全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2007, 34 (2) : 295 - 300
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2006 - 07 - 09; 修回日期 : 2007 - 02 - 08
基金项目 : 国家教育部科技重点项目 (105089) ; 国家自然科学基金项目 (30671437)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: nnzsl@njau1edu1cn)
‘金坠梨 ’自交亲和性突变机制的初步研究
吴华清 , 张绍铃 3 , 吴巨友 , 王迎涛 , 吴　俊
(南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 自交不亲和性品种鸭梨的芽变品种 ‘金坠梨 ’自花授粉能结实 , 但其自交亲和性突变机制至
今不祥。本研究结果表明 , 鸭梨自花授粉结实率仅 2% , 自花花粉管在花柱中上部已经停止生长 , 而金坠
梨自花授粉结实率高达 76% , 自花的花粉管能正常生长至花柱基部 ; 鸭梨花柱能够接受金坠梨花粉并受精
结实 , 而金坠梨花柱却与鸭梨花粉杂交不亲和 ; 进一步鉴定出了鸭梨和金坠梨基于 S2RN ase基因的 S基因
型 , 发现两者 S基因型相同 , 均为 S21 S34 ; 通过克隆两品种 S2RN ase基因 cDNA全长序列并进行比较分析发
现 , 该两品种的 1对雌蕊 S 2RN ase基因在核苷酸序列上完全相同 , 且 S2RN ase基因均正常表达 , 表达量没有
明显差异 , 从分子水平上证实了金坠梨在花柱方面和鸭梨并无差异 , 可能是花粉 S基因发生突变 , 导致了
自交不亲和性功能的丧失 , 表现出自花授粉能够结实。
关键词 : 梨 ; 自交亲和性 ; 自交不亲和性 ; S 2RN ase基因 ; 变异 ; 授粉
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2007) 0220295206
M uta tiona lM echan ism of Self2com pa tible Pear Cultivar‘J inzhu ili’( Pyrus
bre tschne ideri)
WU Hua2qing, ZHANG Shao2ling3 , WU Ju2you, WANG Ying2tao, and WU Jun
(College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, China)
Abstract: J inzhuili ( Z) is a naturally occurred self2compatible ( SC) mutant from Yali ( Y) , a China2
native leading cultivar disp laying typ ical gametophytic self2incompatibility ( GSI). How Z mutated to SC is
unclear to date. In the p resent study, field pollination tests were carried out under four crosses ( Z selfed,
Yselfed, Z ×Y and Y ×Z) , and fruit setting percentage determ ined and pollen tube growth inspected under
fluorescent m icroscope. It was observed that more than 76% flowers set fruits and many pollen tubes grew
down to the base of style in crosses of Z and YXZ, whereas fruit setting did not occurred and most pollen tubes
were arrested at the upper part of style in the cross Y and ZXY. These results indicated that both Y and Z
functioned normally in SI response on the stylar part and could reject competent Y pollen, but accep ted Z pol2
len。Further molecular analyses revealed that both Y and Z harbored S21 2and S34 2RN ase, transcribed normal2
ly and were identical to one another in mRNA sequences of two S 2RN ases. A ll these data suggested that Z most
likely lost pollen SI function, and its style behave normally in SI response as that of its wild type Y did. How
pollen of Z mutated needs to be further investigated.
