全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (4) : 684～687
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 10 - 09; 修回日期 : 2005 - 03 - 14
基金项目 : 广东省教育厅自然科学研究项目 (0153)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: jwcsm@ swnu1edu1cn)
‘石硖’龙眼大果型桂花味芽变系的 RAPD分析鉴定
肖　璇 1 　孙　敏 13 　王心燕 2 　乔爱民 2 　江　波 1
(1 西南师范大学生命科学学院 , 重庆 400715; 2 仲恺农业技术学院园艺系 , 广州 510225)
摘 　要 : 用 160个 10 bp单个和混和随机引物对 ‘石硖 ’龙眼大果型桂花味芽变母树芽变枝及普通枝
的基因组 DNA进行 RAPD扩增分析 , 从中筛选出 6个单引物 ( S71、S161、S303、S304、S341、S1212) 和
4个双引物 ( Z7、Z59、Z60、Z70) 能在二者之间扩增出稳定的多态性片段。10个引物共扩增出 99条片
段 , 其中多态性片段有 S712560、S1612813、Z702800等 13条 , 占 1311% , 表明芽变枝果实大小及风味的变
化与其遗传物质的改变密切相关。用两个特异引物 S71、Z70对来源于同一芽变枝不同树龄的芽变嫁接单株
及对照进行 RAPD扩增 , 所得特异片段与引物筛选中完全一致 , 进一步表明芽变引起的遗传物质的改变可
以通过无性繁殖的方式稳定存在 , 利用特异引物可对芽变嫁接单株的结果性状做早期预测。
关键词 : 龙眼 ; 芽变 ; RAPD
中图分类号 : S 66712　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0420684204
Iden tif ica tion of Large Fru it and Sweet O sman thus Flavour Sport from
‘Sh ix ia’L ongan Using RAPD M arker
Xiao Xuan1 , Sun M in13 , W ang Xinyan2 , Q iao A im in2 , and J iang Bo1
(1 School of L ife Science , Southw est China N orm al U niversity, Chongqing 400715, Ch ina; 2D epartm ent of Horticulture, Zhong2
ka i A grotechn ical College, Guangzhou 510225, China)
Abstract: Genetic DNA s from ‘Shixia’ longan (D im ocarpus longana Lour. ) and its sport line which
could generate larger fruits containing sweet osmanthus flavour were amp lified by RAPD with 160 10 bp single
and m ixed random p rimers to study the genetic substance change of the sport. Six single and four m ixed p rim2
ers were screened which could p roduce stable polymorphic segments between the two clones. 13 out of the total
99 fragments amp lified were distinctive including the loss of a normal segment and appearance of a new one.
The polymorphic fragments amp lified were S712560, S1612813, Z702800, etc. The difference of amp lified
DNA segments showed that the large fruit and sweet osmanthus mutant was closely related to changes of some
genetic substances in the sport line. Further studying also showed that the genotype of the sport could be inher2
ited stablely by way of asexual p ropagation. The polymorphic segments could be used to forecast the fruit char2
acters of the grafted seedlings from the sport scion.
Key words: Longan; D im ocarpus longana; Sport; RAPD
1　目的、材料与方法
‘石硖’龙眼 (D im ocarpus longana Lour. ‘Shixia’) 是广东省龙眼的主栽品种之一 , 但果实偏
小 , 多年来育种工作者试图提高龙眼的单果质量 , 但尚未有明显进展。
