全 文 ：园 艺 学 报 2001, 28 ( 2) : 167~ 169
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2000- 10- 17; 修回日期: 2001- 01- 19
柑桔MADS盒 APETALA1同源 DNA片段克隆
林伯年 刘春铃 徐昌杰 陈大明
(浙江大学园艺系, 杭州 310029)
摘 要: 用 PCR扩增法, 从柑桔基因组分离出了 AP 1 同源基因中的一个片段。序列分析
表明, 它与其它植物的MADS 盒基因同源性较高, 氨基酸序列同源 45% ~ 73% , 但是否与发
育有关, 还需做功能性检测。
关键词: 柑桔; MADS盒基因; PCR
中图分类号: S 666; Q 785 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2001) 02016703
1 目的、材料与方法
拟南芥中的 MADS基因家族中 APETALA 1基因在花分生组织和花器官的形成过程中起
着至关重要的作用1, 2 。作者以大三岛脐橙基因组 DNA为材料, 用 PCR 扩增法克隆柑桔
APETALA 1同源 DNA片段, 为克隆全长基因和通过转基因手段缩短柑桔童期奠定基础。
DNA的提取参考文献 3 , 根据在 GenBank 中登录的一些MADS 盒基因序列设计引
物, 5! 端引物 Primer1: 5! GCAGCAGCTTGATACTACTCTA 3! , 3! 端引物 Primer2: 5!
GTTTTGCTCCTGTATTGCCTTCT 3! 。Primer1与 Primer2由上海生工生物工程有限公司合成。
PCR反应体系为 10 ∀ PCR反应缓冲液 5 L, 25 mmol/L MgCl2 4 L, 25 mmol/ L dNTP 4 L,
Primer1 ( 10 pmol/L) 1 L, Primer2 ( 10 pmol/L) 1 L, Taq DNA聚合酶 ( 4. 5 u/L) 0. 5
L, 加 ddH2O至 49 L, 模板 DNA (柑桔基因组 DNA 10 ng/L) 1 L。PCR反应的参数设
置为 94 # 预变性 5 min, 变性 40 s, 51 # 退火 60 s, 71. 5 # 延伸 90 s, 30轮循环。
目的 DNA片段的回收采用 Glassmilk 法。PCR产物纯化后直接与 pMD18T 载体连接,
连接反应体系为 PCR纯化产物 3 L, 10 ∀ T4 1igase buffer 0. 5 L, pMD18T vector 0. 5 L,
T4 DNA ligase 0. 5 L, ddH2O 0. 5 L, 12 # 连接过夜。采用 CaCl2法制备大肠杆菌感受态细
胞 (TG1) , 连接产物 3 L 转化大肠杆菌感受态细胞, 取 100 L 菌液涂布于含 Xgal 和
IPTG的筛选培养基 (含氨苄青霉素) 平板 (直径7 cm) , 37 # 培养24 h后挑取几个白色菌
落分别接种于加有Amp 50 g/ mL 的LB液体培养基中, 37 # 培养至对数生长后期。
重组质粒进一步采用 PCR法筛选, 反应体系同前。将筛选到的克隆接种于 3 mL 的LB
培养基 (含 Amp 50 g/ mL) 中, 37 # 培养至对数生长后期, 用碱法提取质粒 DNA, 重组
质粒再通过与质粒 PUC19电泳比较及 PCR反应进行鉴定。用 Pharmarcia biotech Gy5TmAuto
cycle Sequencing Kit做测序反应, 在 Pharmacia ALF express全自动测序仪上测定序列。
2 结果与分析
2. 1 扩增结果 以柑桔基因组 DNA 为模板, 按设计的反应条件进行 PCR扩增, 扩增产
物经 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检查, 在约 300 bp处有一条带, 其大小与预期值相符 (图 1)。
2. 2 扩增产物的连接转化和重组质粒分析 PCR扩增产物纯化后与 pMD18T Vector连接,
转化 TG1 后在含 Amp ( 100 g/mL) 的含
Xgal和 IPTG 的筛选培养基中随机筛选 9
个白色阳性菌落, 将可能含有插入片断的
白色菌落的裂解上清液作为模板进行 PCR
反应, 筛选出两个含有插入片段的重组菌
落。取其中一个重组菌落, 用碱法提取质
粒, 以 PUC19 质粒 DNA 作为对照, 在
1. 0%的琼脂糖凝胶中电泳进行鉴定, 证明
质粒中插入了外源DNA片段 (图 2) , 将此
质粒命名为 csAP 1。
将筛选得到的重组子 csAP 1用 Hind ∃
图 1 柑桔 AP1同源基因片段的 PCR扩增
Fig. 1 PCR amplification of a fragment of
the AP1 homologue in citrus
