全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (2) : 307～309
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 06 - 17; 修回日期 : 2004 - 08 - 24
基金项目 : 教育部科学技术研究项目 (00227) ; 重庆市教委科学基金项目 (011813)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: xj@ swau1edu1cn)
M AR调控的胰岛素样生长因子 2Ⅰ转化甘蓝的研究
张应华 1, 2 　王小佳 13
(1 西南农业大学园林园艺学院 , 重庆市蔬菜学重点实验室 , 重庆 400716; 2 云南农业大学园林园艺学院 , 昆明 650201)
摘 　要 : 采用根癌农杆菌介导法 , 将表达框两翼构建了核基质结合区 (matrix attachment region, MAR)
的胰岛素样生长因子 2Ⅰ ( Insulin2like Growth Factor2Ⅰ, IGF2Ⅰ) 基因导入甘蓝中 , 在含卡那霉素的培养基
上连续 4次筛选 , 通过 10个批次的转化试验 , 获得 25株抗性植株 , PCR检测均呈阳性 , 随机选取 5株进
行基因组 Southern杂交 , 结果有 3株出现了杂交带 , 表明 IGF2Ⅰ基因已成功整合到甘蓝基因组中。
关键词 : 胰岛素样生长因子 2Ⅰ; 核基质结合区 ; 甘蓝 ; 转化
中图分类号 : S 63511　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0220307203
Tran sforma tion of Cabbage w ith In sulin2like Growth Factor2ⅠRegula ted by
M a tr ix A ttachm en t Reg ion s
Zhang Yinghua1, 2 and W ang Xiaojia13
(1 College of Horticulture and Landscape, Sou thw est A gricu ltura l U niversity, Key L ab in V egetable Research of Chongqing,
Chongqing 400716, China; 2 College of Horticu lture and Landscape, Yunnan A gricu ltura l U niversity, Kunm ing 650201, China)
Abstract: Hypocotyl exp lants of 7 day2old cabbage (B rassica oleracea L. var. capita ta L. ) seedlings
were p re2cultured on bud induction medium (MS + BA 3 mg/L + NAA 011 mg/L ) for two days. The ex2
p lants were then infected with A grobacterium tum efaciens strain EHA105 harboring a p lasm id vector containing
IGF2Ⅰ gene that flanked by matrix attachment regions (MAR s) isolated from the genome of tobacco (N icoti2
ana tabacum L. ). After two days of co2culture, the exp lants were transferred onto agrobacterium2supp ressive
medium (MS +BA 3mg/L +NAA 011 mg/L + Cb 400 mg/L) and cultivated for six days. Through four times
of kanamycin2resistant selected culture (MS +BA 3 mg/L +NAA 011 mg/L + Km 5 mg/L + Cb 400 mg/L) ,
25 resistant shoots were obtained from 10 transformation experiments with total 15 200 exp lants. Some of the
resistant regenerated p lants were tested by PCR analysis and Southern blot, which showed IGF2Ⅰ gene was
integrated into cabbage genome.
