全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：233～235
Acta Horticuhurae Sinica
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茄子体细胞杂种游离小孢子培养获得再生植株
连 勇 ， 刘富中 陈钰辉 宋 燕 张松林 Darasinh Sihachakr
( 中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 法国巴黎11大学植物形态与发育实验室，法国ORSAY CEDEX
BAT．360，91405)
摘 要：应用游离小孢子培养技术，培养茄子体细胞融合杂种DSa不同株系的小孢子。结果表明：对
花药进行36℃高温6 d预处理，能显著提高小孢子脱分化能力；小孢子离体培养的最佳发育时期是单核期；
小孢子培养的适宜培养基为KM附加PEG 250 mg／L、2，4-D 0．2 mg／L、ZT 0．5 mg／L、NAA 1 mg／L及6．5％
的葡萄糖；再生植株适宜培养基为Ms附加ZT 2 mg／L、IAA 0．1 mg／L、2％蔗糖和7 g／L琼脂。
关键词：茄子；体细胞杂种；小孢子培养；植株再生
中图分类号：S 641．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)02-0233-03
Plantlet Regeneration by Isolated Microspore Culture of Somatic Hyb~d of
Eggplant
Lian Yong ，一，Liu Fuzhong ，Chen Yuhui ，Song Yan ，Zhang Songlin ，and Darasinh Sihachakr
( Institute ofVegetabales andFlowers，ChineseAcademy ofAgricultural Sciences，Beijing 100081，China； Morphogenese Vege—
tale Experimentale，Universite Paris Sud，BAT．360，91405 ORSAY CEDEX，France)
Abstract：Somatic fusion hybrid DSa(S．torvum Sw×S．melongena L．‘Dourga’)microspore were
cuhured by using isolated microspore cuhure． The result show that microspore dediferentiation ability was
markedly improved by using the treatment of anther under the high temperature conditions of 36IoC for
continuous 6 days． Th e best development period for microspore culture is monokaryotie stage；Th e suitable
medium f0r microspore culture is KM with PEG 250 mg／L，2，4一D 0．2 mg／L，ZT 0．5 mg／L，NAA 1 mg／L
and glucose 6．5％ ；Th e suitable medium for regenerated plantlet is MS with ZT 2 mg／L，IAA 0．1 mg／L，
sugar 2％ and agar 7 g／L．
Key words：Eggplant；Somatic hybrid；Isolated microspore cuhure；Plantlet regeneration
1 目的、材料与方法
应用原生质体融合技术可以将茄子近缘野生种中的抗真菌、抗细菌、抗线虫等基因转育到栽培种
中 ]¨。经原生质体融合获得体细胞杂种是四倍体 ]，需要降成二倍体才能进一步应用于育种实践。
本项研究是通过茄子游离小孢子培养，获得体细胞杂种小孢子再生植株，旨在获得双单倍体再生植
株，快速固定植物性状，获得茄子抗病育种材料。
试验于1999年和2002年分别在法国巴黎1 1大学和中国农科院蔬菜花卉研究所进行。供试材料
取自温室栽培的茄子近缘野生种和栽培种体细胞融合杂种 DSa(S．torvum Sw×S．melongena L．
‘Dourga’)的再生株系DSa-2、DSa一110和DSa一122。取镜检处于花粉母细胞、四分体、单核期小孢子
和成熟花粉细胞的花蕾，表面消毒后在无菌条件下取花药接种在MS基本培养基上，36％高温黑暗处
理6 d，然后在体视显微镜下用解剖刀剥取小孢子，抛弃全部药壁等体细胞组织。游离小孢子经计数
收稿日期：2003—09—12；修回日期：2003—12—24
基金项目：农业部蔬菜遗传与生理重点开放实验室资助项 目；国家863计划项目 (2002AA244011—1)；欧盟资助项 目
(ICA4一CT一2001—10064)
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园 艺 学 报
