全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (1) : 57～59
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 07 - 04 ; 修回日期 : 2001 - 09 - 10
基金项目 : 广东省自然科学基金资助项目 (950398) ; 广东省科技计划项目 (2KM03001N)
利用 RAPD 分析鉴别荔枝的焦核突变体
刘成明1 ,2 　梅曼彤2
(1 华南农业大学园艺系 , 广州 510642 ;　2 华南农业大学遗传工程研究室 , 广州 510642)
摘 　要 : 采用随机扩增多态性 DNA 方法 , 对荔枝品种三月红、怀枝和它们的 9 个自然焦核突变体进行
了多态性分析。经 500 个随机引物的筛选 , 发现仅 1 个引物OPL212 能在品种与突变体间扩增出多态性片段 ,
其中 2 个焦核怀枝的特异片段大小为 1 645 bp , 4 个焦核三月红的特异片段大小为 722 bp , 初步认为这两条
特异片段可能与荔枝的焦核基因相关。
关键词 : 荔枝 ; 焦核突变体 ; RAPD
中图分类号 : S 667. 1 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0120057203
1 　目的、材料与方法
荔枝 (Litchi chinensis Sonn. ) 的“焦核”是指授粉受精过程正常 , 但合子胚在随后的发育过程中
败育或完全退化 , 致使果实中的种子萎缩干瘪或呈空腔的现象。焦核的果实因种子变小 , 果肉增厚 ,
糖度提高 , 综合品质可大大提高。近年来 , 我们和有关单位通过大量的选种工作 , 获得了一些宝贵的
焦核突变体 , 希望通过 RAPD 分析 , 从 DNA 水平上揭示荔枝的大核品种与焦核突变体之间的差异及
表现形式 , 探讨焦核突变的遗传机理 , 为荔枝的选育种工作提供依据。
幼叶材料直接取自各焦核突变体母株及就近的原品种单株 , 突变体与对照各 9 株。9 个突变体的
名称、代号及焦核率 ( %) 为 : 花县焦核怀枝 HJ H (95. 0 ) , 中山焦核怀枝 ZJ H (90. 0 ) , 焦核三月红
9021 (67. 74 ) , 9024 (72. 73 ) , 9027 (63. 30 ) , 9028 (70. 0 ) , 9029 (81. 10 ) , 90212 (77. 42 ) , 90218
(96. 67 ) 。其中 , 焦核怀枝的焦核率为我们测定所得 , 焦核三月红的焦核率为 1990 年 5 月“广东省中
山市三月红荔枝优良单株评选”省级鉴定会现场测定的数据。据我们近几年的跟踪观测 , 各单株的焦
核率表现比较稳定。
基因组 DNA 提取基本按 SDS 方法 , 但在防褐变、DNA 回收及纯化等方面作了改进。RAPD 扩增
引物为 Operon Technologies (CA , USA) 公司的 10 碱基 RAPD 随机引物 , 共计 500 个 ( KIT A - KIT Y) 。
25μL 的反应体积中含 : 反应缓冲液 (10 ×) 2. 5μL , Mg2 + 2. 0 mmol/ L , dNTP 0. 1 mmol/ L (上海生工
公司) , Taq 酶 1. 0 U (华美生物公司) , 随机引物 0. 2μmol/ L , 模板 DNA 3μL (约含 DNA15 ng) 。反
应在 PE29600 热循环仪上进行 , 94 ℃预变性 5 min 后进入扩增循环 : 94 ℃变性 40 s , 38 ℃复性 60 s ,
72 ℃延伸 60 s , 40 个循环。循环结束后于 72 ℃延伸 600 s。反应产物经琼脂糖凝胶电泳和 EB 溶液染
色后于 Bio2Rad 凝胶成像系统扫描成像 , 用 Quantity One 4. 1. 0 软件进行 RAPD 谱带的检测分析。
2 　结果分析与讨论
2. 1 　扩增引物的筛选
以三月红、怀枝原品种中两个单株的 DNA 为模板 , 用 500 个引物进行全面的扩增筛选 , 发现其
中有 406 个能扩出 RAPD 产物 , 片段大小为 280～5820 bp (OPH162280 和 OPU0225820) 。再从这 406 个
引物中挑选出较好的 105 个重复扩增 , 选出最佳的 38 个用于焦核突变体的分析。
2. 2 　品种与突变体间及对照株之间的单态性
38 个引物中 , 37 个表现为完全的单态性 , 即品种与突变体之间没有任何差别。据统计 , 这 37 个
引物对怀枝扩增出 321 条 RAPD 带 (平均每个引物扩增 8. 68 条) , 对三月红扩增出 370 条 (平均每个
引物扩增10. 0 条) , 如此大量的位点中竟然没有一个位点的差异 , 说明品种与其突变体间的遗传背景
高度一致。另一方面 , 38 个引物对不同对照单株扩增的带型也完全相同 , 表明这些对照株没有发生
变异 , 能够代表原品种的遗传型。
2. 3 　品种与突变体之间的多态性
38 个引物中 , 只有 1 个引物 (OPL212) 在原品种与突变体之间产生了明亮清晰的多态性带 , 并且
多次扩增的结果相同。如图 1 所示 , 怀枝的两个焦核突变体都比原品种多 1 条相同的带 L1221645 ; 三
月红的 8 个焦核突变体中有 4 个 (9021 , 9024 , 9027 , 90218) 比原品种多 1 条相同的带 L122722 , 另外
的 3 个突变体 (9028 , 9029 , 90212) 则与原品种无差异。需强调指出的是 , 本研究中的焦核突变体是
在不同的地区选育所得 , 树龄都达几十年 , 它们之间既不属无性繁殖姊妹系 , 也不是无性繁殖的子母
代。考虑到 2 个多态性位点都只与引物 OPL212 有关 , 可以推测 2 个品种都是因为在很相似的序列上
发生突变而导致焦核 , 至于不同突变体与原品种之间的共性差异 , 则可能都是来自于这一段特定的
DNA 序列 , 当然 , 这种推测有待更深入的研究检验。
