全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 599～603
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 10 - 15; 修回日期 : 2005 - 03 - 28
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30170651) ; 高校博士学科点专项科研基金项目 (20010307012) ; 江苏省高技术项目 (BG2002310)3 通讯作者 Author for correspondence
日本梨活体花柱内花粉 RNA的降解
徐义流　张绍铃 3
(南京农业大学园艺学院 , 南京 210095)
摘 　要 : 用 32 P标记的花粉进行自花与异花授粉后 , 提取含有花粉 32 P2RNA的授粉花柱 RNA测定放射
性活度 , 并将授粉花柱 RNA样品进行非变性琼脂糖电泳。结果表明 , 授粉后 12～48 h, 自花授粉花柱 RNA
中花粉 32 P2RNA只占异花授粉花柱 RNA中的 4017% ～2513% , 自花授粉花柱中花粉完整 RNA的量特异性
地减少 , 表明自花花粉 RNA在花柱中被特异性地降解。
关键词 : 梨 ; 花柱 ; 花粉 ; RNA; 降解 ; 自交不亲和性
中图分类号 : S 66112　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420599205
D egrada tion of Pollen RNA in Japanese Pear Style in V itro
Xu Yiliu and Zhang Shaoling3
(College of Horticulture, N an jing A gricu ltura l U niversity, N an jing 210095, China)
Abstract: The RNA s were isolated from styles that were self2 and cross2pollinated with 32 P2labelled pol2
lens in vivo. Than radioactivity of pollinated style RNA was determ ined with a liquid scintillation counter,
and agarose gel electrophoresis was used to test the degradation of RNA from pollinated styles. Results were
that the content of pollen 32 P2RNA in self2pollinated style RNA is 4017% - 2513% that of pollen 32 P2RNA in
cross2pollinated style RNA after pollination 12 - 48 h, and that pollen intact RNA in self2pollinated style was
specifically decreased. This indicated that pollen RNA in self2pollinated style was specifically degraded.
Key words: Pear; Style; Pollen; RNA; Degradation; Self2incompatibility
梨 ( Pyrus) 是配子体型自交不亲和性果树 , 自花授粉后 , 花粉管在花柱内向子房方向生长过程
中受到抑制而停止生长 , 因此不能完成受精和结实过程。为了阐明梨自交不亲和性的机理 , 以往的研
究已经确定了梨自交不亲和基因 (S 基因 )〔1～3〕, 分离纯化出了花柱 S 基因的蛋白产物 —S糖蛋白 ,
鉴定了 S糖蛋白的生化特性〔4〕, 证明了 S糖蛋白具有 RNase活性而被称为 S2RNase〔5〕, 进而推测花柱
S2RNase特异地降解了自花花粉 RNA, 导致自花花粉管不能合成蛋白质而停止生长 , 表现出自交不亲
和性〔6〕。然而 , 花柱 S2RNase特异地降解自花花粉 RNA的推论 , 迄今尚缺乏实验证据。本研究在活
体条件下 , 应用 32 P标记梨花粉 , 然后进行自花与异花授粉 , 通过检测授粉花柱 RNA中 32 P2RNA的
放射性活度 , 分析自花与异花授粉后不同时间的授粉花柱 RNA的电泳图谱 , 以阐明在活体花柱中花
粉管 RNA的降解作用 , 进一步完善梨花柱 S2RNase降解花粉 RNA的理论。