1985年在广东省台山市红岭种子园发现 1棵 ‘石硖 ’龙眼结果树一主枝上所结果实比普通 ‘石
硖 ’龙眼重 26% ～31% , 且具特有的桂花香味 , 历经多年的高接和小苗嫁接繁殖试验 , 发现其性状
十分稳定 , 初步认为是芽变优系。本研究以该 ‘石硖 ’龙眼芽变母树上的芽变枝及普通枝为材料 ,
　4期 肖 　璇等 : ‘石硖 ’龙眼大果型桂花味芽变系的 RAPD分析鉴定 　
提取其基因组 DNA进行 RAPD扩增分析 , 旨在将芽变与其原类型从 DNA分子水平上加以区分。
由芽变母枝 ( Y) 上随机选取 6个芽变嫁接单株 〔Y1 , Y2 (4年生 ) ; Y3 , Y4 ( 3年生 ) ; Y5 ,
Y6 (2年生 ) 〕, 其中 Y1、Y2 由 Y, Y3、Y4 由 Y1 , Y5、Y6 由 Y3 嫁接获得 , 所用砧木均为 ‘石硖 ’。
所有材料均由广东省台山市红岭种子园提供 , 2004年 3月上旬采回幼叶 , 液氮保存。
基因组 DNA的提取和纯化按张虎平等〔1〕的方法进行。设计不同的 DNA模板、Mg2 + 、 dNTP、随
机引物、Taq酶浓度梯度 , 对反应条件进行优化。所用试剂和引物均购自上海生工生物工程有限公
司。在 PE2400型 PCR仪 (美国 PE公司 ) 上进行扩增 , 反应热循环程序参照刘成明等的方法〔2〕。扩
增产物在 114%的琼脂糖凝胶上电泳分离 , EB染色 , 在紫外透射仪上观察 , 照相。具多态性的引物
重复扩增 3次。
2　结果分析与讨论
211　反应体系优化及多态性引物的筛选
在本试验使用的 PCR仪型号及扩增程序下 , 获得稳定、清晰的扩增结果反应体系为 25μL的反
应体积中含有 20 ng模板 , 110 U Taq DNA 聚合酶 , 210 mmol/L MgCl2 , 0120 mmol/L dNTP, 0120
μmol/L引物 , 1 ×buffer, 其余用双蒸水补齐。
在 80个 10 bp的单引物及 80个双引物中 , 有 90%的引物能扩增出清晰的条带 , 一般为 3～12
条片段 , 介于 200～4 000 bp之间。大多数引物在芽变枝与普通枝间的扩增产物完全相同或相似 ;
有 6个单引物及 4个双引物 (表 1) 在芽变枝和普通枝间均能扩增出 1～2条清晰、稳定的多态性
片段。
表 1　多态性随机引物的序列及扩增结果
Table 1　The sequences of the polym orph ic pr im ers and the ir am plif ica tion
引物 Primer 碱基序列
Nucleotide sequence (5pi→3pi) 扩增片段数Total fragments amp lified 区分性多态性片段Polymorphic fragments
S71 AAAGCTGCGG 9 S712560
S161 ACCTGGACAC 7 S1612813
S303 TGGCGCAGTG 7 S3032200
S304 CCGCTACCGA 12 S3042564, S3042900
S341 CCCGGCATAA 16 S34121400, S34121700
S1212 GGATCGTCGG 13 S121221160
Z7 ( S123 + S510) CCTGATCACC + CCATTCCCCA 9 Z72700
Z59 ( S426 + S433) GAGACGCACA +AGCGTCACTC 8 Z592700, Z5921000
Z60 ( S433 + S465) AGCGTCACTC + CCCCGGTAAC 11 Z6021470
Z70 ( S1315 + S1345) CCAGTCCCAA + TCGCTGCGTT 7 Z702800
由图 1可知 , 与对照 (普通枝 ) 相比 , 母树芽变枝中新产生的片段有 : S712560、 S1612813、
S34121700、Z72700、Z5921000、Z702800; 母树芽变枝中缺失的片段有 : S3032200、 S3042900、 S3042
564、S34121400、S121221160、Z592700、Z6021470。由此可见 ‘石硖 ’龙眼母树芽变枝与其对照普通
枝相比在 DNA分子的序列上发生了变化。
果树芽变大致可分为 DNA序列上的改变 (如染色体易位、基因突变等 ) 和非 DNA序列上的
改变 (如染色体数目变异、DNA甲基化等 ) , 前者可能被 RAPD标记鉴别出来。RAPD技术应用于
芽变鉴定的研究已有相关报道 , 但鉴定的难易随变异类型及程度的不同而有所差别〔3～5〕。本试验
以同一母树上的芽变枝和普通枝为材料 , 从 80个单引物及 80个双引物中分别筛选出 6个单引物
和 4个双引物在芽变品种及对照间表现出稳定的多态性 , 多态性条带达 13条 , 其引物检出率和多
态性片段数远高于其它芽变的 RAPD鉴定结果〔6〕, 表明本试验中所研究材料的芽变类型很可能属
于基因突变。
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园 　　艺 　　学 　　报 32卷
图 1　10个多态性随机引物的 RAPD扩增指纹图谱
左 : 单引物 ; 右 : 双引物。P: 对照普通枝 , Y: 芽变枝 ; M: λDNA /EcoR + H ind, 下同。
F ig. 1　The RAPD prof ile am plif ied by the 10 polym orph ic pr im ers
Left: Single p rimers; R ight: Double p rimers. P: Control; Y: Sport; M: λDNA /EcoR + H ind. The same below.
