , 导致不亲和现象的产生。因此 , 雌蕊和花粉的 S基因不同 , 表现为亲
和 , 相同表现为不亲和。在梨栽培中 , 必须配置 S基因型不同的授粉品种 , 才能保证正常的授粉受精
园 　　艺 　　学 　　报 35卷
和丰产稳产。确定梨品种所包含的 S基因 (S 2RNase) 和 S基因型便成了梨栽培、育种 (特别是杂交
育种 ) 的重要环节。目前国内外主要运用分子生物学方法结合杂交授粉试验来确定 S基因型 , 常用
的方法有 PCR - RFLP技术、DNA序列测定技术、 cDNA克隆及序列分析方法等。我国有近 2 000个
梨品种 , 目前只有少数品种的 S基因型被确定。由于国内梨品种的 S复等位基因非常丰富 , 利用现有
的技术鉴别众多品种 S基因型 , 不仅工作量大 , 花费时间长 , 而且检测单个样本的 S基因型成本较
高 , 自动化程度低。开发鉴定梨 S基因型的新方法 , 加快梨品种 S基因型确定的步伐 , 是当前梨自交
不亲和研究的重要内容和梨生产实践急需解决的重大问题。
基因芯片 ( genechip s) 又称 DNA芯片 (DNA chip s) 或 DNA微阵列 (DNA m icroarray) , 基本原
理是基于同源序列的配对。即根据目的基因设计相应的检测探针 , 探针序列包含于目的扩增片段 ; 将
探针有序地固化于芯片片基上 , 在优化条件下 , 将与已标记的待测样品中靶分子杂交 , 并由样品和探
针的互补序列形成稳定的双链结构 , 通过检测杂交信号的强弱来获取样品的遗传信息 ( Schena,
2004; 江南和谭晓风 , 2007) 确定样品的基因类型。碱基互补配对原则的严谨性保证了杂交反应的特
异性和检测的特异性。目前基因芯片已广泛应用于杂交测序、新基因发现、基因型的确定、突变检测
和疾病诊断等诸多领域 , 应用前景广阔。但国内外尚未见有梨或其他植物 S 2RNase基因芯片制作和应用
的报道。本试验拟针对梨 S 2RNase基因的结构特点选择性地设计部分 S 2RNase特异的寡核苷酸探针 , 试
制梨自交不亲和性基因型检测寡核苷酸芯片 , 并对运用芯片检测梨品种 S基因型进行初步探索。
1　材料与方法
111　植物材料与主要试剂及仪器
所用植物材料为梨树新鲜叶片 , 从中国农业科学院郑州果树研究所和辽宁果树研究所采集 , 共选
用了 7个品种 , 分别为金梨、鲜黄、黄金、桂冠、黄花、大核白和青梨 , 本实验室采用分子生物学技
术已确定这些品种的 S 基因型分别为 S1 S1、S3 S5、S3 S4、S2 S16、S1 S2 (谭晓风 等 , 2005 )、S16 S19、
S19 S19 (乌云塔娜 等 , 2005)。
试剂 : APTES (3 -氨基丙基三乙氧基硅烷 ) 购自 Sigma公司 , 杂交液 Ⅲ购自上海生工生物工程
技术服务有限公司 , 戊二醛购自 Am resco公司 , ExTaq聚合酶购自大连宝生物工程有限公司 , PCR产
物纯化试剂盒购自安比奥试剂公司 , 其他生化试剂和常用试剂均为分析纯。
主要仪器 : PCR扩增仪 ( PCT2220) , 恒温杂交仪 ( SIM 2HP11) , 扫描仪 (AXON24100A ) , 凝胶
成像仪 ( GelDocEQ ) , 核酸、蛋白定量分光光度计 (Nanodrop ND21000 V31310)。
112　引物设计及合成
根据文献 (谭晓风 等 , 2005) : S基因 HV区两端是保守序列 , 根据 HV区两端的保守序列分别
设计正向引物 “FTQQYQ”(5′2TTTACGCAGCAATATCAG23′) 和反向引物 “anti2ⅡW PNV” ( 5′2TTCG2
GCCAAATAATT23′) (图 1)。正反向引物序列的 5′端合成时均修饰荧光物质 Cy3, 由上海生工生物工
程技术服务有限公司合成。
图 1　梨 S 2RNa se基因结构及引物的位置
C: 保守区 ; HV: 高变区 ; RC: 相对保守区。
F ig. 1　The gene structure of pear S2RNa se and its pr im er loca tion
C: Conserved region; HV: Hyper variable region; RC: Relative conserved region.