1　材料与方法
111　材料
采集开花前 4 d的 ‘丰水 ’ ( Pyrus pyrifolia Nakai‘Housui’, S基因型为 S3 S5 ) 花枝 100枝、‘幸
水 ’ ( Pyrus pyrifolia Nakai‘Kousui’, S基因型为 S4 S5 ) 花枝 60枝 , 每花枝长 100 cm左右 , 用于分
离花柱和花粉 , 每处理 20枝花枝。
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
同位素 32 P购自中国原子能科学院同位素研究所 , 使用时原液比强度为 3166 mCi, 加入 300 mL
水 , 配成比强度为 010122 mCi处理液。
112　方法
11211　32 P标记的花粉分离及授粉 　将 20枝 ‘丰水 ’花枝插入 32 P处理液中用于标记花粉 , 花粉的
标记与分离方法参照徐义流等〔7〕的方法 ; 用作母本的 ‘丰水 ’和 ‘幸水 ’花枝分开插入装有自来水
的桶中 , 隔离放置 , 使其自然开花。授粉时去除已开花蕾 , 去除未开花蕾的雄蕊 , 然后用标记的
‘丰水 ’花粉 , 分别进行自花 (‘丰水 ’ב丰水 ’)授粉和异花 (‘幸水 ’ב丰水 ’)授粉。
11212　花柱样品的采集 　在授粉 0、12、24、48 h后分别采取花朵 , 剥离花瓣 , 收集切去柱头的花
柱 (0 h的花柱未去柱头 ) , 称量质量后放入液氮中保存。
11213　授粉花柱及 32 P标记花粉 RNA的提取及检测 　从液氮中取出花柱样品 , 迅速放入研钵充分研
磨 , 并注意补充液氮。将研磨好的花柱快速倒入已盛有 5 mL提取液的 25 mL离心管 , 室温下震荡 5
m in, 然后在 4℃、12 000 g条件下离心 20 m in, 取上清液入新离心管 , 弃沉淀。向上清液中分别加
1 /3体积的氯仿和水饱和酚 , 震荡 3 m in, 与上述相同条件下离心 15 m in, 取上清液 , 重复添加 1 /3
体积的氯仿和水饱和酚及离心过程 , 直至中间无蛋白层。向最后获得的上清液中加 1 /4体积的 10
moL /L L iCl, 使 L iCl的终浓度为 2 mol·L - 1 , 将溶液放在 4℃条件下沉淀过夜后在 4℃、15 000 g离心
30 m in, 获 RNA沉淀 , 用 30μL琥珀酸钠缓冲液溶解 RNA, - 70℃冷藏。用同样的方法提取 32 P标记
的 ‘丰水 ’花粉 RNA, 花粉质量为 01441 g。RNA样品质量检测与浓度测定参照奥斯伯等的方法〔7〕:
取 5μL RNA溶液 , 加灭菌水至 215 mL, 测 OD260值。RNA浓度 (μg·mL - 1 ) =OD260 ×稀释倍数 ×37
(μg·mL - 1 ) , RNA提取量 (μg ) = RNA浓度 (μg·mL - 1 ) ×V缓冲液 (mL)。
11214　授粉花柱 RNA样品放射性活度的测定及其电泳 　用液体闪烁记数器分别测定各授粉组合花柱
RNA样品 (总量 ) 的放射性活度 , 然后换算成每 015 g鲜质量花柱的放射性活度。取各授粉花柱
RNA及 ‘丰水 ’花粉 RNA样品 10μg, 进行 2%非变性琼脂糖凝胶电泳 , 分析电泳条带。
2　结果与分析
211　授粉花柱中被标记的花粉管
　　应用被标记的花粉进行异花授粉 , 48 h后分
离花柱进行放射自显影。结果表明 , 从柱头到花
柱的基部 , 活体花柱内花粉管自显影影像清晰
(图 1)。柱头花粉较多 , 放射自显影的亮度最强 ;
花柱上部花粉管数较下部多 ; 花柱中花粉管完整 ,
这些说明花粉 (花粉管壁、原生质 ) 被完全标
记。
212　授粉花柱 RNA、花粉 RNA的提取量及提取率
应用同样的方法提取各样品的总 RNA, 其提
取量和提取率如表 1所示。结果表明 , 各授粉花
图 1　授粉花柱放射自显影
1～5: ‘幸水 ’ב丰水 ’授粉后 48 h的授粉花柱。
F ig. 1　Autorad iograph of styles pollina ted by 32P2labelled pollen
1 - 5: Styles pollinated by 32P2labelled pollen for‘Kousui’בHousui’
柱样品 RNA的提取率在 (010342 ±0100088) % ～ (0103778 ±0100052) %之间 , 花粉 RNA的提取率为
(0103171 ±0100122) %。
213　授粉花柱 RNA的放射性活度
各样品的放射性活度检测的结果 (表 2) 表明 , 授粉后 0、12、24、48 h, 自花授粉花柱 RNA的
放射性活度为 85、38、32、22 cpm , 异花授粉花柱分别为 91、93、90、87 cpm。授粉花柱 RNA的放
