全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(3)：303～308
Aeta Hortlculturae nica
甜樱桃与中国樱桃杂种的胚抢救及杂种鉴定
刘焕芳 陈学森 段成国 杨红花 冯宝春
(山东农业大学果树生物学实验室，泰安271018)
摘 要：以甜樱桃为母本，中国樱桃为父本，进行种间杂交，建立了杂种胚抢救技术体系，并对部分
杂种进行了鉴定。结果表明：(1)母本中，‘养老’坐果率最高，‘养老’在授粉4周后胚发生败育，而
‘那翁’与 ‘红灯’则是在第3周后败育；(2)最佳萌发与生长培养基为 1／2 MS+BA 2 mg／L+IAA 1 mg／
L+维生素c 10 mg／L，最佳继代增殖培养基为1／2 MS+BA 2 mg／L+IAA 1 mg／L+NAA 0．1 mg／L+维生素
c 10 mg／L，最佳生根培养基为1／2 MS+IBA 0．2 mg／L+维生素C lOmg／L；(3)S-alele specifc PCR、RAPD
及叶片形态鉴定结果证实了杂种的真实性。
关键词：樱桃；杂种；胚抢救；特异 PCR；RAPD
中图分类号：S 662．5 文献标识码：A 文章编号：0513—353X(2004)03-0303-06
Embryo Rescue and Identification of Hybrids between Sweet Cherry and
Chinese Cherry
Liu Huanfang，Chen Xuesen ，Duan Chengguo，Yang Honghua，and Feng Baochun
(Biological 6．ofPomology，Shandong Agricultural University，Taian 271018，China)
Abstract：Interspecifc hybridization was carried out with selecting sweet cherry as female parent and
Chinese cherry as male parent．Embryo rescue system of hybrids were studied and identification of them Was
also made．The results showed that：(1)seting percentage was highest when‘Ehon’was female parent；
embryo abortion happened 4 weeks after pollination in ‘Ehon’，3 weeks in ‘Napoleon’and ‘Hongdeng’；
(2)1／2 MS medium supplemented with BA 2 mg／L，IAA 1 mg／L and vitamin C 10 mg／L was the optimal
medium for germination and growth，1／2 MS medium supplemented with BA 2 mg／L，IAA 1 mg／L，NAA 0．1
mg／L and vitamin C 1 0 mg／L Was the optimal medium for multiplication，1／2 MS medium supplemented with
IBA 0．2 mg／L and vitamin C 10 mg／L was the optimal medium for rootage；(3)S-allele specifc PCR、
RAPD and leaf shape analysis showed that they were real hybrids．
Key words：Cherry；Hybrids；Embryo rescue；S-allele specifc PCR；RAPD
种属间的远缘杂交是种质创新的有效途径之一 ¨ 。杂交的不亲和性及杂种的不育性是远缘杂交