Key words: Pyrus bretschneideri; Self compatibility; Self2incempatibility; S 2RN ase gene; Mutation;
Pollination
梨的绝大多数品种表现为配子体型自交不亲和性 ( gametophytic self2incompatibility, GSI) , 因此
在梨生产上必须配置授粉树或花期人工授粉 , 才能获得经济产量 (张绍铃 等 , 2001)。人工授粉耗
物费时 , 并常因人工授粉不及时或花期不良气象条件等原因造成产量和品质降低。选育自花结实性品
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
种是解决该问题的途径之一。
以往的研究在梨自交不亲和性分子机理方面得到了许多突破性进展 ( H iratsuka et al. , 1995;
Zhang & H iratsuka, 1999a, 1999b)。众多的研究证实 , 该类自交不亲和性由具多态性的单一 S基因座
(S 2locus) 控制 , 该 S基因座至少包含两个基因 , 一个是雌蕊 S基因 ( S 2RN ase) , 决定雌蕊的 SI反
应 , 另一个是花粉 S基因 (尚不详 , 在樱桃等果树上认为花粉 S基因为 F2box基因 ) , 控制花粉的 SI
状况 , 因此该 S基因座又被称为 S单元型 ( S 2haplotype)。同一 S单元型的雌雄 S基因产物相互识别
后 , 将导致自交不亲和性反应 (W u et al. , 2005)。
鸭梨自花授粉结实率几乎为零 , 而鸭梨的枝变品种金坠梨虽然农艺性状与鸭梨基本一致 , 但自花
授粉结实率达 50%以上 (郗荣庭 , 1999)。
有关金坠梨发生自交亲和性突变的机制研究未见报道。作者拟通过调查金坠梨及其原始品种鸭梨
的自交和互交后的花粉管生长状况与坐果率、雌蕊 S基因型及其表达特性等方面 , 来探讨金坠梨自花
结实的原因 , 为进一步阐明梨自交亲和性突变机理提供一些实验证据 , 同时为自交亲和性品种选育提
供理论依据。
1　材料与方法
111　授粉试验
供试品种鸭梨和金坠梨均栽植于南京农业大学江浦农场园艺试验站梨资源圃。选取两品种长势均
匀的 5～6年生树 , 分别于 2005和 2006年春季进行授粉试验。
用硫酸纸纸袋保护整个花序 , 于开花前分别收集花药 , 室内 25℃条件下使其散粉后收集花粉作
授粉用。自花授粉时 , 于花朵开放前选留 2～3朵边花 , 其余摘除 , 然后套袋 , 待花药散粉后 , 轻轻
摇动 , 以确保授粉。
鸭梨和金坠梨互交 (鸭梨 ×金坠梨、金坠 ×鸭梨 ) 时 , 于开花前分别去雄后授粉 , 再套袋。
授粉当天算起 15 d后调查花序和花朵坐果率。
112　花粉管原位萌发荧光检测
用 XSJ - 2荧光显微镜 (重庆光学仪器厂 ) 观察花粉管在柱头上萌发和在花柱中的生长情况 (陶
