全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：160～164
Acta Horticuhurae Sinica
荔枝败育胚 S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩
增和序列分析
张以顺 向 旭 傅家瑞 黄上志
( 中山大学生命科学学院，广州 510275； 广东省农业科学院果树研究所，广州510640)
摘 要：从荔枝 ‘桂味’的败育胚中提取总RNA，利用GeneRacerTM Kit将 RNA经去磷酸化反应、去
mRNA的帽子结构及RNA Oligo连接，反转录合成cDNA，以eDNA为模板，分别用SSH分离得到的胚败育
相关差异表达s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的部分cDNA序列 (599 bp)设计出3’和5’端基因特异引物，
进行PCR末端扩增。荔枝败育胚的s一腺苷甲硫氨酸合成酶基因序列全长为1515 bp，编码393个氨基酸，
与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的核苷酸序列同源性在79％一82％之间，氨基酸序列同源性在
88％～91％之间。结果表明所获得的基因为与荔枝胚败育相关的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。
关键词：荔枝；败育胚；S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因
中图分类号：S 667．1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X (2004)02-0160-05
Full·-length Amplifying and Sequencing of S·-adenosylmethionine Synthetase
Gene in Litchi Aborted．embryo of ‘Guiwei’
Zhang Yishun ，Xiang Xu ，Fu Jiarui ，and Huang Shangzhi
( Life Science School，Zhongshan University，Guangzhou 510275，China； Pomology Institute，Guangdong Academy ofAgri—
culturalScience，Guangzhou 510640，China)
Abstract：TotM RNA was extracted from aborted—embryo of litchi ‘Guiwei’． Dephosphorylating RNA，
removing the mRNA cap structure and ligating the RNA Oligo to decapped mRNA with GeneRacerTM Kit and
then the first s~and of cDNA waS synthesized by reverse transcription． The 3’and 5’gene specifc primers
from diferential expressing cDNA fragments( gene)，isolated from aborted—embryo of litchi varieties of
Guiwei by SSH，was designed with Gene Tools．The full—length 3’and 5’ends of cDNA was amplified with
the first cDNA as template and two gene specifc primers or nested primers by PCR
． Complete SAM gene
sequence Was obtained by BLAST comparison of the three fragments and splicing according to the overlapping
regions．Th e sequence of the SAM synthetase gene is 1 5 1 5 bp in length with an opening reading frame
(ORF)encoding 393 amino acids．The nucleotide sequence exhibits about 79％ 一82％ overall similarity to
the corresponding gene of other organisms．and the amino acids is about 88％ 一91％ ． It Was suggested that
the obtained cDNA was a SAM gene in aborted—embryo of litchi varieties of Guiwei．
Key words：Litchi；Aborted—embryo；S-adenosylmethionine synthetase gene(SAM gene)
S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因编码S一腺苷甲硫氨酸合成酶 (E．C．2．5．1．6)，该酶催化甲硫氨酸
和ATP反应生成S一腺苷甲硫氨酸 (SAM)。在生物学上，SAM不仅是植物体内转甲基反应的甲基供
体，还是植物生长调节物质多胺和乙烯合成的前体 。¨ 。近年来，有学者在水稻、茶树等多种植物中
成功克隆了SAM合成酶基因 ，但荔枝SAM合成酶基因尚无研究报道。
我们在利用抑制消减杂交 (Suppressive subtraction hybridization，SSH)技术克隆分离荔枝 ‘桂
味’胚胎败育相关基因时，成功地克隆出SAM合成酶基因等几个差异表达基因cDNA片段，并对与
收稿日期：2003—05—22；修回日期：2003—08—11
基金项目：广东省自然科学基金资助项目 (010118)
通讯作者，E．mail：Lsshsz@zSu．ed u．cn
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2期 张以顺等：荔枝败育胚S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和 坌堑 !