育种过程中遇到的两大障碍。关于不同核果类果树之间的杂交亲和性研究有所报道 ]，但核果类远
缘杂种胚培技术的研究甚少 。
中国樱桃和欧洲甜樱桃属于不同的种，甜樱桃多数品种自交不亲和，但果实大，品质好；中国樱
桃的显著特点是具有良好的自交亲和性及果实成熟期早。因此，将中国樱桃与甜樱桃进行杂交，从后
代中选育出自交亲和、果实大、成熟期早的新品种具有重要意义。国外虽有不少关于甜樱桃种内杂交
成功的报道 ¨“ ，但是中国樱桃与甜樱桃的种间杂交研究尚属空白。为此，本课题组在对核果类果
树远缘杂交不亲和性进行调控研究的基础上，主要研究并建立了甜樱桃与中国樱桃的种间杂种胚抢救
技术体系，包括胚萌发与生长培养、胚培苗丛芽诱导与增殖、生根培养及移栽等，并对杂种胚培苗进
收稿日期：2003—11—28；修回日期：2004—03—31
基金项目：国家自然科学基金项目 (30370992)；国家科技部农业科技成果转化基金项目 (2002208)；山东省果树三0工程项
目；山东省学科带头人专项基金项目
通讯作者 Coresponding author，E—mail：chenxs@sdau．edu．ca
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报
行了S-allele specifc PCR和RAPD早期鉴定⋯ 。现已将一批杂种胚培苗定植于大田，为进一步育种
和有关研究提供了种质材料。
1 材料与方法
1．1 杂交授粉
试验于2002～2003年在山东农业大学果树生物学实验室、泰安市司家庄果园及山东农业大学泰
安横岭果树育种基地进行。以 ‘养老’、‘那翁’及 ‘红灯’3个甜樱桃品种为母本，‘莱阳长把红樱
桃’和 ‘平度长把红樱桃’两个中国樱桃品种为父本进行杂交。采用陈学森等 ¨连被去雄法进行去
雄，人工授粉后挂牌标记，3周后统计坐果率。
1．2 胚培养
硬核期 (胚长／种长，PF值为0．6)采取果实，置4℃冰箱贮存30 d后，将以 ‘养老’为母本的
杂种从冰箱内取出，用自来水冲洗 1 h，在无菌条件下除去果肉，剥开果核 (不伤种皮)取出种子，
置于消过毒的烧杯中，先用70％酒精灭菌1 min，再用 10％次氯酸钠灭菌10 min，然后用无菌水冲洗
浸泡4～5次，最后在超净工作台上剥去种皮，将胚接人培养基中。
萌发与生长培养基的筛选：用 ‘养老’自然授粉的果实进行预备性试验，筛选合适的培养基配
方。以1／2 MS和Tukey作为基本培养基，附加不同浓度配比的植物生长调节剂组合2O个，各培养基
中均加入蔗糖35 L、琼脂粉7 L，凋pH值5．8。然后用筛选出的最佳萌发与生长培养基对杂种胚
进行培养。
继代增殖培养基的筛选：用自然授粉的 ‘养老’幼胚新梢进行预备性试验。以1／2 MS为基本培
养基，附加不同浓度配比的植物生长调节剂组合8个，各培养基中均加入蔗糖35 g／L，琼脂7 g／L，
调pH值5．8。用筛选出的最佳继代增殖培养基配方对杂种苗进行增殖培养。
生根培养基的筛选：增殖培养3个月后，将杂种苗丛芽切开，将小芽基部创面切去，接种于生根
培养基中。以1／2 MS为基本培养基，设置 IBA 0．2 mg／L+维生素c 10 mg／L及IBA 0．2 mg／L+活性
炭 (Ac)0．2％两个组合，各培养基中均加入蔗糖2O g／L，琼脂粉7 g／L，调 pH值5．8。
培养条件：光照强度2000 lx，光照时间12 h／d，温度25℃。
炼苗及移栽：有效真叶数6片以上，苗高2．5 cm，生长健壮的胚培苗经7～10 d短期炼苗后，于
10～11月分批移人上部基质为消毒过的河沙，下部基质为营养土 (河沙：土：腐熟鸡粪为 1：1：1)的
纸袋中，加强光照，改善通风，在温室内越冬，翌春定植于选种圃。
1．3 杂种鉴定
S-allele specifc PCR和RAPD鉴定：樱桃种间杂种及其父母本基因组 DNA的提取采用 CTAB法。
S-allele specifc PCR(S等位基因特异PCR)扩增反应程序及条件参照陈晓流 ¨的方法，反应体积为