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　4期 江 　南等 : 梨 S基因芯片的试制及分子杂交条件的优化 　
113　寡核苷酸探针设计及合成
根据 GenBank及相关文献 , 结合本实验室的研究成果 , 获得 45个 S基因的 HV区特异序列。HV
区是 S 2RNase特异识别花粉配体的专一区 ( Ioerger et al. , 1991; Matton et al. , 1997) , 在不同 S 2
RNase间变异较大 , 是判断不同 S基因的最重要依据。根据 HV区特异序列设计特异寡核苷酸探针 ,
设计标准 (马文丽和郑文岭 , 2002) : ①探针 Tm值应接近整个基因组的平均 Tm值 , 上下波动 5 ℃;
②探针分子内重复的单一碱基连续不超过 4个 ; ③ G + C含量为 40% ～60% , 减少非特异性杂交并保
证杂交的特异性 ; ④探针分子内部稳定二级结构配对碱基长度少于 4 bp, 这样可以保证不会因探针内
部稳定的二级结构而影响杂交效率 ; ⑤经同源比较与其它序列的相似性小于 40% ; ⑥经比对与非探
针备选序列的同源片段连续不超过 20个碱基。最后选择性地设计出 6个 S基因 (S 2RNase) 的寡核苷
酸探针 , 长度 32 bp。设计的探针合成时均 5′氨基修饰 , 由上海基康生物技术有限公司合成。
114　基因组 D NA的提取和 PCR扩增
基因组 DNA的提取采用本实验室改良的 CTAB法 (谭晓风 等 , 1999)。PCR反应体系 50μL包
括 10 ×buffer 5μL, 25 mmol·L - 1 Mg2 + 4μL, 215 mmol·L - 1 dNTP 4μL, 10μmol·L - 1 5′Cy3标记的
正反向引物及 115 U ExTaq聚合酶 , 模板 DNA 25～30 ng, 补 SPW (超纯水 ) 至 50μL。PCR反应双
循环 ; 94 ℃预变性 2 m in; 94 ℃变性 30 s, 48 ℃退火 30 s, 70 ℃延伸 2 m in, 10个循环 ; 94 ℃变性 30
s, 48 ℃退火 30 s, 70 ℃延伸 1 m in 30 s, 25个循环 ; 70 ℃延伸 7 m in。PCR反应结束后 , 取 5μL PCR
产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。用 PCR产物纯化试剂盒对扩增理想的产物进行纯化。
115　芯片的制备与处理
寡核苷酸探针溶解于 pH 910碳酸缓冲液中并稀释成终浓度 100μmol·L - 1。按设计好的阵列将混
合液手动点样至醛基化玻片 (普通载玻片经 APTES和 5%戊二醛处理 ) 上 , 点样结束后 37 ℃水化 2
h, 然后用 012%硼氢化钠溶液处理 30 m in, 再分别用 0101%磷酸缓冲液和双蒸水清洗芯片 , 将芯片
吹干备用。阵列设计见图 2。S1、S2、S4、S5、S16和 S19为 6个 S 基因 PM 探针 , S1621是 S16的错配
(MM ) 探针 , 同等浓度的无关探针 (与 S基因同源性很低的寡核苷酸序列 ) 作为阴性对照 , 碳酸缓
冲液作为空白对照。
图 2　S基因检测阵列设计
F ig. 2　D esign of m icroarray probe detecting S 2genotype
116　杂交和洗涤
按 1∶1∶1的比例将纯化后的荧光 PCR产物、杂交液和灭菌水混合 , 95 ℃水浴变性 5 m in后 , 迅
速插入冰中冷却 , 然后将混合液加在芯片的阵列中 , 每个阵列加混合液 12μL, 盖玻片封片 , 将芯片