书田 等 , 2004)。
113　D NA和 RNA提取
采集大花蕾期花朵 , 收集花柱 , 称量后提取其核酸或液氮中保存备用。叶片 DNA和花柱总 RNA
提取参照前文 (徐义流和张绍铃 , 2004; 张妤艳 等 , 2006) 的方法。
114　梨品种 S基因型的鉴定
根据梨 S1 ～S7 2RN ase保守序列 FTQQYQ 和 anti2IIW PNV 设计通用引物 PF ( 5′2TTTACGCAG2
CAATATCAG23′) 和 PR (5′2ACA /GTTCGGCCAAATAATT23′) (张妤艳 等 , 2006)。
115　S 2RN ase基因的 RT2PCR检测及全长 cD NA克隆
根据梨 S 2RN ase 5′端非翻译区保守序列设计引物 PFSP (5′2TGCCTCGCTCTTGAACAA23′) , 将 RT2
PCR产物 ( PFSP + Adap tor) 连接到 pGEM T2easy载体 ( TaKaRa) 中 , 按照使用说明操作 , 送宝生
物工程 (大连 ) 有限公司测序 , 测序结果进行 BLAST基本局部同源性搜索 , 并根据 S1 2、S21 2和 S34 2
RN ase分别设计特异反向引物 PR1 (5′2GCCATGTTTGATCCACTCTTT23′)、PR21 ( 5′2AATTTCCAACT2
GGGGTTCAAG23′) 和 PR34 ( 5′2TTCCAGAAGCCTGCATGATCG23′)。 RT2PCR 反 应 按 照 3′RACE
( TaKaRa) 试剂盒说明书进行。
反应结束后 , 取 PCR反应液 5μL 进行 2%琼脂糖凝胶电泳 , 拍照。
692
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　2期 吴华清等 : ‘金坠梨 ’自交亲和性突变机制的初步研究 　
2　结果与分析
211　鸭梨和金坠梨自花授粉及相互授粉条件下坐果率的比较分析
表 1表明 , 4个组合可分为两类 : 第 1类金坠梨自花授粉和鸭梨 ×金坠梨杂交授粉的花朵和花序
坐果率分别高达 75%和 98%以上 , 第 2类鸭梨自花授粉和金坠梨 ×鸭梨杂交授粉的花朵和花序坐果
率分别低于 2%和 6%。两类授粉组合间存在极显著差异。从表 1中坐果率可以看出鸭梨表现很强的
自交不亲和性 , 金坠梨自交亲和 ; 金坠梨花柱拒绝鸭梨的花粉 , 而鸭梨的花柱与金坠梨的花粉亲和。
表 1　4个授粉组合条件下的坐果率
Table 1　Fru it setting am ong four crosses
授粉组合
Crosses
花 Flower
授粉数
Pollinated
坐果数
Setted fruits
比率
Percentage ( % )
花序 Inflorescences
授粉数
Pollinated
坐果数
Bearing fruit
比率
Percentage ( % )