Key words: Insulin2like growth factor2Ⅰ; Matrix attachment region; Cabbage; Transformation
1　目的、材料与方法
胰岛素样生长因子 2Ⅰ ( IGF2Ⅰ) 是一种多功能细胞增殖调控因子 , 在神经损伤、糖尿病、生长
迟滞、骨质疏松等疾病的治疗中具有广阔的应用前景〔1〕。 IGF2Ⅰ主要存在于人和动物的血液中 , 但其
含量非常低 , 靠纯化天然物质 , 无法满足临床利用需要 , 通过基因工程生产 IGF2Ⅰ, 可望满足人类
治疗和保健的需求。
甘蓝 (B rassica oleracea L. var capita ta L. ) 材料为自交系 93131, 农杆菌菌株为 EHA105, 转化所
用表达载体为 pBM IGF IM , IGF2Ⅰ基因是根据甘蓝基因密码偏爱性设计的 , 并将起始密码 ATG周围序
列修饰成有利于在植物中转录和翻译的 Kozak序列。为提高转基因植株中目的基因的表达水平 , 用
PCR方法从烟草中克隆了一段 688 bp的核基质结合区 (MAR)〔2〕, 构建到表达框的两翼 , 表达载体
结构见图 1, 箭头表示 MAR以相同方向排列。
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
图 1　植物表达载体 pBM IGF IM 结构示意图
F ig. 1　D iagram of plan t expression vector
甘蓝种子用 70%乙醇消毒 30 s, 011%升汞液浸泡 10 m in, 无菌水冲洗 4次 , 播于 1 /2MS固体培
养基。切取发芽 7 d的幼苗下胚轴 , 在分化培养基 MS +BA 3 mg/L +NAA 011 mg/L上预培养 2 d, 培
养的光照强度为 3000 lx, 光照时间 16 h /d, 温度 (25 ±2) ℃ (下同 )。农杆菌在含卡那霉素 ( Km )
50 mg/L和链霉素 ( Str. ) 40 mg/L的 YEB培养基上振荡培养过夜 (28℃, 225 r/m in) , 次日用相同
培养基稀释 50倍 , 继续培养 4 h至对数生长期 , 4000 r/m in离心 5 m in收集菌体 , 然后用 MS +乙酰
丁香酮 (A s) 150 mg/L悬浮 , 侵染经预培养的外植体 3～4 m in, 无菌滤纸吸干后 , 重新接回预培养
培养基中 , 黑暗条件下共培养 2 d。将共培养后的外植体转到含羧苄青霉素 (Cb) 400 mg/L的分化
培养基上进行抑菌培养 6 d, 再转到 MS +BA 3 mg/L +NAA 011 mg/L + Km 5 mg/L + Cb 400 mg/L的
筛选培养基中培养。
用 CTAB法提取抗性植株 DNA, 未经转化植株作阴性对照 , 进行 PCR检测。Southern杂交用 ECL
核酸标记与检测试剂盒 (Amersham) 操作规程进行 , DNA提取用上海生工植物 DNA抽提试剂盒 , 每
个样品 DNA取 10～15μg, 以未转化植株作阴性对照 , H ind III单酶切 , 60 V电泳 3 h后用 B io2Rad
785型真空转膜仪转到尼龙膜上 , CL21000紫外交联仪将其固定。质粒中切下的一段包含目的基因的
片段 , 用辣根过氧化物酶标记后作探针 , 进行杂交。
2　结果分析与讨论
211　转化植株的获得
在筛选培养基上培养 20～30 d后 , 外植体开始分化出不定芽 , 绝大多数为白色 , 只有少数为正
常的绿色 (图 2) , 切下生长正常的绿色幼芽 , 转到相同选择培养基上继续进行抗性筛选 , 1周后其
大部分又慢慢白化 (图 3) , 将少数保持绿色的芽再转到筛选培养基上筛选 , 经连续 4次筛选培养后 ,
以独立抗性芽为单位 , 扩繁成无性系 , 并转入生根培养基 (MS + NAA 011 mg/L + Km 6 mg/L + Cb
250 mg/L) 中生根。转化苗经 2～3 d炼苗后 , 移栽到营养钵中。本研究共进行了 10个批次试验 , 由
于所采用的甘蓝材料对 Km太敏感 , 筛选较困难 , 转化 15 200个外植体 , 只获得了 25个抗性植株 ,
转化效率很低。
图 2　外植体上分化出的不定芽 , 绝大多数都
是非抗性的白化苗
F ig. 2　M ost of adven titious buds are non2
resistan t a lb ino ones
图 3　在 Km 5 m g /L的筛选培养基上的转化苗 (右 )
和非转化苗 (左 )
F ig. 3　Com par ison of tran sgen ic plan tlet ( r ight) and
non2tran sgen ic plan tlet ( left) on the selective
m ed ium ( con ta in ing Km 5 m g /L )
803
　2期 张应华等 : MAR调控的胰岛素样生长因子 2Ⅰ转化甘蓝的研究 　
212　转化植株的分子检测
经 PCR检测 , 25株抗性植株都能扩增出预期的目标片段 , 部分植株 PCR扩增结果见图 4。随机
选取 5株抗性植株 (不同株系 ) 进行 Southern blot分析 , 结果有 3株出现了杂交带 , 另外 2株则没有
杂交带 (图 5) , 可见 PCR检测虽然简便快速 , 但易出现假阳性 , 因此对于转基因植株的鉴定 , PCR
方法只能作为初步结果 , 尚需作进一步检测分析才能确定其是否属于转基因植株。
图 4　部分转化植株的 PCR检测
M. Marker; 1. 阳性对照 ; 2. 阴性对照 (未经转化植株 ) ;
3～7为转化植株。
F ig. 4　PCR ana lysis of partia l tran sform ed plan ts
M. Marker; 1. Positive control; 2. Negative control
( untransformed p lant) ; 3 - 7. Transformed p lants.