封入湿盒中于杂交箱中 47 ℃杂交 4 h, 杂交完毕后分别依次用 1 ×SSC /011% SDS、015 ×SSC /011%
SDS、015 ×SSC行梯度洗涤 , 每次 3 m in, 最后双蒸水洗涤数次 , 吹干以备信号检测。
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117　检测与分析
用 AXON24100A芯片扫描仪使用 Cy3光源扫描 (580 nm ) , 扫描结果用 GenePix分析软件进行分
析。在扣除背景值后 , 信号强度以每条探针重复点的均值计算。
2　结果与分析
211　不同杂交温度对杂交信号的影响
　　回收纯化 PCR 产物 , 分别获得梨 S1、S2、
S4、S5、S16、S19 2RNase基因片段 , 各片段分别与
对应的探针杂交 , 杂交温度梯度为 43、44、45、
46、47、48、50、52、55 ℃。从图 3可见 , 在相
同杂交时间内 , 低温下杂交信号不强 , 随温度升
高 , 杂交信号增强 , 但达到 48 ℃后明显减弱。综
合比较 , 梨基因芯片杂交温度以 47 ℃为宜。
不同的 S 2RNase基因片段与对应探针杂交 ,
结果差异不大。低温杂交时适当延长杂交时间可
提高杂交信号。
图 3　不同温度条件下杂交信号强度
F ig. 3　The fluorescence in ten sity a t d ifferen t tem pera ture
212　不同杂交时间对杂交信号的影响
以桂冠 (S2 S16 ) 为杂交对象 , 探究不同时间的影响 (在本项阵列点样时 S5与 S16位置对换 ) , 结
果如图 4, 可见杂交时间低于 3 h, 杂交信号较弱 , 随着时间的增加 , 杂交信号逐渐增强 , 但超过 4
h, 非特异性杂交增强 , 检测效果很差。因此梨基因芯片杂交时间以 4 h为宜。
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213　不同 PCR产物回收浓度对杂交信号的影响
以青梨 (S19 S19 ) 为杂交对象 , 回收纯化青梨 PCR产物 , 测定浓度 , 选择 OD260 /280 118 - 210的扩
增系列 , 灭菌 SPW将 PCR产物稀释获得 20、40、60、80、100、120、140 ng·μL - 1等浓度梯度。试
验证明浓度达到 80 ng·μL - 1时杂交信号较强 , 且在 80～140 ng·μL - 1浓度范围内杂交信号强度变化
不大 , 所以确定芯片杂交时梨检测样品 PCR产物浓度取折中值 100 ng·μL - 1。
214　梨品种自交不亲和基因型检测结果
采用上述适宜条件 , 用寡核苷酸芯片检测黄花、桂冠、黄金、鲜黄、大核白 5个已知自交不亲和
基因型的梨品种 , 结果如图 5。
根据所利用的杂交探针种类和杂交信号 , 可以判别各品种所包含的 S 2RNase基因和 S基因型分别
是 : 黄花 S1 S2、桂冠 S2 S16、黄金含 S4、鲜黄含 S5、大核白 S16 S19。芯片检测的结果与我们过去用分子
生物学技术检测的各品种的 S基因型完全相符。重复杂交试验 , 结果完全一致。
3　讨论
梨自交不亲和基因 (S 2RNase) 寡核苷酸探针是根据梨 S等位基因的 HV区特异序列设计并合成
的。梨 S基因主要包括 5个保守区 ( conserved region, C区 )、一个高变区 ( hyper variable region, HV
区 ) 和一个内含子区 ( intron)。保守区中 C1、RC4、C5为疏水区 , 与 S 2RNase的结构有关 , C2、C3为