25 L，弓I物 1 为 5’一CTATGGCCAAGTAATTATTCAAACC-3’， 弓I物 2 为 5’一GGATGTGGTAGGATT—
GAAGCG-3’。RAPD反应体系及条件参照吴树敬等 ¨的方法。
形态学鉴定：随机选取亲本及杂种苗各 lO片叶子，首先测量叶片纵径 (叶尖至叶基)，然后将
每个叶片沿纵轴分为11个点，由尖端开始测量每个点的横径，计算 lO片叶子同一点上横径／纵径比
的平均数，然后以距叶尖距离为横坐标，横径／纵径为纵坐标作图，进行叶形模拟分析。
2 结果与分析
2．1 不同杂交组合坐果率的差异及杂种败育发生的时期
以 ‘养老’、‘那翁’和 ‘红灯’大樱桃为母本，‘平度长把红樱桃’和 ‘莱阳长把红樱桃’为
父本，于初花期授粉，授粉3周后的坐果率统计结果表明：不同的杂交组合，坐果率差异显著。所有
杂交组合中均以 ‘养老’为母本的坐果率最高，分别为13．92％和 l7．1l％，这说明 ‘养老’与中国
维普资讯 http://www.cqvip.com
3期 刘焕芳等：甜樱桃与中国樱桃杂种的胚抢救及杂种鉴定
樱桃的杂交亲和性较高；而 ‘那翁’与中国樱桃的杂交亲和性最低，仅为1．39％和1．75％；‘红灯’
与中国樱桃杂交亲和性居中，为2．29％和4．08％，并且甜樱桃与 ‘莱阳长把红樱桃’的杂交坐果率
均高于 ‘平度长把红樱桃’。
樱桃授粉后两周内坐果率急剧下降，此时杂种胚尚未形成，因此主要原因是受精前杂交不亲和。
‘养老’与中国樱桃杂交授粉后第3周与第4周坐果率差异不大，表明其有一定程度的远缘杂交亲和
性，能够完成双受精，形成胚。而第4周后坐果率急剧下降，研究发现，第4周时杂种果实与自然授
粉果实尚无明显差异。授粉后第5周杂种胚发生败育现象，杂种果实明显变小，并陆续脱落。对脱落
的果实解剖发现杂种胚珠内无胚，胚乳呈灰白色，半透明，浆糊状。而自然授粉果实内胚乳为乳白
色，幼胚发育正常。以 ‘那翁’与 ‘红灯’为母本的杂交组合则在第3周后发生胚败育现象。
2．2 植物生长调节剂对 ‘养老’甜樱桃幼胚萌发与生长的影响
预备试验结果表明，1／2 MS优于Tukey培养基，因此，以后的试验均以1／2 MS作为基本培养
基。‘养老’樱桃自然授粉幼胚在附加不同浓度BA、IAA和GA3的1／2 MS培养基上的生长情况调查
结果见表1。
表1表明，BA浓度太低 (0．2～0．3 mg／L)，胚芽生长极为缓慢，成苗率低，且胚培苗褐化非常
严重 (4级)。同浓度的BA 2 mg／L+IAA 1 mg／L，配合不同浓度的GA，时，GA，为0．2 mg／L时胚培
苗的真叶数和苗高较0．1 mg／L时大，分别为12．25和1．58 cm，但GA 为0．1 mg／L时，成苗率最高，
为100％，均褐化严重 (3级)。同样附加IAA 1 mg／L时，BA为2 mg／L时真叶数和苗高最高，分别
为8．33和1．73，且成苗率为100％；BA为0．2 mg／L时，真叶数和苗高最小。而当BA 2 mg／L+IAA
i mg／L时，配以不同浓度的维生素C，胚培苗的生长效果更好，均好于加0．2％的活性炭 (2级)，
且加维生素C 10mg／L(O级)比5 mg／L(1级)能更好的防止褐化。故以1／2 MS+BA 2 mg／L+I从
1 mg／L+维生素C 10mg／L作为萌发与生长培养基效果最佳。将杂种幼胚接人最佳萌发与生长培养基
中，长势健壮。
表1 植物生长调节剂对 ‘养老’甜樱桃试管胚萌发与生长的影响
Table1 The efect ofplant growth regulators on germination and growth oftube embryo of ‘Elton’sweet cherry
注：真叶数=总真叶数／接种胚数。褐化等级：4．非常严重 (基部和大部分叶呈深褐色)，3．严重 (基部和部分叶呈褐色)，
2．一般 (基部呈褐色)，1．较轻 (基部呈浅褐色)，0．基本不褐化。