图 5　转基因植株的 Southern杂交检测
1. 阳性对照 (含 IGF2I的质粒片段 ) ; 2. 阴性对照
(未经转化植株 ) ; 3～7为转化植株。
F ig. 5　Southern blot ana lysis of tran sform ed plan ts
1. Positive control; 2. Negative control ( untransformed
p lant) ; 3 - 7. Transformed p lants.
　　利用转基因植物作为生产药物的反应器 , 因其上游生产较为简单 , 直接食用可以大大降低生产成
本 , 但目前存在着表达效率低下和遗传性不稳定问题 , 而且宿主植物仅局限于马铃薯、番茄和烟草等
几种常用的模式植物上〔3〕, 本试验通过偏爱密码选用及 MAR引入所构建的高效植物表达载体转化甘
蓝 , 成功获得了 IGF2Ⅰ转基因植株 , 为通过 DNA重组技术生产 IGF2Ⅰ提供了一条新的可能途径。
参考文献 :
1　徐伟文 , 吴岚晓. 胰岛素样生长因子Ⅰ的临床应用及其前景. 国外医学内分泌学分册 , 1999, 19 (6) : 270～273
Xu W W , W u L X. The clinical app lication and p rospect of insulin2like growth factor I. Foreign Medical Science Section of Endocrinology,
1999, 19 (6) : 270～273 ( in Chinese)
2　M ichalowski S M, A llen G C, Hall G E Jr, Thomp son W F, Sp iker S. Characterization of random ly2obtained matrix attachment regions
(MAR s) from higher p lants. B iochem istry, 1999, 38: 12795～12804
3　高书颖 , 郭蔼光 , 金伟波 , 范三红. 利用转基因植物生产药用蛋白研究进展. 西北植物学报 , 2003, 23 (6) : 1044～1048
Gao S Y, Guo A G, J ingW B, Fan S H. The development in studying the transgenic p lants p roducing medical p rotein. Acta Botanica Boreali2
Occidentalia Sinica, 2003, 23 (6) : 1044～1048 ( in Chinese)
新书推荐 《柑橘学 》　何天富 　主编
中华农业科教基金资助图书。全书分为 17章。分别介绍了柑橘的发展史略、柑橘遗传资
源、中国柑橘生态区划、柑橘的生物学、柑橘的代谢生理、柑橘的矿物质营养、柑橘育种、柑
橘生物技术、柑橘育苗、果园建立、柑橘园的土壤管理、柑橘对不良环境的适应性及防护技
术、柑橘病虫害、柑橘的采后处理及贮藏加工等重要内容。可作为高校师生和研究工作者的参
考教材和资料 , 供从事于柑橘生产者阅读参考。
定价 : 207. 00元 (含邮费 )。
购书者请通过邮局汇款至北京中关村南大街 12号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报 》
编辑部 , 邮编 100081。
903