亲水区 , 是 S 2RNase的活性部位 , HV 区是 S 2RNase特异识别花粉配体的专一区 ( Ioerger et al. ,
1991; Matton et al. , 1997) , 在不同 S 2RNase间变异较大 , 是判断不同 S基因的最重要依据。到目前
为止 , 在东方梨品种中已发现 45个 S复等位基因 (有文献支持的 S复等位基因有 38个即 S1 ～S38 ) ,
但本试验中选择性地设计出 6个 S基因的寡核苷酸探针 , 主要是考虑到不同 S 2RNase基因的 HV区碱
基序列差异存在着一个到数个氨基酸不等的差别 (乌云塔娜 , 2003)。另外 , 考虑到成本 , 从不同差
别区域内分别设计探针制成芯片 , 以探究杂交的准确性和利用梨自交不亲和基因寡核苷酸芯片检测梨
品种 S基因型的可靠性 , 为下一步实现梨自交不亲和基因寡核苷酸芯片高通量的研究打下基础。
利用纯化后的 PCR产物与芯片杂交有利于提高杂交的特异性和检测准确度。从杂交后扫描的结
果看 , 各芯片信号扫描结果与各品种的已知基因型完全相符 , 表明探针的特异性较好 , 芯片检测的准
确性可靠。探针 S1621是基因 S16的 MM探针 (错配一个碱基的探针 ) , 图 5, B (桂冠 S2 S16与芯片杂交
后的信号扫描结果 ) 与图 5, E (大核白 S16 S19与芯片杂交后的信号扫描结果 ) 表明 MM探针杂交信
号极弱 , 和完全配对的探针 (探针 S16 ) 的杂交信号有明显的区别。
为保证杂交的特异性和适当速率下杂交的稳定性 , 杂交过程中必须探索合适的杂交条件。合适的
温度是保证杂交有效而特异进行的重要条件 , 不仅可以为杂交提供能量 , 增加单链之间的结合机会 ,
而且可以提高杂交速率。本试验综合比较了多个杂交温度 , 以 47 ℃条件下各探针杂交效果较好。
杂交时间的控制也是保证杂交准确顺利进行的重要条件。一般来说 , 低温杂交时间较长 , 容易产
生非特异性杂交 , 高温杂交时间较短 , 特异性杂交强。为此 , 结合实际杂交温度 , 比较了多个时间段
的杂交信号 , 可以得出适宜的杂交时间。梨 S基因芯片以杂交时间 4 h效果最佳。
在保证合适杂交条件的情况下 , 最佳 PCR产物的回收浓度能保证得到最佳的杂交信号 , 芯片反
应动力学表明 ( Schena, 2004) , PCR产物浓度越高芯片杂交信号越强 , 所以在一般情况下 , 尽可能
使用较高的 PCR产物浓度。但探针分子浓度过高 , 对芯片反应质量会有不好的影响 , 芯片反应信号
强度会缓慢下降。本试验比较了 PCR产物系列浓度梯度的杂交反应 , 发现 PCR产物浓度为 20 ng·
μL - 1便可检测到较弱的杂交信号 , 达到 80 ng·μL - 1可得到较强的杂交信号 , 且在 80～140 ng·μL - 1
浓度范围内 , 杂交信号强度变化不大 , 所以确定 PCR产物浓度以 100 ng·μL - 1为宜。
通过试验 , 较成功地检验了部分梨自交不亲和基因寡核苷酸探针的特异性 , 同时也证明了梨品种
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自交不亲和基因型检测寡核苷酸芯片检测梨品种所包含的 S 2RNase基因和基因型是一种切实可行的检
测方法。如果进一步将所有 S 2RNase基因的特异性探针集中于芯片上的一个阵列 , 就能发挥基因芯片
大量、快速、准确检测梨品种 S基因型的重要作用 , 这是下一步工作的重点。
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