射性活度来自于被标记的花粉 32 P2RNA , 它的数值与授粉花柱 RNA中含有 32 P2RNA的量成正相关 ,
据此 , 可以得出授粉后 0、 12、24、48 h自花授粉 32 P2RNA 占异花授粉 32 P2RNA 的比率分别为
006
　4期 徐义流等 : 日本梨活体花柱内花粉 RNA的降解 　
9314%、4017%、3516%和 2513%。
表 1　各花柱、花粉样品 RNA的提取量及提取率
Table 1　Y ield and collection ra te of RNA from styles and pollen
授粉组合
Group of pollination
授粉后时间
Hours after pollination ( h)
样品鲜样质量
FM of samp le ( g)
提取量
Yield (μg)
提取率
Rate of collection ( % )
丰水 ×丰水 Housui ×Housui 12 01479 170194 ±2104 0103569 ±0100042A
24 01564 197103 ±4110 0103493 ±0100072B
48 01451 170139 ±2136 0103778 ±0100052A
0 (未去柱头 W ith stigma) 01593 222156 ±6141 0103753 ±0100107A
幸水 ×丰水 Kousui ×Housui 12 01683 251142 ±3141 0103681 ±0100049A
24 01595 211145 ±3127 0103554 ±0100075A
48 01613 221145 ±5177 0103613 ±0100095A
0 (未去柱头 W ith stigma) 01602 205191 ±5135 0103420 ±0100088B
丰水花粉 Pollen of Housui 01441 139186 ±5140 0103171 ±0100122
　　注 : 表中数据为平均数 ±标准误 , 数据后附有的不同字母表示在α = 0101水平上差异显著。
Note: The numbers in the table show average ±standard error. D ifferent letters in columns of the table show the significance at 1% level.
表 2　授粉花柱 RNA样品的放射性活度及自花授粉 32 P2RNA
与异花授粉 32 P2RNA的比率
Table 2　Rad ioactiv ity of RNA from pollina ted style and the
percen tage of 32 P2RNA of self2pollina tion in 32 P2RNA
of cross2pollina tion
授粉组合
Group of
pollination
授粉后时间
Hours after
pollination ( h)
RNA放射性活度
Radioactivity of
style RNA ( cpm)
32 P2RNA比率 3
Percentage of
32 P2RNA ( % )
丰水 ×丰水 0 85 9314
Housui ×Housui 12 38 4017
24 32 3516
48 22 2513
幸水 ×丰水 0 91
Kousui ×Housui 12 93
24 90
48 87
　　3 : 自花授粉花柱内 32 P2RNA与异花授粉花柱内 32 P2RNA的
比值。3 : The rate of 32 P2RNA of self2pollination in 32 P2RNA of cross2
pollination.
图 2　自花不亲和与亲和授粉后花柱中 32 P2RNA的降解
1: Marker; 2～5: ‘丰水’ ב丰水’ (2: 12 h, 3: 24 h,
4: 48 h, 5: 0 h) ; 6, 7: ‘幸水’ ב丰水’ (6: 12 h,
7: 48 h) ; 8: ‘丰水’花粉 ; 9: ‘幸水’ ב丰水’ (0 h)。
F ig. 2　D egrada tion of 32 P2RNA from style pollina ted
by incom pa tible and com pa tible pollen
1: Marker; 2 - 5: Housui ×Housui (2: 12 h, 3: 24 h, 4: 48 h,
5: 0 h) ; 6, 7: Kousui ×Housui (6: 12 h, 7: 48 h) ;
8: Pollen of Housui; 9: Kousui ×Housui (0 h) .