SAM合成酶基因等对应的克隆进行了Virtual Northein检测 ，这一结果显示SAM合成酶基因可能与
桂味的胚胎败育有某种联系。本文报告利用cDNA末端扩增技术获得荔枝败育胚中的SAM合成酶基
因全长及序列分析结果，力求为今后荔枝胚胎败育机制的分子水平研究奠定一定基础。
1 材料与方法
供试荔枝品种 ‘桂味’取自广东省农业科学院果树研究所大丰基地荔枝园7—9年生正常挂果
树。在盛花期选择花量较大、花穗健壮的单株挂牌记录各花穗的雌花开放期，取谢花后20 d的一批
幼果，置冰壶中带回实验室，于一20~C低温冰箱保存备用。
GeneRacer Kit购自Invitrogen公司；TOPO TA cloning0 Kit购自Invitrogen公司；ExTaq DNA聚合
酶 (5 U／ L)购自Takara公司；QIAquick Gel Extraction Kit购自Qiagen公司。DNTP及3 S Total RNA
Miniprep Super Kit购自上海博彩生物科技有限公司。
荔枝胚总RNA的提取：剥取败育胚，用3 S Total RNA Miniprep Super Kit提取总RNA，具体操作
参照说明进行。提取完成后，样品RNA用紫外分光光度计及甲醛变性凝胶检测，一70~C下保存备用。
特异基因引物的设计：以通过抑制消减杂交获得的阳性差异表达克隆的插入cDNA片段 (599
bp)为已知序列，利用 Gene Tools进行引物设计。3’基因特异引物：5’1TrGGGTGCTCGG1TrGACTGA
3’，3’巢式引物：5’CCGGACGGcAAAACACAAGTGA3’；5’基因特异引物：5，CGGACGTG CCAATCGACC—
TGCAAG3’；5’巢式引物：5TGCCCCTCGT1℃ACTGACTCTG3’。
模板cDNA的合成：取5 g败育胚总RNA，加入 RNaseOut (40 U／p~L)和 CIP(10 U／p~L)，
50~C温浴 1 h，去磷酸化；吸取去磷酸化RNA (7 IxL)，加入RNaseOut (40 U／p~L)及TAP(0．5
U／p~L)，37℃温浴 1 h，去除 mRNA的帽子结构；然后加入 0．25 g lyophilized GeneRacer RNA
Oligo，65 oC温浴5 min，再加入ArP(10 mmolfL)和T4RNA连接酶 (5 U／p~L)，37~C温浴1 h，完成
RNA Oligo的连接；最后加入GeneRacer Oligo dT Primer和SuperScript II RT(200 U／p,L)，42％温
浴50 min，70~C继续温浴15 min以终止反转录反应，加入1 la,L RNase H (2U)，37~C温浴20 min，降
解未反转录的RNA。具体操作参照GeneRacerTM Kit说明书进行。
cDNA末端扩增及PCR产物克隆：3 及5’cDNA末端扩增具体参照GeneRacer Kit说明书进行，
只是退火温度和延伸温度需作适当调整：3’特异基因引物的最佳退火温度为57~C，延伸温度为66~C；
5’特异基因引物的最佳退火温度为59~C，延伸温度为68~C。3’及5cDNA巢式 PCR扩增采用触减
PCR扩增方式进行，扩增参数为：94~C预变性2 min；94~C变性30 s，63~C复性30 s，68~C延伸2 min，
12个循环；94~C变性30 s，58~C复性30 s，63~C延伸2 min，13个循环；68~C延伸10 min。割胶纯化、
PCR产物与TOPO四载体的连接和转化参照QIAquick Gel Extraction Kit和TOPO TA Cloning0 Kit说明
书进行。
克隆分析及序列测定：任意挑选3’及5’的克隆各20个，进行 LB液体培养基 (100 g／mL氨苄
青霉素)摇菌培养，同时用灭菌牙签蘸少许对应的克隆菌液放人PCR扩增体系中进行 PCR扩增。各
取 10 L PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，最后挑选与插入片段相符的3’及5’的克隆各10个，送
上海生物工程服务有限公司进行序列测定。
2 结果与分析
2．1 3’及 5’特异基因巢式引物 PCR扩增
通常情况下在最佳的退火温度及延伸温度得到的3’及5’基因特异引物的PCR扩增产物很可能就
是我们所希望的序列，但有时也可能是假象 (其它扩增产物)。因此进行3’及5’基因特异巢式引物
PCR扩增，以验证真伪。结果表明 (图1)，3’及5’基因特异巢式引物均能从各自对应的初始PCR产
物进行巢式引物PCR扩增，巢式引物PCR扩增的产物的琼脂糖凝胶电泳结果基本上与预计结果相
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符，可以肯定 3’及5’基因特异引物的PCR扩增
产物是目标基因全长的片段序列。
2．2 克隆的初步鉴定
挑选转化的白色菌株 (单个克隆)进行 PCR
扩增，结果表明，3’及 5’的各转化菌株的插入片
段一致，片段大小基本上与3’及5’特异基因引物
的PCR扩增产物相对应 (图2)，说明试验取得了
预期的结果，所得克隆是目标基因的部分片段。
2．3 克隆序列测定结果
挑选3’及5’白色克隆各10个进行序列测定，
结果显示，3’端的克隆插入片段为951 bp，5’端的
克隆插入片段为310 bp，两片段经GeneBank BLAST
图1 3’及5’特异基因巢式引物PCR扩增
1．3’基因特异性巢式引物；2．3’基因特异性引物；3．5’基
因特异性巢式引物；4．5’基因特异性引物；M．DNA marker。
Fig．1 PCR amplification of3’and 5’nested primer