鸭梨自花授粉 Yali selfed 200 　2 110 aA 60 2 　313 aA
金坠梨自花授粉 J inzhuili selfed 200 152 7610 bB 52 51 9811 bB
金坠梨 ×鸭梨 J inzhuili ×Yali 196 　3 115 aA 52 3 　517 aA
鸭梨 ×金坠梨 Yali ×J inzhuili 196 148 7515 bB 50 50 10010 bB
212　鸭梨和金坠梨自花授粉及相互授粉条件下花粉管萌发和生长的比较分析
进一步通过荧光显微镜观察花粉管在柱头上萌发和花柱中的生长情况 (图 1) , 可以看出 , 鸭梨
和金坠梨花粉最初在柱头上的萌发以及花粉管在花柱上部的生长情况良好 , 在 4个授粉组合间没有明
显差异 ; 随后花粉管的生长 , 4个组合间差异逐渐明显 , 金坠梨自花花粉管长到花柱基部 (图 1,
B) , 鸭梨 ×金坠梨组合结果基本相同 (图 1, D ) ; 而鸭梨自花花粉管绝大多数在花柱的中部停止生
长 , 与金坠梨 ×鸭梨组合结果相似 (图 1, A和 C)。这些结果和坐果率结果相一致。
图 1　鸭梨和金坠梨自花授粉及相互授粉条件下花柱内花粉管生长情况
A. 鸭梨自交 ; B. 金坠梨自交 ; C. 金坠梨♀×鸭梨♂; D. 鸭梨♀×金坠梨♂。
F ig. 1　Pollen germ ina tion on stigma and tube growth in style under four cross
A. Yali selfed; B. J inzhuili selfed; C. J inzhuili ×Yali; D. Yali ×J inzhuili.
792
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
213　S 2RN ase基因检测及 S基因型鉴定
以通用引物 PF和 PR扩增基因组 S 2RN ase基因 (图 2) , 显示鸭梨和金坠梨各有两条相距很近的
带。于是在 4%变性聚丙烯酰胺凝胶中分离 PCR产物 (图 3) , 回收分离的条带 , 重新 PCR扩增后直
接测序。
两品种的测序结果 B ioEdit比较后发现两者完全相同 , 并进行 BLAST同源性搜索 , 结果发现较短
的序列和已经登录的 S21 2RN ase (AY250989 ) 基因片段完全一致 , 稍长的序列和 S34 2RN ase基因
(DQ269500) 片段完全相同 , 同时和 S34 2RN ase mRNA (DQ414813) 在编码区完全一致。因此我们将
鸭梨和金坠梨的 S基因型定为 S21 S34。
乌云塔娜 (2003) 研究认为鸭梨的 S 基因型为 S1 S21。因此我们用黄花梨品种 ( S1 S2 ) 作对照
(图 2 ) , 可以看出 , 鸭梨、金坠梨的扩增条带比 ‘黄花 ’的 S1 特征带要小 , 因为 S21 2RN ase
(AY250989) PF和 PR的扩增条带长度只有 336 bp, 而 S1 2RN ase为 367 bp。如果鸭梨和金坠梨含有 S1
等位基因 , 两个条带应该可以在 2%琼脂糖凝胶电泳中分开 , 至少不会太近 , 而 S34 2RN ase的长度为
341 bp, 只比 S21 2RN ase长 5 bp , 所以难以在 2%琼脂糖凝胶电泳中分开 , 但在变性聚丙烯酰胺凝胶中
可以分开 (图 3)。
图 2　2%琼脂糖凝胶电泳 ( PF + PR)
1. 鸭梨 ; 2. 金坠梨 ; 3. 黄花。
F ig. 2　2% agarose electrophoresis ( PF + PR)
1: Yali; 2: J inzhuili; 3: Huanghua.
图 3　4%变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳 ( PF + PR)
1. 鸭梨 ; 2. 金坠梨。
F ig. 3　4% SD S2PAGE ( PF + PR)
1. Yali; 2. J inzhuili.
　　用反向引物 PR1、PR21和 PR34, 检测鸭梨、
金坠梨和黄花的 S 2RN ase基因 (图 4)。
由图 4可以看出 , 鸭梨和金坠梨用 PR1作反
向引物没有扩增产物 , 而 ‘黄花 ’有扩增产物 ,
说明前两者不含 S1 2RN ase基因 , 而 ‘黄花 ’含
有。而当用 PR21和 PR34作反向引物时 , 鸭梨和
金坠梨均有相应的条带 , 而 ‘黄花 ’没有 , 说明
前两者均含有 S21 2和 S34 2RN ase, 而 ‘黄花 ’没
有。
将 PCR产物直接单向测序 , 结果和各自的序
列完全相同 , 说明 3个特异反向引物特异性强 ,
只能扩增出各自相对应的 S 2RN ase基因。由此进 图 4　琼脂糖凝胶电泳 ( PF + PR1 /21 /34)1. 鸭梨 ; 2. 金坠梨 ; 3. 黄花。F ig. 4　2% agarose electrophoresis ( PF + PR1 /21 /34)
1. Yali; 2. J inzhuili; 3. Huanghua.
892
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
　2期 吴华清等 : ‘金坠梨 ’自交亲和性突变机制的初步研究 　
一步说明 , 鸭梨和金坠梨花柱 S 2RN ase基因的 S基因型相同 , 均为 S21 S34。
214　S 2RN ase基因全长 cD NA克隆
将两品种 RT2PCR产物 ( PFSP + Adap tor) 进行质粒测序。序列分析表明 , 两者含有的两个克隆
核苷酸序列完全一致。
进一步 BLAST同源性搜索后发现 , 一个克隆和 S21 2RN ase编码区同源性为 100% (数据从略 ) ;
