全 文 ：© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net
园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (5) : 889～891
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 12 - 14; 修回日期 : 2005 - 05 - 20
基金项目 : 国家 ‘863’项目 (2002AA244011) : 农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室资助项目
番茄抗根结线虫基因 (M i)和抗叶霉病基因 (Cf 5)的
M ultiplex2CAPS检测
王孝宣　杜永臣　朱德蔚　高建昌　国艳梅　戴善书
(中国农业科学院蔬菜花卉研究所 , 北京 100081)
摘 　要 : 建立了同时检测番茄抗根结线虫基因 (M i) 和抗叶霉病基因 (Cf 5) 的 Mutip lex2CAPS技术 ,
并利用该技术检测了 12份番茄材料含有的抗性基因。
关键词 : 番茄 ; 抗病性 ; 分子标记 ; Multip lex2CAPS; Cf 5; M i
中图分类号 : S 64112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0520889203
The M ultiplex2CAPS Ana lysis of the Nema tode Resistan t Gene M i and the
L eaf M ould Resistan t Gene Cf 5 in Toma to
W ang Xiaoxuan, Du Yongchen, Zhu Dewei, Gao J ianchang, Guo Yanmei, and Dai Shanshu
( Institu te of V egetables and Flow ers, Chinese A cadem y of A gricultura l Science, B eijing 100081, China)
Abstract: A Multip lex2CAPS technique for simultaneous identification of nematode resistant gene M i and
leaf mould resistant gene Cf 5 was developed in tomato. And genes whether contain M i and Cf 5 were identi2
fied by using this technique in 12 different tomato materials.
Key words: Tomato; D isease resistance; Molecular mark; Multip lex2CAPS; Cf 5; M i
1　目的、材料与方法
随着番茄 (L ycopersicon escu len tum ) 栽培的迅速发展 , 生产中的病虫危害问题日趋严重 , 据统
计每年因病虫害可使番茄减产 10% ～20% , 严重时可能绝收。因此聚合抗病、抗虫基因 , 培育抗
谱广 , 具持久抗性的复合抗性新品种已成为现代番茄育种的一种必然趋势。番茄不少由质量基因
控制的抗病毒 ( Tm 2, Tm 2a )、抗真菌 ( Cf 2, Cf 4, Cf 5, Cf 9, V e, Sw ) 、抗虫 (如 M i) 等基因
已经被克隆 , 并获得与之紧密连锁的分子标记 , 应用于番茄抗病、抗虫、高品质等基因的聚合育
种中。我国番茄分子育种起步较晚 , 但已取得了一些成就 , 李君明等〔1〕研究了抗病基因 ( Sw 和
M i) 的多重 PCR 鉴定。王孝宣等〔2〕将 M ultip lex2PCR 和 CAPS的优点结合起来建立了 M ultip lex2
CAPS技术。最近作者研究结果表明 , Cf 5和 M i是番茄抗叶霉病和抗根结线虫的重要基因 , 而且
与 Cf 5和 M i基因相关的 CAPS标记共享同一限制性内切酶 Taq I, 因此本研究旨在建立同时检测番
茄抗叶霉病基因 (Cf 5 ) 和抗根结线虫基因 (M i) 的 M utip lex2CAPS方法 , 为分子标记辅助抗性基
因聚合提供依据。
番茄材料为 Ont7719 (Cf 9) , Ont7717 (Cf 5) , LA2823 (M i) , LA1563 (m i) , 以及待测的 12
份材料 : 0412D7521, 0412D7522, 041237021, 041237022, 0422153, 155, 158, 194, 209, 229,
233, 234。每份材料种植 13株 , 当植株长至 8～9叶期时 , 提取幼嫩叶片中的 DNA进行分析〔3〕。
本试验所用 CAPS和 Multip lex2CAPS引物与 W illiam son等〔4〕所用的相同。引物由上海生工生物工
程公司合成。对于 M i、Cf 5以及同时加入 M i + Cf 5的 PCR反应体系均含有 : 215μL 10 ×PCR buffer
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
( Promega) , 250μmol/L dNTPs, 200 pmol/L上下游引物 , 1125 U Taq DNA聚合酶 , 50 ng模板 DNA ,
最终体积为 25μL, 其唯一的差别在于其 Mg2 +浓度分别为 115、215和 315 mmol/L。优化的 PCR循环
均为 : 先 92℃ 3 m in, 然后 40个扩增循环 (92℃ 1 m in, 54℃ 1 m in, 72℃ 2 m in) , 最后 1个加尾步
骤 72℃ 5 m in。PCR产物的检测、酶切、酶切产物的检测均同王孝宣等〔2〕的方法。
2　结果分析与讨论
211　M ultiplex2CAPS技术的建立
图 1为加入 M i引物、Cf 5引物的 PCR结果和同时加入这两个引物的 Multi2PCR结果 , M i和 Cf 5
经 PCR扩增后分别得到 1条分子量为 750 bp和分子量为 966 bp的谱带 , 同时加入引物 M i和 Cf 5经
扩增后得到两条谱带 , 这两条谱带表现为 M i和 Cf 5两引物的特征谱带的叠加 , 分子量分别为 750 bp
和 966 bp。M i的 PCR 产物经过限制性内切酶 Taq I消化后 , 在 LA1563 ( m i)、LA2823 (M i)、
Ont7719 (Cf 9) 和 Ont7717 (Cf 5) 之间表现出多态性。含有 M i基因的番茄材料 LA2823 (M i) 经酶
切后得到 2条谱带 , 其特征谱带的分子量为 500 bp, 对照番茄 LA1563 (m i) 则不能被 Taq I消化。
