全 文 ：园 艺 学 报 2003，30(2)：209—211
Acta Hordculturae Sireca
樱桃砧木叶片再生系统建立及抗菌肽基因转化
王关林 夏秀英2 钟文田 方宏筠 姜明兰
( 辽宁师范大学生命科学学院，大连 116029； 大连理工大学化工学院，大连 116024； 沈阳农业大学作物学院，沈
阳 110161)
摘 要 ：以优良樱桃砧木新品系 98—1、Colt、大青叶为试材进行叶片离体再生及根癌农杆菌介导遗传转
化，建立了高频率再生系统 ，并获得抗菌肽转基因植株。诱导叶片再生的最佳培养基为 MS附加 BA 1．0—
2．0 mg／L、NAA 0．3—0．5 mg／L、GA 0．5 mg／L、AgNO3 5．0—10．0 mg／L。农杆菌及受体感受态是影响转化的
关键，延迟筛选可提高叶片中转化细胞对卡那霉素的抗性而利于再生。PCR及 Southern Blot检测为阳性，表
明抗菌肽基因已整合到樱桃砧木 98．1基因组。
关键词：樱桃；叶片；再生；抗菌肽基因；根癌农杆菌；转化
中图分类号 ：S 662．5 文献标识码 ：A 文章编号：0513．353X (2003)02-0209—03
1 目的、材料与方法
樱桃根瘤菌的危害严重[13。作者致力于樱桃叶片离体再生及遗传转化研究 ，优化再生及转化条
件，为进一步利用基因工程技术对樱桃进行抗病遗传改 良打下基础。樱桃 (Prunus pse~ asus
Lind1．)砧木98．1(中国樱桃变种)、Colt、大叶青，取自辽宁师范大学生物工程研究所实验园；菌株
A208SE的质粒 pTY}MA带有双价抗菌肽基因 CecropinB和 ShivaA，由中国农业科学院生物技术研究所
贾士荣教授提供。取无菌苗上部展开叶片，剪去叶边缘及尖端，垂直主脉剪 1 2刀，接种于5种分
化培养基 ：I．MS附加，BA 1．0 2．0 mg／L、NAA 0．3 0．5 mg／L、GA 0．5 mg／L、AsNO3 5．0
10．0 mg／L；I1．无 AgNO~，其它同I；HI．无 GA，其它同 I；Ⅳ．用 B5培养基代替 MS ，其它同 I；
V．MS分别附加BA、NAA、及 GA等单一激素，其浓度同I。每类接种 100瓶。继代培养基成分见
表 1。培养条件 25℃，光照 2 4O0 lx，光周期 12 h／d。农杆菌介导转化按文献 [2]方法进行。PCR检
测扩增引物 R1：GGTACCCTArITAACCCACAGC及 R2：CAGTGCGCAAGACGTGACG可扩增含 Sh／vaA基因
的外源片段，约0．5 kb。反应条件为95℃ 1 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，40个循环，然后
72℃延伸 10 min。转基因植株的Southern blot检测按文献 [2]进行。以质粒 pTY}MA经 EcoR I和
Hbtd I]I双酶切获得的目的基因片段为探针 ，用 [a_32p]dCTP进行标记。植物 DNA进行相同酶切。
2 结果分析与讨论
2．1 樱桃叶片直接再生不定芽
2．1．1 不同基因型叶片再生能力比较 观察
到98-1、Colt、大叶青等 3个砧木品系叶片培
养5 d后开始膨大，10 d后分化形成愈伤组
织，25 d左右出现绿色芽点，继而分化出芽。
其中98．1可在多种供试培养基 中再生，最高
频率可达 72．6％，平均再生芽数 3．6个(图 1)。
收稿日期：2OO2—03—20；修回日期：2OO2—05—21
基金项目：辽宁省攻关项目 (99208001)
图 1 砧木 96-1叶片再生不定芽
． 1 L毪l髑 of舶0t蚰0d【96-1 n群n簋啊：ed atlveatltiem buds
维普资讯 http://www.cqvip.com
2l0 园 艺 学 报 3o卷
Colt可在少数培养基中再生，最高再生频率只有 12．2％，很少分化出丛生芽，其它品系未能诱导出不
定芽。可见，不同基因型叶片再生能力差别较大，98—1再生能力最强。
2．1．2 激素等调控物质对 98—1叶片分化不定芽的影响 单独使用各种激素不能诱导叶片再生；在附
加 BA 1．0～2．0 mg／L与 NAA 0．3～0．5 ms／L的 Ms培养基中叶片再生频率及平均再生芽数较高；BA
浓度低于 1．0或高于 3．0都不能诱导叶片分化，不仅芽再生频率低，而且易玻璃化；NAA浓度达到
1．0 ms／L叶片就分化出根；附加 G 0．5 ms／L能促进不定芽伸长。
许多研究认为乙烯抑制芽的形成 ，而生物合
成抑制剂 COC12和作用部位抑制剂 A O3将有利
于芽再生L 。本研究的结果是：附加 A O35．0