图 1 　用引物 OPL212 对供试材料扩增的 RAPD 谱带
Fig. 1 　RAPD patterns of cultivars and their mutants with OPL212
1 , 3 : 怀枝 Huaizhi ; 2 : 花县焦核怀枝 HJH; 4 : 中山焦核怀枝 ZJH; 5 , 7 , 9 , 11 ,
13 , 15 , 17 : 三月红 Sanyuehong ; 6 : 9021 ; 8 : 9024 ; 10 : 9027 ; 12 : 9028 ;
14 : 9029 ; 16 : 90212 ; 18 : 90218 ; M: λDNA/ EcoR Ⅰ+ Hind Ⅲ
荔枝“焦核”性状的表现比较复杂 , 目前认为它不是简单的质量性状 , 但尚缺乏资料积累〔1〕。从
品种上看 , 有些品种的焦核率比较稳定 , 而另一些品种则不甚稳定。例如 , 典型的焦核品种糯米糍、
绿荷包的焦核率既高且稳定 , 典型的大核品种怀枝、三月红的焦核率很低也很稳定 , 但一些半焦核性
的品种如妃子笑、桂味则波动较大 , 易受环境、气候甚至授粉方式 (同品种授粉或异品种授粉) 的影
响。因此 , 将焦核性状归为多基因控制性状是合乎情理的。王跃进等的研究认为 , 葡萄的无核性 (来
自无核白葡萄 , 属于假单性结实) 由多基因控制 , 而且这些基因有主效和微效之分〔2〕。本研究中 , 在
6 个突变体上发现 DNA 序列的改变 (2 个 RAPD 位点) , 但还有 3 个突变体上没有找到 DNA 的差异 ,
是否暗示还存在着其它的控制基因。另外 , 由于这 6 个突变体的焦核率都很高 , 而且远远高于原品种
(据我们测定 , 怀枝的焦核率约为 5 % , 三月红的焦核率 < 10 %) , 因此推测它们的两个变异位点很可
能分别与其内控制焦核的主效基因有关。看来虽然葡萄与荔枝分属不同的科 , 但在无核 (小核) 的分
子机制上也可能存在相似之处。
焦核突变体与原品种的遗传背景非常一致 , 按本研究结果计算 , 怀枝 —焦核怀枝间的相似系数为
99. 85 % 〔 (328 ×2) / (328 + 329)〕, 三月红 —焦核三月红间的相似系数为99. 87 % 〔 (375 ×2) /
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(375 + 376)〕, 远高于作物上的“近等基因系”, 印证了“芽变与原品种在基因型上只有微小的不
同”〔1〕的论断 , 并与现实的情况相当吻合。从形态和习性看 , 突变体与原品种间除焦核率外几乎没有
任何差别 , 很难区分。正因如此 , 苗木市场上已发生了许多以假冒真的情况 , 加剧了品种的混乱甚至
引发纠纷。过去因缺乏切实可靠的判别标准 , 很难正确处理这类纠纷。本研究从分子水平上找到了判
别的标准 , 不但能为苗木纠纷提供证据 , 而且可作为品种的登记、保护及推广利用的依据。
参考文献 :
1 　沈德绪主编. 果树育种学. 第二版. 上海 : 上海科学技术出版社 , 1986. 85 , 293～294 , 345～354
2 　王跃进 , Lamikanra Lu , 卢　江 , 等. 葡萄无核基因的 RAPD 遗传标记. 西北农业大学学报 , 1996 , 24 (5) : 1～10
Identif ication of Stenospermocarpy Mutants of Litchi by RAPD Analysis
Liu Chengming1 ,2 and Mei Mantong2
(1 Department of Horticulture South China Agricultural University , Guangzhou 510642 ;　2 Genetic Engineering Laboratory , South China
Agricultural University , Guangzhou 510642)
Abstract : For understanding the mechanism of stenospermocarpy mutation in litchi (Litchi chinensis Sonn. ) ,
RAPD analysis was conducted in this study. Huaizhi and Sanyuehong , two cultivars grown in South China , and nine
spontaneous mutants from them were used as materials. After screening 500 102mer random primers for polymor2
phism among these two cultivars and their mutants , only one prime , OPL212 , was able to generate different elec2
trophoresis pattern between Huaizhi and its two seed2abortive mutants , as well as Sanyuehong and its four seed2
abortive mutants. The size of amplified fragments specifically for seed2abortive Huaizhi mutants was 1 645 bp , and
which for seed2abortive Sanyuehong was 722 bp . The two specific amplified bands had been considered as markers
of seed2abortion genes in litchi .
Key words : Litchi ; Seed2abortive mutant ; RAPD
951 期 　　　　　　　　　　　　刘成明等 : 利用 RAPD 分析鉴别荔枝的焦核突变体