　　由图 2可知 , 由引物筛选中表现为单态性的
单引物重新两两组合而成的双引物也能在芽变枝
及其对照间扩增出稳定清晰的多态性片段。因此 ,
利用两个单引物重新组合成双引物用于扩增是弥
补引物不足和降低实验成本的可行方法。
212　普通 ‘石硖 ’与芽变的遗传相似性分析
理论上芽变和对照的遗传背景应高度一致。
本研究中计算二者间的相似系数为 86187% 〔( 43
×2) / (53 + 46) ×100% 〕, 低于刘成明等〔2〕类似
研究的结果 , 表明本研究中的芽变类型变异程度
比较大。
图 2　双引物 Z70 ( S1315 + S1345) 的 RAPD扩增
F ig. 2　The RAPD prof ile am plif ied by Z70 ( S1315 + S1345)
213　芽变的遗传稳定性
以芽变母树普通枝和芽变枝分别做阴性和阳性对照 , 选用特异引物 S71、Z70研究芽变所发生的
遗传物质的改变在嫁接繁殖中的遗传稳定性。从图 3可以看出 , 6个芽变嫁接单株 ( Y1 ～Y6 ) 的扩增
带型与母树芽变枝 (阳性对照 ) 完全一样 , 表明芽变所引起的遗传物质改变可通过无性繁殖的方式
稳定遗传。实际上 , Y1 和 Y2 单株所结果实均具 ‘大果型 ’及 ‘桂花香味 ’特征 , 表明芽变基因不
仅可通过无性繁殖的方式稳定存在 , 而且稳定表达。
图 3　引物 S71和 Z70对芽变系及普通石硖的 RAPD扩增图谱
Y1 ～Y6 : 芽变嫁接单株 ( Y1 和 Y2 : 4年生 , Y3 和 Y4 : 3年生 , Y5 和 Y6 : 2年生 )。
F ig. 3　The RAPD prof ile of sport line and its ma terna l plan t
Y1 - Y6 : Grafted p lants ( Y1 , Y2 : Four years old; Y3 , Y4 : Three years old; Y5 , Y6 : Two years old) .
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　4期 肖 　璇等 : ‘石硖 ’龙眼大果型桂花味芽变系的 RAPD分析鉴定 　
本试验结果证明芽变遗传类型可通过无性繁殖的方式稳定遗传 , 但芽变也有可能以嵌合体的方式
存在 , 即同一器官中可能同时存在芽变类型组织和原品种类型组织〔7〕, 这样芽变品种有可能恢复到
原品种类型。用 RAPD来分析芽变品种的遗传背景不受时间、生长发育时期及环境的影响 , 因此 , 可
利用特异的芽变分子标记对嫁接小苗进行早期结果性状预测以减少经济上的损失。
参考文献 :
1　张虎平 , 牛建新 , 王国安 , 虎海防 , 马兵钢. 适于核桃基因标记的 DNA提取方法. 生物技术 , 2003, 13 (5) : 18～19
Zhang H P, N iu J X, W ang G A, Hu H F, Ma B G. Op timal DNA extraction method for gene mark in walnuts. B iotechnology, 2003, 13
(5) : 18～19 ( in Chinese)
2　刘成明 , 梅曼彤. 利用 RAPD分析鉴别荔枝的焦核突变体. 园艺学报 , 2002, 29 (1) : 57～59
L iu C M, MeiM T. Identification of stenosper mocarpy mutants of litchi by RAPD analysis. Acta Horticulturae Sinica, 2002, 29 (1) : 57～
59 ( in Chinese)
3　Nybom H. DNA fingerp ints of‘Red Deliciouspiapp les. Hortscience, 1990, 25: 1641～1642
4　Ye G N, Soylemezoglu G, W eden N F. Analysis of the relationship between grapervine cultivars, sports and clones via DNA fingerp rint. V itis,
1998, 37: 33～38
5　Hong Yuyang, Hanna Schm idt. Selection of a mutant from adventitious shoot formed in X2ray treated cherry leaves and differentiation of stand2
ard and mutant with RAPD s. Euphytica, 1994, 77: 89～92
6　金勇丰 , 张耀洲 , 陈大明 , 张上隆. 桃早熟芽变品种 ‘大观一号’的 RAPD分析及特异片段的克隆. 果树科学 , 1998, 15 ( 2) :
103～106
J in Y F, Zhang Y Z, ChengD M, Zhang S L. Identication of peach early2ripeningmutant‘Daguang 1’by RAPD markers and cloning of spe2
cific fragment. Journal of Fruit Science, 1998, 15 (2) : 103～106 ( in Chinese)
7　尹永胜 , 徐增凯 , 张爱波 , 杨素珍 , 王强生. 巴厘四倍体芽变品种的选育. 中国农学通报 , 1996, 12 (5) : 22～23
Yin Y S, Xu Z K, Zhang A B, Yang S Z, W ang Q S. Study on selection and breeding of new varieties of bud mutation of‘Barlett’pear.
Chinese Agricultural Science Bulletin, 1996, 12 (5) : 22～23 ( in Chinese)
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