～ 10．0 mg／L可以提高叶片再生频率 5％ ～10％；
而 CoC12 15～30 tnnol／L对叶片再生没有明显作
用；AgN03与 COC12配合使用与单独使用 AgNo3
差别不明显。最后确定的最佳培养基为 MS附加
BA 1．0—2．0 mg／L、 NAA 0．3～0．5 mg／L、 GA
0．5 mg／L及 AgNO35．0～10．0 mg／L。
2．1．3 继代培养基中激素对叶片再生的影响
如表 1，无 菌 苗 在 附 加 BA 1．0 mg／L、NAA
0．5 mg／L、GA 0．5 m#L的培养基中培养一代，
表 1 继代培养基对叶片再生的影响
Table 1 lBleds 0fmilmlmre m酣tI蚰 0n leaf 群n喇 蛐
Subculture medium基Regneration~蒜 No．f ． ． 芽数， 一 瑾Ia1uIlHe唧臼劬锄(L) l∞ (％)
BA Zr N从 GA BA N从 GA
注：Aa～Dd：方差分析 F>F0_0l【4，15)=4．89。
Note：Aa—Dd：Anal~s 0fvariance，F>Vo．0l[4，15]=4．89
其叶片再生频率要显著高于一直在附加 BA 0．5 n L、ZT 0．1 n L的培养基中继代培养的无菌苗，
而改变再生培养基中外源激素浓度未能获得相同效果。试验重复多次，结果相同。这表明继代培养基
中的细胞分裂素与生长素正确配合使用是十分重要的。
2．2 樱桃砧木 98．1叶片转化系统的优化
樱桃叶片对卡那霉素易产生过敏反应，进行延迟筛选，即外植体侵染共培养后转移到不含 Kan的
筛选培养基中分别培养 1～10 d，然后再转入含有 30 mg／L Kan的筛选培养基中进行有压力筛选培养，
一 个月后抗性芽统计结果表明 (表 2)，延迟筛选 3～7 d显著提高了转化率。
在筛选培养基中获得的绿色芽体 (图2)，转入附加 Kan 30 mg／L的培养基中继续筛选，有些芽体
可正常生长成为无根抗性试管苗，有些不能生长，逐渐萎蔫死亡。将 Kan抗性芽转到附加 Kan 30 mg／L
的生根培养基，两周后大部分生出健壮的不定根。当根长 1 cln时移栽，成活率达 85％以上。
表 2 延迟 筛选对 转化 的影响
1 2 lBleds 0fdday畿kdi哪 0札血锄罄f0nmti0n
延迟筛选时间 转 化 频 率
Delay seleai~ time(d) Tramton~ on frequency(％)
l
3
5
7
10
注：Aa—lM：方差分析 F>F0_0l[4，15] =4．89。
Note：Aa—Dd：aI】旧lysis variance，F>Vo 0l[4，15]=4．89
图2 9 l叶片经筛选后获得的抗性芽
． 2 l【蛐 蛐 t 曲曲 ed er 0e- 吐ng
2．3 转基因植株的 P【 和 Southern blot检测结果
挑选 21株抗性生根状态较好的转化植株，以R1和 R2为引物分别进行 PfiR检测。从图3可见，2
株转化植株具有与阳性对照相同的约 0．5 kb的特异扩增带，与 ShivaA基因的外源片段大小相符，而
非转基因对照植株中未见相应扩增带。共获得 16株 PCR阳性的转化植株。
B C 以 以
O 0 0 0
± ± ± ±
舛 仇 弘
3 2 2 0 4
啦 以 犯 n
8 3 l 7
± ± ± ±
0
5 5 5 5 5
O O O O O
3 3 8 0 3
O 0 0 l 0
5 0 0 0 5
l 3 2 3 l
5
0
5
0
l
O
5 0
0 l
C A A A B
d b a a C
0 0 0 0 0
± ± ± ± ± " 盯 ∞
0 2 2 3 l
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 王关林等：樱桃砧木叶片再生系统建立及抗菌肽基因转化 2ll
在上述 16株 PCR检测阳性的转基因植株中，随机取 6株及 2株未经 PCR检测的 Kan抗性转化植
株，分别进行 Southern blot分子检测。结果表明6株 PCR阳性植株的 Southern blot检测均阳性。图4为
其中一组检测结果 ，2株 PCR检测阳性的转基因植株有明显的基因杂交带，2株具有 Kan抗性的转化
植株中有一株有杂交带，另一株无杂交带。Southern blot检测结果表明 PCR检测是一个较可靠的方法，
而 Kan抗性只能是作为初选的条件。PCR和 Southern blot检测结果表明抗菌肽基因已整合进 98—1转化
植株基因组中。
1 2 3 4 5 6
图3 转基因植株 PCR检测结果
1． NA (EcoRI+H／ndⅢ双酶切)；2．586 bp的目的基因；