Note：No．of leaves=Total No．of leaves／No．of explants．Browning grades：4．Very serious(base and most of leaves are dark brown)，
3．Serious(base and some leaves are brown)，2．Common(base is brown)，1．Lig}lter(base is light brown)，0．Almost no brow．
2．3 植物生长调节剂对 ‘养老’甜樱桃试管新梢增殖系数的影响
自然授粉的 ‘养老’樱桃幼胚新梢在附加不同植物生长调节剂培养基中的增殖系数调查结果见
表2。芽的增殖和嫩梢的增长取决于细胞分裂素类与生长素类的相对比例，高浓度的BA (3 mg／L)
与高浓度的IAA(2 mg／L)增殖系数为0，嫩梢生长较差，基部愈伤化严重，芽长势不良。相同浓度
的BA(2 mg／L)与IAA(1 mg／L)组合下，NAA为0．1 mg／L时增殖系数最大，为7．67，且生长
维普资讯 http://www.cqvip.com
园 艺 学 报 31卷
量最高，试管苗生长非常健壮；NAA为0．05 mg／
L时次之，增殖系数为5．3；NAA为0．2 mg／L时
增殖系数最小 (1．2)，试管苗长势较弱。相同浓
度的 IAA(1 mg／L)与 NAA (0．1 mg／L)组合
下，BA为2 mg／L时增殖系数最大。因此最佳继
代增殖培养基为1／2 MS+BA 2 mg／L+IAA 1 mg／
L+NAA 0．1 mg／L+维生素C 10 mg／L。
将杂种试管新梢接人最佳继代增殖培养基中，
经过多次转接，丛芽 (图版，1)数最多可达39个。
2．4 不同浓度 IBA及附加物对杂种新梢生根的
影响
将 ‘养老’与 ‘平度长把红樱桃’及 ‘莱阳
长把红樱桃’杂种的试管新梢转接到以 1／2 MS
表2 植物生长调节剂对 ‘养老’甜樱桃试管新梢增殖系数的影响
Table 2 The efect of plant growth regulators on mulliplicallon
coeficient of ‘Elton’sweet cherry
注：增殖系数：总丛芽数／接种胚数
Note：Multiplication coeficient=10ta1 N0．of multiplication／No
为基本培养基的两种生根培养基中 (表3)，结果 x s·
表明，附加维生素 C的培养基生根效果明显好于加活性炭的培养基，并且在每种培养基上，‘养老’
与 ‘莱阳长把红樱桃’的杂种试管新梢生根效果均好于 ‘养老’与 ‘平度长把红樱桃’的杂种试管
新梢。将杂种苗全部转接人 1／2 MS+IBA 0．2 mg／L+维生素C 10 mg／L培养基中，生根良好。
表3 两种培养基配方对不同杂交组合杂种新梢生根的影响
Table3 Th e efect oftwo diferent culturemedia on root status ofhybrid new growth
2．5 杂种苗的大田移栽试验
生长健壮的试管苗经过7～10 d的炼苗后于
10月上、10月下、11月上、11月下旬进行田间
移栽，移栽成活率调查结果见表 4。不同移栽时
期的杂种试管苗成活率存在一定差异，10月下旬
移栽成活率最高，达 87．10％，且杂种苗生长状
况良好 (图版，2)，11月下旬移栽成活率最低，
仅为8．57％，这可能与光照不足，温度下降等生
态因子变差有关。
2．6 杂种鉴定
表4 杂种试管苗不同移栽时期的成活率
Table 4 Survivable rate of hybrid test tube seedln~ in
diferent transplant stage
2．6．1 S—alele specifc PCR及RAPD鉴定 对田间定植的杂种组培苗进行PCR检测，从 S基因型以
及RAPD鉴定上都可以明显看出所获得的远缘杂交种与父母本之间的差异 (图版，4～7)。从 ‘养
老’× ‘平度长把红樱桃’杂交种M10-5的S基因型上，可以看出杂种具备了母本一条特异带及一