稀释后进行液体浅层静止培养，小孢子密度4 X 10 个／mL。以Ms、B5、KM和VKM为基本培养基，
附加不同浓度的聚乙二醇 (PEG)、2，4-D、玉米素 (ZT)、仅一萘乙酸 (NAA)、吲哚乙酸 (IAA)和
赤霉素 (GA，)等，筛选游离小孢子愈伤组织诱导培养基。以MS为基本培养基，附加不同浓度的
ZT、6一苄氨基嘌呤 (BA)、NAA及IAA，筛选诱导小孢子愈伤组织不定芽的再生培养基。再生植株
染色体倍性检测采用流式细胞计 (Flow Cytometry)和铁矾一苏木精染色法。
2 结果分析与讨论
2．1 影响小孢子脱分化的因素
在游离小孢子前对花药进行热激预处理，能显著提高小孢子脱分化能力 ，本试验得到同样的
结果。图版，1所示，对花药进行36℃高温6 d预处理后，部分小孢子开始膨大，倒置显微镜下观察
膨大小孢子较其它小孢子亮，核仁部分内含物浓密，随后的跟踪观察发现这些膨大的小孢子是原始脱
分化的小孢子。在供试的四个发育阶段的小孢子中，花粉母细胞、四分体及成熟花粉细胞没有观察到
进一步脱分化、细胞发生分裂现象，仅单核期的小孢子在离体培养中有分裂。
2．2 愈伤组织的形成
不同基本培养基、不同外源激素及其不同浓度配比试验结果表明：四倍体体细胞杂种植株小孢子
在含PEG 250 mg／L、2，4一D 0．2 mg／L、ZT 0．5 mg／L、NAA 1 mg／L、葡萄糖6．5％的KM培养基中
27℃黑暗条件下游离培养，小孢子分裂形成愈伤组织频率最高。镜检跟踪观察可见，小孢子首先体积
增大，继而内部开始分裂 (图版，2)，培养 18 d后小孢子壁破裂，愈伤组织小颗粒形成 (图版，
3)，愈伤颗粒继续分裂30 d后形成大块愈伤团 (图版，4、5)。不同株系间形成愈伤组织频率基本相
同，培养30 d计数结果表明均在20—48块／花药之间。
2．3 植株再生
将小孢子愈伤颗粒转移到含蔗糖2％、ZT 2
mg／L、I从 0．1 mg／L和琼脂7 g／L的MS再生培养
基上，(26 4-1)℃，2000 Ix光照13 h／d条件下继续
培养，60 d左右时愈伤组织上开始分化出不定芽
(图版，6)。不定芽转移至含蔗糖2％、IAA 0．1
mg／L和琼脂7 g／L的MS生根培养基上培养，形成
小孢子再生植株 (图版，7)，经检测，83％以上的
再生植株是双单倍体 (表1)。
2．4 再生植株的田间表现
表1 游离小孢孕培养再生植株倍性检测
Table1 Coi tion of懈e diploid status ofthe regenerated
plantlets by i蛐概ted mlcrospores culture
将染色体倍性检测为双单倍体的再生植株，经温室移栽驯化后定植于露地，田间表现与其四倍体
供体植株植物学性状相近，但果实、叶片等均小于其供体 (图版，8)，生长旺盛，没有病虫害发生
(抗病性有待于进一步鉴定)。由于培养的游离小孢子体是在体视显微镜下用解剖刀剥取并抛弃全部
药壁等体细胞组织，排除了药壁、花药隔层等母体组织的干扰，通过培养得到的植株都来自小孢子群
体，能快速固定植物性状，应用于茄子抗病育种材料选育。
顾淑荣 曾以七叶茄和九叶茄为材料，用液体浅层静置培养的方法培养小孢子获得了愈伤组织。
Kazumitsu 曾用小孢子培养的方法经愈伤组织得到几株小孢子再生植株，但还难以应用于育种实践。
本试验应用游离小孢子培养技术获得大量体细胞融合杂种株的小孢子再生植株，为四倍体体细胞杂种
降倍成双单倍体进而应用于育种实践提供了可行的技术方法。应说明的是，应用该培养系统，培养二
倍体栽培种的小孢子同样可以获得大量的小孢子愈伤组织，但是很难使愈伤组织分化再生植株，这
可能与小孢子倍性有关，也可能与四倍体体细胞杂种小孢子含有野生血缘有关，有待于进一步验
证。
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2期 连 勇等：茄子体细胞杂种游离小孢子培养获得再生植株 235
参考文献：
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图版说明：1．36％高温6 d预处理后部分小孢子开始膨大；2．膨大小于色于内部开始分裂；3．小孢子壁破裂后形成愈伤组织颗粒；
4．小孢子愈伤团；5．再生培养基上的愈伤组织；6 再牛的不定芽；7 再生植株；8．田问生长的DH植株。
Explanation of plates： 1． Some microspores begin t(1 enlarge afler 6 (I and 36~C high temperature treatment；2． Division in enlarged
microspores；3．The cali formation 0f microspores；4．TIle clump of callus；5．The calus in medium for regenerated plantlet；6．Regenerated
adventitious buds： 7． Regenerated plantlet：8． DH plantlet in field．
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