　　即自花授粉和异花授粉后 0 h时 , 柱头上花粉 RNA含量相似 , 而授粉后 12～48 h时 , 自花授粉
花柱中花粉 32 P2RNA的含量只占异花授粉的一半以下 , 说明在自花授粉的花柱中 , 花粉的 32 P2RNA
发生了降解。
214　授粉花柱 RNA的降解
对各花柱 RNA样品进行琼脂糖电泳 , 结果表明 , 自花授粉后 12、24、48 h, 随时间的延长 , 28S
和 18S的条带逐渐变细 (图 2中 2～4) , 说明完整 RNA的量减少 , 部分 RNA被降解 , 且随授粉后时
间延长 , 被降解的 RNA的量逐渐增加 ; 而异花授粉后 12、48 h时 , 28S和 18S条带的粗细均没有变
化 (图 2中 6, 7) , RNA没有被明显降解 , 但条带出现了一些模糊、扩散现象 , 其确切原因尚不清
楚 ; 自花授粉与异花授粉后立即分离的花柱 RNA的 28S、18S的条带的粗细也均没有变化 (图 2中
5, 9) , 说明 RNA没有被明显降解。授粉过程中发生降解的 RNA不是花柱 RNA就是花粉 RNA , 但授
粉过程中花柱 RNA不会被花柱本身降解 , 再结合上述放射性活度的研究结果 , 可以推断 , 在自花授
粉花柱中被降解的 RNA应为花粉的 32 P2RNA。
3　讨论
笔者曾在室内应用 32 P溶液处理梨花枝 , 成功地标记了花粉 , 示踪了花粉管在花柱中生长的进
106
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
程〔8〕; McClure等人对烟草近花期植株饲喂 NaH2 32 PO4 溶液的结果表明 , 32 P成为了花粉 RNA的组分 ,
从而标记了花粉 RNA〔9〕。在本研究中 , 同位素处理的花枝 , 花期处于蕾期 , 花粉是在同位素处理的
过程中不断发育成熟的 , 32 P已进入花粉的各个部位。因此 , 在授粉花柱内花粉管的放射自显影影像
清晰 , 花粉管完整 , 花粉被完全标记 ; 授粉后花柱 RNA的放射性活度的变化 , 说明花粉 RNA被 32 P
标记 , 从而可以通过测定授粉花柱 RNA的放射性活度来了解花柱中花粉 RNA的降解情况。在花粉被
标记的基础上 , 影响授粉花柱样品 RNA放射性活度的因素主要有两方面 , 一是授粉花柱 RNA中含有
的 32 P2RNA是否真实地反映了花粉管 RNA的量。已有的研究表明 , 梨自交不亲和性反应主要发生在
花柱中部〔10〕, 为了消除柱头上残留的被标记的花粉物质对授粉花柱 RNA放射性活度的影响 , 在授粉
后不同时间的处理中 , 除授粉后立即分离花柱的处理 ( 0 h) 外 , 其余处理切去了授粉花柱的柱头 ,
使授粉花柱 RNA的放射性活度真实地反映了花柱中花粉 RNA的降解情况。二是授粉花柱样品 RNA
的提取率差异。本研究花柱样品 RNA的提取方法 , 是专门为提取富含 S2RNase和酚类物质的花柱而
设计的 , 具有提取率高、RNA完整性好、纯度高等优点 ; 应用这种方法提取花粉 RNA也获得了同样
的效果 (图 2)。这种方法提取率差异小 , 而自花与异花授粉花柱 RNA的放射性活度差异大 , RNA
提取率差异对自花与异花授粉花柱 RNA的放射性活度的差异性影响小。通过分析授粉花柱 RNA样品
的电泳图谱可以看出 , 虽然电泳时添加的 RNA量是相同的 , 但在自花授粉后 48 h时 , 28S和 18S