条与父本相似的特异带，存在差异的原因有待于进一步研究；而 ‘养老’× ‘莱阳长把红樱桃’杂
交种 的S基因型则只继承了父本的特异带。因为RAPD标记是显性标记，对杂种鉴定可以根据有
无父本的特征带鉴定其是否杂交成功，从 RAPD鉴定结果上看 ‘养老’× ‘平度长把红樱桃’杂交
种M10—5分别具备了父本的两条及母本的一条特异带；而 ‘养老’× ‘莱阳长把红樱桃’杂交种
非常明显地主要继承了父本的多条特异带。
量
㈦
莉
】^队蒸
维普资讯 http://www.cqvip.com
3期 刘焕芳等：甜樱桃与中国樱桃杂种的胚抢救及杂种鉴定
2．6．2 杂种苗的形态学鉴定 以杂种 和其父
母本为试材，观察测量其叶形变化 (图1)，结果
表明，杂种 的叶形与父本十分相近，叶尖部与
叶片中部综合了父母本的形状，且与父本更加相
近，而靠近叶柄部位则与母本相近 (图版，3)。
^ 、 t 、 ^
j 习1
3．1 植物组织培养的褐变与调控
减轻或控制褐变发生是许多植物细胞、组织
培养研究的重要内容。在龙眼组织培养研究中发
现活性炭防止褐化效果最好 ¨，而本试验研究发现，在幼胚培养、丛芽诱导与增殖及生根培养等过程
中均有不同程度褐变发生，在培养基中加入5～10 mg／L维生素C可较好地抑制褐变，胚培苗生长健壮，
其效果明显优于活性炭。本课题组在李杏远缘杂种幼胚培养及丛芽诱导再生培养过程中，几乎不发生褐
变 (杨红花等，2003，个人通讯)，说明不同植物在组培过程中褐变程度及其调控方法差异很大。
3．2 远缘杂种的幼胚培养及其丛芽诱导与再生
植物的远缘杂交存在的障碍主要表现为：由于各种原因导致的杂交不亲和，不能实现双受精；幼
胚停止发育；幼胚中途死亡；杂种不萌发；幼苗中途天亡等。针对这些远缘杂交存在的障碍，本课题
组首次提出并实施了 “三级放大”的研究思路与研究方案，即利用静电场、激光等处理花粉及蕾期
授粉等措施克服核果类果树远缘杂交的不亲和性，提高远缘杂交的坐果率 7¨ J(一级放大)；对远缘杂
种的幼胚进行胚抢救，以获得更多的远缘杂种或基因型 (二级放大)；研究杂种胚培苗丛芽再生技术
体系，扩大每个杂种或基因型的群体，保证每个杂种胚培苗能在田间定植成活，防止因杂种胚培苗的
中途死亡而导致基因型的丢失 (三级放大)。本试验成功地建立了甜樱桃与中国樱桃种问杂种幼胚胚
抢救技术体系，分别研究并建立了幼胚萌发与生长、丛芽诱导与分化及生根的最佳培养基配方，并成
功地将一批杂种胚培苗定植于大田。如杂种 经过增殖培养最终获得32株试管苗，移栽成活21株，
保证了杂种基因型的数量，为进一步的育种提供了种质材料。研究结果表明，本课题组提出并实施的
“三级放大”研究思路与研究方案是有效的。
参考文献：
1 李玉晖，陈学森，郑 洲．果树远缘杂交育种研究进展．山东农业大学学报，2003，34(1)：139—143
2 殷家明，罗 鹏，蓝泽蘧，等．芥蓝×诸葛菜属间杂种的获得．园艺学报，1998，25(3)：297—299
3 吴定华，程玉瑾，梁树南，等．类番茄茄与番茄属间有性杂交的研究．园艺学报，2000，27(2)：117—122
4 张成敏，孙卫邦，张石宝，等．四季秋海棠与球根秋海棠远缘杂种——樱桃海棠．园艺学报，2001，28(1)：83—85
5 李 锋，张凤芬，曹希俊，等．李、杏及杂种间远缘杂交亲和性研究．吉林农业大学学报，1995，17(4)：36—39
6 马锋旺，康俊生．桃和杏杂交亲和性试验．果树科学，1996，13(4)：251～252
7 王善广，邓继光，高俊满．李杏杂交亲和性研究初报．北方果树，1991，(2)：25—27
8 曾 烨，牟蕴慧，甄灿福，等．李、杏远缘杂交种的创造及其利用研究．北方园艺，2000，(6)：22—23
9 王发林，赵秀梅，李红旭，等．李、杏属间远缘杂交及杂种胚培养技术研究．果树学报，2003，20(2)：103—106
10 Koukhartchik N V，Semenas S．Embryo culture in Prunus L．breeding．Acta Horticuhurae，2000，538：663—665