另一个和 S34 2RN ase mRNA (在 GeneBank的登录
号 : DQ414813) 同源性为 99% , 只有一个核苷
酸不同 , 但推测的氨基酸序列完全相同 , 然而与
S34 2RN ase基因组序列片段 (在 GeneBank的登录
号 : DQ269500) 在 5′非翻译区和编码区完全一致
(数据从略 )。
215　S 2RN ase基因转录水平分析
因反向引物 PR21和 PR34只能扩增 S21、S34 2
RN ase, 可用于两个基因的转录水平比较分析 , 结
果见图 5。
由图 5可以看出 , 鸭梨和金坠梨的两个基因
均有对应的条带出现 , 说明它们均被转录 , 而且
转录量没有明显的差异。
图 5　S 2RN ase基因的 RT2PCR分析
1. 鸭梨 ; 2. 金坠梨 ; M. Marker。
F ig. 5　Tran scr iptiona l ana lysis of S2RN ase genes
1. Yali; 2. J inzhuili; M: Marker.
3　讨论
在高等植物中 , 自交不亲和性普遍存在 , 是植物防止近亲繁殖 , 促进异花授粉的一种机制。但
是 , 在各种自然因素的作用下 , 自交不亲和植物也会发生自交亲和性突变。目前已知的一种自交亲和
性突变类型是花柱突变 ( Stylar2partMutant, SPM or SM ) , 如日本梨品种 ‘奥嗄二十世纪 ’(O sa2N ijis2
seiki, S基因型 S2 S4 SM ) 是 ‘二十世纪 ’ (N ijisseiki, S基因型 S2 S4 ) 的突变体 , 其中的一个花柱 S基
因 , 即 S4 2RN ase基因发生变异 , 导致 ‘奥嗄二十世纪 ’的花柱不能识别自己的花粉 , 严格来讲 , 是
不能识别 S4花粉 , S4花粉 (管 ) 可以正常生长 , 最终达到子房完成授粉受精 , 而 S2花粉管还是被抑
制 , 但是它的花粉自交不亲和 ( self2incompatibility, SI) 功能正常 , 如 ‘二十世纪 ’的花柱可以识别
并拒绝 ‘奥嗄二十世纪 ’的花粉 (张绍铃 等 , 2001; Sassa et al. , 2003)。
另一种自交亲和性突变就是花粉发生突变 , 即花粉失去 SI识别功能 , 而形成花粉 SI突变体
( Pollen2partMutant, PPM ) ( de Nettancourt, 2001)。
本研究的结果显示 , 鸭梨自花授粉坐果率极低 (表 1) , 绝大多数自花花粉管在花柱上部停止生
长 (图 1, A ) , 表明其自交不亲和性性状正常 , 即花粉和花柱的 SI功能正常 ; 而金坠梨自交结实率
高 (表 1) , 花粉管能够伸长至花柱基部 (图 1, B ) , 仅此仍不知究竟是花粉还是花柱 SI功能异常 ,
或者两者均发生变异 ; 而金坠梨的花粉能够穿过 SI功能正常的鸭梨花柱完成授精结实 (表 1和图 1,
D) , 至少表明其花粉失去 SI识别功能。但是当 SI功能正常的鸭梨花粉和金坠梨花柱相遇时还是发生
自交不亲和性反应 (图 1, C) , 这就表明金坠的花柱 SI功能正常 , 其发生自交亲和性变异 , 极可能
因花粉丧失 SI识别功能。
本试验进一步鉴定出了鸭梨和金坠梨基于 S 2RN ase基因的 S基因型 , 发现两者 S基因型一样 , 均
为 S21 S34 ; 而且 , 两品种的两个花柱 S 2RN ase基因均正常表达 , 表达量没有明显差异 ; 在克隆了两者
S 2RN ase基因 cDNA全长之后 , 通过比较 , 发现两者的花柱 S 2RN ase基因在核苷酸序列上完全相同 ,
进一步在分子水平证实了金坠梨在花柱方面和鸭梨并无差异 , 极可能是花粉 SI功能发生变化 , 导致
992
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　　艺 　　学 　　报 34卷
自交亲和性突变。
而花粉究竟是如何突变 , 到底是哪个等位基因还是两个都发生变异 , 有待于进一步研究。
References
de Nettancourt D. 2001. Incompatibility and incongruity in wild and cultivated p lants. Berlin: Sp ringer2Verlag: 163.
H iratsuka S, Okada Y, Kawai Y. 1995. Style basic p rotein correponding to 5 self2incompatibility alleles of Japanese pears. J. Japan Soc. Hort.
Sci. , 64: 471 - 478.