1 3’specifc gene nested primer；2．3’specifc gene primer；3．5’
specifc gene nested primer；4．5’specifc gene primcr；M．DNA marker
2000 bp
250bp
100bp
图2 3’及5’的部分转化菌株 PCR产物电泳结果
1～7．3’部分转化菌株 PCR产物；8～13．5’部分转化菌株PCR产物；M．DNA marker。
Fig·2 Electrophoresis result of portion 3’and 5’transformed TOPO 10 PCR products
Lane 1—7．3’transformed TOPO 10 PCR products；La ne 8—13．5’transform ed TOPO 10 PCR products： M
． DNA marker
进行搜索比对，均与原差异表达克隆序列所对应的
S一腺苷甲BLAST进行搜索比对，均与原差异表达
克隆序列所对应硫氨酸合成酶基因的部分序列有较
高的同源性，最后将3个片段的重叠区域进行拼
接，整个目标基因全长序列为1515 bp(图3)。
2．4 全长基因序列分析
S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的完全序列和推
断的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因编码的S一腺苷
甲硫氨酸合成酶氨基酸序列表明，该基因编码
393个氨基酸，开放读码框从 ATG密码子 (70～
72碱基)开始，在 TGA密码子 (1246～1248碱
基)结束，推断的poly(A )信号序列AATAAA
发生在 1375～1380碱基之间 (图3)。该基因全
长序列经 GeneBank BLAST进行搜索比对的结果
表明，荔枝败育胚的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基
因的核苷酸序列与其它物种的S一腺苷甲硫氨酸
合成酶基因的核苷酸序列同源性在79％～82％之
间；氨基酸序列与长春花、牛奶子、芥菜、棉豆、
番茄、矮牵牛和番木瓜的SAM氨基酸的同源性分
另0为90％、91％、91％、91％、90％、90％和
表 1 荔枝败育胚的SAM 合成酶基因与其它物种
SAM合成酶基因的同源性
Table 1 The nucleotide sequence of SAM synthetase gene
in aborted embryo of litchi overal similarity
to the correspo nding gene of other organisms
基因登录号 物种 碱基同源性 同源碱基数
Accession No．Organism Identity(％)No．bp overlap
90％ (表1)，说明所获得的基因序列的确是荔枝败育胚的S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因。
巾 帅 帅
2 l 7 5 2 l ～
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2期 张以顺等：荔枝败育胚S一腺苷甲硫氨酸合成酶基因的全长扩增和序列分堑 l63
3 讨论
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1321
1381
1441
1501
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图3 SAM 基因全序列及SAM基因编码的 SAM合成酶氨基酸序列
Fig．3 Complete sequence of SAM gene and amino acid sequence of SAM synthetase by SAM gene
近年来，各国学者通过对模式植物拟南芥和其它植物胚胎发育过程中的胚胎突变体基因表达调控
的研究，已分离克隆出AGL1 1、KN1、SIN等多个与植物胚胎发育相关的基因 J，在植物胚胎发育
过程中如果这些基因发生突变或缺失会直接导致胚胎败育，但对某一个基因在植物胚胎发育过程大量
表达而引发胚胎败育的研究则未见有报道。
SAM是生物体内重要的中间代谢物，不仅是植物体内转甲基反应的甲基供体，还是植物生长调
节物质多胺和乙烯合成的前体 ¨ 。有关SAM合成酶基因调控与植物胚胎发育之间的直接证据，目前
还未见有报告，只是在动物果蝇胚的发育过程中，发现SAM合成酶突变体的幼体由于多胺生物合成
受到梗阻，导致果蝇体胚或幼体致死 J。
一 般认为，在植物体细胞胚胎发育过程中，高水平内源乙烯抑制体胚发生，高水平多胺促进体胚
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发生，二者相互制约 引¨。张风路等在对玉米籽粒发育及败育的研究中发现，玉米籽粒败育型品种在
受粉后8 h乙烯释放量明显高于正常类型，且在以后的1～2 d内维持较高水平，说明乙烯在玉米籽粒
的败育中起着重要作用⋯ 。陈伟和吕柳新的研究表明，在荔枝胚胎发育的各个时期，败育胚珠中多
胺含量均比正常发育的胚珠中的低 ¨，揭示多胺不仅与荔枝胚胎发育有关，而且很可能是导致荔枝
胚胎败育的一个重要原因。SAM作为植物生长调节物质多胺和乙烯合成的前体，说明SAM合成酶基
因对植物胚胎发育是必需的，但SAM合成酶基因荔枝败育胚中的大量表达，可能在某种程度上促进
了乙烯的生物合成，使败育胚中乙烯含量增加，最终导致了荔枝胚败育。
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