11 Balla I．Brozik S．Embryo culture of swat cherry hybrids．Acta Horticulturae，1996，410：385—386
12 Hormaza J I．Early selection in cherry combining RAPDs with embryo culture．Scientia Horticulturae，1999，79：121～126
13 陈学森，王志刚，周荣永，等．果树杂交去雄方法的研究．山东农业大学学报，1989，20(3)：2l一26
l4 陈晓流．樱桃 s基因型及自交 (不)亲和机制研究：[博士学位论文]．泰安：山东农业大学，2003．23页
l5 吴树敬，陈学森．杏品种的RAPD分析．果树学报，2003，20(2)：107—11l
l6 陈正华主编．木本植物组织培养及其应用．北京：高等教育出版社，1996．408—419
l7 李玉晖，陈学森，郑 洲．核果类果树远缘杂交试验初报．山东农业大学学报，2003，34(3)：166～170
维普资讯 http://www.cqvip.com
3I锆
目版说日：1 芽晌形成 2 种占m K状魁；3 22． Z 衅¨m；4 杂种 Nt0-5Ⅱ $ 5‘ ck s~eili~
H扩增鉴定 (M Ma r⋯ lⅢ，^ 养老 B 崖长把 樱雠 I．采种MIll-5)5 杂种 其亲丰的s— l - E R11‘
增 【M M~kerl 叫0．^ 养老 I 苯 K把 j媸桃 【． 亲"1"2-)．6 随 引物$369对杂 川Oj 苒亲 ∞扩增结粜
(M M．Irk 1)l200o A 养 ．H 胜 把 f罹 ． 杂 ~,110 51；7 随机 科 杂 Ⅱ ＆H 乖∞ 坩结皋 l M
irk r I【2I】(_0 A *把 桃．c 12-『
pI 日H0日 p 惝 ：1 m d I fbuI ：， 0 1h t⋯ Jf hlbdd field：， Imf ⋯ ⋯ hylmd r2 J
一 。 4 ’ -n ：Rt l~enla]zL 兀¨出 HlIl、 I M10 5 t M 呲 nL瑚 ．^ Elton．B nt ¨ hl州．c ¨md M10-5)．
5 J ’ PER I I n s且nd hvjⅢd12- 【M Marker DI21~O A FAlon B Laiy~gt b· }_、hrld T2)；6 {呷
im 咖 fiift~ti f．r +l_l |lJ_， uI m】d1’hnd~t10．5 《M M Du【删 ．^ 口㈨ ．B Pi r ¨_ ll、 c h~t,rid Itl-5)．
7 R ⋯ 一 r 椰 ⋯ti f— rin】 c n Jtb _lv 【{l!lM M k|_『⋯2∞【) ^ n．H l 8 g·h— c h~hdd R1
《新书推荐 《柑橘学》 何天富 主编
b⋯ 0
中华农业科教基盘断助圈 ¨ 特仆为I 7章 什圳舟纠丁坩前的发展史略 州插遗传资
源．中同柑橘牛卷I 柑橘的 物学、柑椭的代谢 理、柑俩的矿物质营养、柑橘育种 柑
儒生物技术、惜儒育苗 碾园蛙盘 柑儒园的土壤管理 儒对 良环境的适噍性投防护技
术 柑橘病虫害、柑橘的呆后处理厦贮藏 u工等重琵内存 可作为高校师生和研究工作扦的每
考教材和疑料 供 事于忏f俩生产首恻瞎参考
定价：207∞元 (寄邮费)
《葡萄学》 贺普超 主编
中华农业科教基盘舒瑚图书 藏书廿由绪论和26章 讣剐介绍J 葡萄的甘娄和种质错
源 形忐与解剖 中同葡萄栽培Ix剁、葡萄牛理、t裁品种 鬟硝、葡萄同的吐 整形修
剪 t肥水管理 抗寒· 设施拽培 葡封主要性状的遗传 加尘与寅生育种 多倍体育种
无性系选种、组织培养、病虫害 葡萄 、葡萄的 瓶噪蝌尊重盛内存 可烘高牧师生和研
究】．作者 受葡萄生产昔J埘读磬 定价：I4I oo元 (古邮蚺)
购书者请通过邮局汇敖至北京中关村南大街l2号中国农科院蔬菜花卉所 《园艺学报》
编辑部．邮编10咖 1
虿
维普资讯 http://www.cqvip.com