1. PCR product amplif ied from citrus genomic DNA,
2. DL 2 000 Marker
和EcoR%进行双酶切,酶切产物同时在 1. 0%的琼脂糖凝胶中电泳, 结果在 300 bp左右出
现条带, 长度与 PCR产物相近, 这与预期结果完全符合 (图 3)。
2. 3 csAP 1片段的序列分析 将所得克隆的重组质粒纯化后进行序列测定的结果如图 4。
图 2 重组质粒和 PUC19质粒的琼脂糖凝胶电泳
Fig. 2 Comparison of plasmid PUC19 with the
recombinant plasmid by agarose gel electrophoresi s
1. plasmid PUC19, 2. The recombinant plasmid
图 3 重组克隆的限制性酶切分析及 PCR鉴定
Fig. 3 Restriction pattern and PCR product
of the recombinant plasmid
1. The recombinant plasmid digested with Hind∃ ,
and EcoR%t ogether, 2. DL 2 000 marker,
3. PCR product of the recombinant plasmid
图 4 csAP 1克隆的核苷酸及其推导的氨基酸序列 (箭头所指为拼接位点)
Fig. 4 Nucleic acid seqence and deduced amino acid sequence of csAP1 clone
(The arrow heads above the sequence indicate the splice donor and acceptor sites)
168 园 艺 学 报 28卷
该 DNA片段已在 GenBank中登记, 登记号为 AF2639911。 csAP1基因片段编码的氨基酸序
列与一些MADS盒基因的氨基酸序列的比较如表1所示。
所克隆的 DNA片段与其它植物的 MADS盒基因氨基酸序列同源 45% ~ 73%, 同源性
较高, 但是否与发育有关, 尚需做功能性检测。
表 1 csAP1片段与一些 MADS盒基因编码的氨基酸序列比较
Table 1 Compare of amino acid sequence in a fragment of csAP1 with MADSbox genes in other plants
* : 同源性 A包括引物, 同源性 B不包括引物。
* A, incloding primer, B not incloding primer.
参考文献:
1 Mandel M A. Molecular characterization of the Arabidopsis floral homeotic gene APETALA1. Nature, 1992, 360: 273~ 277
2 Weigel D, Nilsson O. A development swith suff icient for flower init iation, in divere plants. Nature, 1995, 377: 495~ 500
3 张立平, 林伯年, 沈德绪. 葡萄属植物染色体 DNA 的提取纯化及RFLP鉴定. 果树科学, 1996, 13 (2) : 71~ 73
Cloning DNA Fragment of APETALA1 Homologue of the Citrus MADSbox
Lin Bonian, Liu Chunling, Xu Changjie, and Chen Daming
( Horticultural Department , Zhejiang University , Hangzhou 310029)
Abstract: Through PCR method, a fragment of AP1 homologue is separated from citrus gene library of DNA. This
fragment is conserved with MADSbox genes in other plants. The amino acid sequence deduced from the exons is 45% -
73% homologous to that of the corresponding regions of MADSbox genes in other plants. This fragment is appeared at
GenBank. Serial number is AF 2639911.
Key words: Citrus; MADSbox genes; PCR
1692期 林伯年等: 柑桔 MADS盒 APETALA1 同源 DNA 片段克隆