3．质粒 DNA；4．未转化植株；5，6．转化植株。
． 3 P( amCmcat~a results
1．~DNA／EcoRI+H／ndⅢ；2．586 bpmarker；
3．Plasmid；4．Non-transformed plant；5，6．Transformed plants
1 2 3 4 5 6 7
图4 转基因植株的 Southern b0It分析
1．Marker；2．质粒 DNA；3．非转基因植株；
4，5．PCR检测阳性的转基因植株 ；
6，7．具有 Kan抗性的转化植株。
． 4 Southernblot蛐 Iyds of臼锄碍窖即蠡c#ants
1．Marker；2．Plasmid；3． Non-transfonned plant；4．5．Tmnsfonned
plants；6，7．transformation plants with resistance to Kan．
本试验发现改变继代培养基可以明显影响叶片的再生，而这种影响不能靠简单改变再生培养基加
以实现。谷瑞升等[ 报道 ，细胞在脱分化形成拟分生组织过程中，需要较高水平的内源细胞分裂素和
生长素的激发和诱导，外源激素必须转变成内源激素起作用。可见，当取自无菌苗的外植体再生较困
难时，有必要尝试改变继代培养基中激素种类及配比。继代培养基对外植体再生的作用应受到重视。
参考文献：
l 方宏筠，王关林 ，王火旭，等．抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病 的转基因植株．植物学报 ，1999，41(11)：1192
l198
2 王关林，方宏筠 ．植物基因工程原理及技术．北京：科学技术出版社．1998．194 232
3 黄学林，李攸菊 ．高等植物组织离体培养的形态建成及其调控 ．北京：科学出版社，1995．150 182
4 谷瑞升，蒋湘宁，郭仲琛．植物离体培养中器官发生调控机制的研究进展．植物学通报 ，1999，16(3)：238 244
Regeneration and Antibacterial Peptide Gene Tran~orlnation of Cherry LpAlves
Wang C~lanlin ，Xia Xi n ，Zhong Wentian3
， Fang Hongjun ，and Jiang Minglan3
( Z／aoni~ normal vniv~ y，Da／An 116029，Ch／na； Dalian￡ 矗挪 of Technology，Dalian
4 University，Shenyang 110161，Ch／na)
Abstract： e leaf regeneration and Agrobacterium tumefaciens—mediated transformation system of chery
rootstock 98·1， Colt and Dagingye were established at the first time
． rI1Ie results showed that the best medium 懈
Ms supplemented with 1．0—2．0 mg／LBA，O．3一O．5 mg／LNAA，0．5 mg／LGA an d 5
．0—10．0 mg／LA#03
promoting leaf regeneration frequency． e physiological reaction of Agrobacterium tumefaciens and explant cel
were key to transformation．Delay selection could improve resistance to Kan of transformed cel in leaves and do
wel to regenemtion． results of molecular biological assays with PCR an d 8outhem blot hybridization
preliminarily indicated that the an tibacterial peptide genes had been integrated into the genome of cherry
．
Key words：Chery； ：Regeneration；Antibacterial peptide gene；Agrobacter／um tumefac／ens-mediated
transformation
维普资讯 http://www.cqvip.com