Sassa H, H irano H, N ishio T. 1997. Style2specific self2incompatibility mutation caused by deletion of the S2RN ase gene in Japanese pear ( Pyrus
serotina) . The Plant Journal, 12: 223 - 227.
Tao Shu2tian, Zhang Shao2ling, Chen D i2xin, W ei B i2yun. 2004. Study on characteristics of in situ pollen germ ination and tube growth of
Prunus m um e. Journal of Fruit Science, 21 (4) : 338 - 340. ( in Chinese)
陶书田 , 张绍铃 , 陈迪新 , 韦碧云. 2004. 果梅花粉原位萌发及花粉管生长特性的研究. 果树学报 , 21 (4) : 338 - 340.
W u Hua2qing, Zhang Shao2ling, W ang Hong2tao, Qu Hai2yong, L iu Zhao2long. 2005. Self2pollen recognition and rejection in flowering p lants.
Acta Botanica Boreal2Occident Sinica, (3) : 593 - 606.
W uyun Ta2na. 2003. Isolation and identification of self2incompatibility genes of Chinese pear ( Pyrus bretschneideri) 〔P. D. D issertation〕.
Changsha: Central South Forestry University: 46. ( in Chinese)
乌云塔娜. 2003. 中国白梨自交不亲和基因的分离鉴定 〔博士论文〕. 长沙 : 中南林学院 : 46.
Xi Rong2ting. 1999. Yali pear in China. Beijing: China Forestry Press. 54 - 55. ( in Chinese)
郗荣庭. 1999. 中国鸭梨. 北京 : 中国林业出版社 : 54 - 55.
Xu Yu2liu, Zhang Shao2ling. 2004. A mathod for RNA isolation from pear style. Journal of AgriculturalB iotechnology, 12 (6) : 737 - 738. ( in
Chinese)
徐义流 , 张绍铃. 2004. 梨花柱 RNA提取方法. 农业生物技术学报 , 12 (6) : 737 - 738.
Zhang Shang2ling, Fang J ing2gui, Yang J i2gun. 2001. Study on the genetics of fruit self2incompatibility and and its physiological mechanism.
Journal of Fruit Science, 18 (1) : 49 - 52. ( in Chinese)
张绍铃 , 房经贵 , 杨记磙. 2001. 果树自交不亲和性的遗传与生理机制及其研究. 果树学报 , 18 (1) : 49 - 52.
Zhang S L, H iratsuka S. 1999a. Analysis of varietal differences in self2and cross2incompatibility reactions of Japanese pears using stylar culture
technique. J. Japan Soc. Hort. Sci. , 68 (2) : 373 - 383.
Zhang S L, H iratsuka S. 1999b. Varietions in S2p rotein levels in styles of Japanese pears and the exp ression of self2incompatibility. J. Japan Soc.
Hort. Sci. , 68 (5) : 911 - 918.
Zhang Shao2ling, H iratsuka S, Xu Guo2hua, Fang J ing2yoa, L iu You2liang. 2001. Exp ression and possible role of S4 ( S4SM ) genes in the styles
of self2incompatible pear cultivar and its self2compatible mutant. Acta Botanica Sinica, 43 (11) : 1172 - 1178. ( in Chinese)
张绍铃 , 平塚伸 , 徐国华 , 房经贵 , 刘友良. 2001. 梨自交不亲和及其亲和突变品种花柱内 S4 ( S4SM ) 基因的表达与作用的比
较. 植物学报 , 43 (11) : 1172 - 1178.
Zhang Yu2yan, Huang Shao2xi, Zhang Shao2ling, Heng W ei. 2006. Identification of S2genotypes of pear cultivars and analysis of nucleotide se2
quence of S28 2RN ase and S30 2RN ase. Acta Horticulturae Sinica, 33 (3) : 496 - 500. ( in Chinese)
张妤艳 , 黄绍西 , 张绍铃 , 衡　伟. 2006. 京白梨等品种 S基因型鉴定及新基因 S28、S30的核苷酸序列分析. 园艺学报 , 33
(3) : 496 - 500.
003