Ont7717 (Cf 5) 的酶切产物与对照 LA1563 (m i) 的多态性相同 , Ont7719 (Cf 9) 的酶切产物的多
态性与 M i基因相同 , 表明 Ont7719 (Cf 9) 不仅含有抗番茄叶霉病基因 Cf 9, 而且含有抗根结线虫的
基因 M i, 是较理想的双抗材料。Cf 5的 PCR产物经过限制性内切酶 Taq I消化后 , 在 LA1563 (m i)、
LA2823 (M i)、Ont7719 (Cf 9) 和 Ont7717 (Cf 5) 之间表现出多态性。Ont7717 ( Cf 5) 的 PCR产
物经 Taq I消化后得到 3条谱带 , 其特征谱带的分子量为 256 bp , 不含 Cf 5基因的材料 LA1563
(m i)、LA2823 (M i) 和 Ont7719 (Cf 9) 的酶切产物的多态性相同 , 并与对照 Cf 0 (Monoeymaker)
的多态性一致 (图片未展示 )。
图 1　引物 M i、Cf 5及 M i + Cf 5的 PCR扩增 ( a) 和用限制性内切酶 Taq I消化后的结果 ( b)
F ig. 1　The PCR am plif ied prof ile ( a) and d igestion w ith Taq I using pr im er pa irsM i, Cf 5 and both of them ( b)
1: Ont7719 (Cf 9) ; 2: Ont7717 (Cf 5) ; 3. LA2823 (M i) ; 4: LA1563 (m i)
同时加入 M i和 Cf 5两引物对的 PCR产物经 Taq I消化后其多态性在 4个材料之间完全表现为这
两个引物多态性的叠加 (图 1)。上述结果表明 , M i和 Cf 5的 CAPS标记共享同一种限制性内切酶
Taq I, 可利用 Multip lex2PCR方法扩增出各个引物的相应序列 , 经 Taq I消化后检测其多态性 , 其效果
等同于 M i和 Cf 5各自的 CAPS标记多态性的叠加 , 因此建立了同时检测 M i和 Cf 5基因的 Multip lex2
CAPS方法。
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　5期 王孝宣等 : 番茄抗根结线虫基因 (M i)和抗叶霉病基因 (Cf 5)的 Multip lex2CAPS检测 　
212　利用 M ultiplex2CAPS技术对 12份番茄材料抗性基因的鉴定
图 2为利用 Multip lex2CAPS技术对 12个番茄材料是否含有 M i和 Cf 5基因的检测结果。结果表
明 , 两个来自于 LA2823 (M i) 的单株后代 0412D7521和 0412D7522均含有 M i基因 , 但不含有 Cf 5基
因。来自于 Ont7717 (Cf 5) 的 2个单株后代 041237021和 041237022均含有 Cf 5基因 , 但不含有 M i
基因。0422153, 0422155, 0422158, 0422209, 0422229, 0422233和 0422234均含有 Cf 5基因 , 但不含
M i基因。0422194组合不含有 Cf 5基因和 M i基因。
图 2　利用 M i和 Cf 5基因的引物对 12份番茄材料的 M ultiplex2CAPS分析结果
( a) 未用 Taq I消化 ; ( b) 用 Taq I消化
F ig. 2　The M ultiplex2CAPS result of 12 toma toes by using two pr im er pa irs of M i and Cf 5 gene
( a) Undigested; ( b) Taq I2digested
1: 0412D7521; 2: 0412D7522; 3: 041237021; 4: 041237022; 5: 0422153; 6: 0155; 7: 158;
8: 194; 9: 209; 10: 229; 11: 233; 12: 234
综上所述 , 本研究建立了同时检测抗番茄根结线虫基因 M i和抗番茄叶霉病基因 Cf 5的 Multip lex2
CAPS方法 , 与单个引物对 CAPS标记相比 , 提高了分析效率 , 极大地降低了成本 , 因此可快速应用
于番茄抗根结线虫基因 M i和抗叶霉病基因 Cf 5的聚合育种中。
参考文献 :
1　李君明 , 宋　燕 , 徐和金 , 周永健 , Caranta Carole, 冯兰香. 利用 PCR技术同时鉴定番茄抗根结线虫和抗斑萎病毒基因. 园艺学
报 , 2003, 30 (6) : 678～682
L i J M, Song Y, Xu H J, Zhou Y J, Caranta C, Feng L X. Simultaneous identification ofMulti2genes with resistance respectively to root2knot
nematode and TSWV by PCR markers in tomato. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30 (6) : 678～682 ( in Chinese)
2　王孝宣 , 杜永臣 , 朱德蔚 , Luigi Monti, Grandillo S. Multip lex2CAPS技术及其在番茄遗传鉴定中的应用. 园艺学报 , 2003, 30
(6) : 673～677
W ang X X, Du Y C, Zhu D W , LuigiM, Grandillo S. The establishment ofMultip lex2CAPS technique and its app lication for genetic charac2
terization in tomato. Acta Horticulturae Sinica, 2003, 30 (6) : 673～677 ( in Chinese)
3　Fulton TM, Chunwongse J, Tanksley S D. M icrop rep p rotocol for extraction of DNA from tomato and other herbaceous p lants. PlantMolecular
B iology Reporter, 1995, 13 (3) : 207～209
4　W illiam son V M, Ho J Y, W u F F, M iller N, Kaloshian I. A PCR2based marker tightly linked to the nematode resistance gene, M i, in
tomato. Theor. App l. Genet. , 1994, 87: 757～763
198