RNA量明显减少 , 并出现了条带弥散现象 , 表明部分 RNA被降解 (完整性被破坏 )。RNA被降解有
两种结果 , 一是被彻底降解。被彻底降解的花粉管 RNA在紫外比色分析时不参与形成 RNA, 在电泳
图上已没有明显的印迹 , 放射性活度变化反映的就是这部分被彻底降解的花粉管 RNA。二是完整性
被破坏。完整性被破坏的 RNA在紫外比色分析时参与形成了 RNA的浓度及放射性活度的测定结果 ,
通过放射性活度的变化不能反映这部分花粉管 RNA, 只能通过电泳图谱来说明。在电泳图中 , 完整
性被破坏的 RNA表现为不规则的 28S和 18S条带 , 这就是本研究中电泳时用相同的授粉花柱 RNA的
量 , 而电泳条带却表现出粗细差异的原因。此外 , 电泳图中反映的只是完整性被破坏的 RNA, 而被
完全降解的 RNA已检测不到 , 因此 , 实际被降解的花粉管 RNA的量比电泳图中反映的更多。通过检
测放射性活度和电泳图谱 , 可以较为准确地了解花柱中自花花粉管 RNA的降解情况。分析自花授粉
后花柱中花粉管 RNA的降解 , 还可以采用以花柱的量为检测依据、计算一定量的花柱中花粉管 RNA
量的变化的方法。本研究的放射性活度检测了各个样品 RNA的总量 , 采取了以花柱鲜样质量为依据
的分析方法。电泳分析时 , 虽然这种方法具有将彻底降解和完整性被破坏的花粉管 RNA都在电泳图
中表现出来的优点 , 但电泳时 RNA用量少 , 以花柱鲜质量为依据进行比较容易产生较大实验误差 ,
电泳图表现的情况可能不够准确 , 因此 , 没有采用这种方法。
异花授粉后 12、48 h, 花柱 RNA 28S、18S条带与授粉后立即分离的花柱 RNA的相比 , 出现了
一些模糊、扩散现象 (图 2) , 其确切原因尚不清楚 , 但笔者联系在离体条件下进行的花柱 S2RNase
降解花粉 RNA的研究结果 (尚未发表 ) 认为 , 其原因可能是在异花授粉情况下也有少部分花粉 RNA
在花柱中被降解 , 但降解的量比自花的小得多 , 不影响特异性的表达。根据已有的研究结果〔11, 12〕和
本研究中授粉花柱 RNA放射性活度的变化情况 , 可以认为 , 授粉花柱中被降解的 RNA为花粉 (管 )
RNA。为进一步明确授粉花柱中花粉 (管 ) RNA被降解的情况 , 可将琼脂糖凝胶泳带转到纤维膜上 ,
然后应用放射自显影方法 , 显示授粉花柱 RNA样品电泳图中花粉 32 P2RNA的对应条带 (自显影图 ) ,
要做到这一点 , 需大幅增加用于处理的 32 P的比强度。
本研究应用同位素标记示踪方法 , 初步证实了梨自花授粉后 , 花粉 (管 ) RNA在花柱的柱头以
下部分被特异地降解 , 不仅为梨自交不亲和性机理的学术理论提供了实验证据 , 而且为研究开花植物
自交不亲和性提供了科学有效的方法 , 研究结果与 Kao等〔6〕曾针对同为配子体型自交不亲和性的茄
科植物提出的自交不亲和性机理的理论模型及张绍铃等〔4, 10〕的研究结论一致。但在梨自交不亲和性反
应中 , 雌蕊与花粉 S基因产物是如何相互作用的 , 花柱中花粉 (管 ) RNA降解的特异性的本质是什
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　4期 徐义流等 : 日本梨活体花柱内花粉 RNA的降解 　
么 , 都还有待于进一步探讨。
参考文献 :
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