全 文 ：园 艺 学 报 2002, 29 ( 3) : 358~ 362
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期: 2001- 06- 15; 修回日期: 2001- 11- 13
基金项目: 国家教育部高等学校骨干教师资助计划项目 教技司 ( 00) 65号
* 现工作单位: 天士力集团生物技术和生物制品研究开发中心。
* * 通讯联系人, Email: chendefu@ public. tpt. tj. cn。
不同来源红 木材料的 RAPD分析及分类学探讨
李晨东1* 唐前瑞2 陈德富1* * 夏立新1 陈喜文1 陈友云2
( 1南开大学生物化学与分子生物学系, 天津 300071; 2湖南农业大学园艺系, 长沙 410128)
摘 要: 以 2 个生态型 木材料为对照, 对在各原产地收集到的 14 个红 木材料进行 55 个随机引物
的RAPD反应, 共产生 632 条稳定的扩增带, 其中 427条具有多态性。按扩增带的有无列出二元数据矩阵,
利用 NTSYSpc计算Nei氏相似系数及遗传距离, 利用 SAS 软件进行主成分分析。结果表明 : 红 木是 木
的变种, 供试的 14 个红 木材料分属 4 类, 其突变途径可能是一个复杂的过程, 存在着 木不同生态型
间、 木与红 木之间, 红 木之间的相互作用。
关键词: 红 木; RAPD; 遗传距离; 聚类分析
中图分类号: S 68 文献标识码: A 文章编号: 0513353X ( 2002) 04035805
RAPD技术是研究系统进化、分类学等问题的有效工具1~ 4 , 国内外已成功地应用 RAPD技术对
多种植物进行了亲缘关系、系统进化和品种鉴定等研究。红 木 ( Loropetalum chinense var. rubrum)
是常绿或 半落叶灌 木, 属 金缕梅科 ( Haamelidaceaem ) 金缕梅亚 科 ( Subfam H. ) 木属
( Loropetalum) , 其野生种产于湘东山区, 即罗宵山脉腹部的浏阳与醴陵相邻区域5 。由于其叶型小
巧、叶色与众不同, 具有极大的观赏价值和经济价值。目前因自然变异, 已发现许多突变类型。现在
对红 木的研究大多局限于生理、组织培养等方面, 其分类的研究也仅在生理水平得出红 木是 木
( Loropetalum chinense ) 的变种的结论10 。作者以来源于两个不同生态型的 木为对照, 采用 RAPD技
术对 14个红 木材料的遗传关系进行了研究, 探讨了红 木的突变途径和可能的起源, 旨在为红
木资源的整理、品种命名等提供相关的分子生理学基础, 也为红 木的遗传育种、遗传工程等提供一
些有益的参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试材料取自湖南农业大学园艺系园林植物资源圃 3年生扦插苗, 根据来源和形态特征收集了
14个红 木材料, 几乎包括了各产地所能收集的红 木材料。以来源不同的两个生态型 木为对照
(表 1)。
1. 2 方法
1. 2. 1 红 木总 DNA的提取 在湖南初春季节 ( 3月 1~ 7日) 收集叶片, 随机摘取 2 g 幼嫩叶片,
立即带回实验室按文献 6 方法提取总 DNA。
1. 2. 2 RAPD及其产物的检测 为了保证结果的可重复性, 每个RAPD扩增重复2次以上。扩增反应
体系为 22 L/管, 其中包括 1 !缓冲液, MgCl2 2. 5 ! 10- 6mol/ L, dNTP 0. 4 ! 10- 6mol/ L, 引物 2 ! 10- 7
mol/ L, 2 U Taq DNA聚合酶 (上海Sangon产品) 及 100 ng模板DNA。扩增反应在PTC200型热循环仪
(MJ Research Inc. ) 上进行, 研究所用的随机引物及序列见表 2。反应首先 94 ∀ 变性 5 min, 然后进行
以下 41 个循环: 94 ∀ 40 s, 37 ∀ 32 s, 72 ∀ 105 s, 最后于 72 ∀ 延伸 7 min。取 8 L 扩增产物在
1. 6% 琼脂糖凝胶中电泳, 电泳介质为 1 ! TAE 缓冲液, 电泳完毕以 0. 5 g/mL 浓度的 EB 染色
30 min, 用蒸馏水振荡洗涤凝胶 15~ 30 min, 紫外透射仪上观察照相。
表 1 不同来源的红 木材料
Table 1 The list of material s of L. chinense var. rubrum from different fountainhead areas
编 号 No. 来 源地 Fountainhead area 叶色 Leaf color 叶 形 Leaf shape
1 湖南浏阳柏加乡 Bojia country Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
2 湖南浏阳团然乡 Tuanran count ry, Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
3 湖南浏阳柏加乡 Bojia country, Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
4 湖南浏阳柏加乡 Bojia country, Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
5 湖南浏阳团然乡 Tuanran count ry, Liuyang, Hunan 紫 Purple 菱 形 Lozenge
6 湖南浏阳永和镇 Yonghe town, Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
7 湖南浏阳永和镇 Yonghe town, Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
8 湖南浏阳柏加乡 Bojia country, Liuyang, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
9 湖南长沙天心区 Tianxin district , Changsha, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
10 湖南长沙芙蓉区 Furong district , Changsha, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
11 湖南长沙苗圃 Nursery garden of Changsha, Hunan 紫红 Purple red 椭 圆 Ellipse
12 湖南浏阳郊区 Suburbs of Liuyang, Hunan 紫红 Purple red 卵 圆 Egg round
13 湖南长沙望城县 Wangcheng country, Changsha, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
14 湖南长沙天心区 Tianxin district , Changsha, Hunan 红赭 Redochre 椭 圆 Ellipse
15 (CK) 湖南桑植 Sangzhi, Hunan 绿 Green 椭 圆 Ellipse
16 (CK) 湖南浏阳永和镇 Yonghe town, Liuyang, Hunan 绿 Green 椭 圆 Ellipse
1. 2. 3 数据处理 每个材料扩增带的有无分别以 1、0代表。利用 NTSYSpc 软件的 Nei和 Li7 的方
法计算各材料间的简单相似系数F, 并转换成遗传距离 ( D= 1- F)。F= 2 ! Sab/ ( Sa+ Sb ) , 其中 Sa、
Sb代表两材料的总扩增带数, Sab为两材料共有的扩增带数。然后按NTSYSpc中的非加权算术平均数
方法 ( unweighted pair group method with arithmetic mean, UWPGA) 对 Nei相似系数进行聚类, 并利用
SAS软件进行主成分分析 ( principal components analysis, PCA)。
2 结果与分析
2. 1 DNA多态性分析
采用上海 Sangon公司合成的 116个10 mer随机引物进行 RAPD分析, 均能产生扩增带, 有 84个
随机引物的扩增带有差异, 其中 55个随机引物的扩增带清晰而稳定, 大小为 200~ 3000 bp (图 1) ,
平均每个引物的扩增带数为 11. 49条, 55个引物产生稳定的多态性扩增产物见表 2。从以上结果可以
图 1 引物 S2 (左) 和 S35 (右) 的 RAPD扩增结果
1~ 16为不同材料的编号, 详见表 1, M为 GeneRulerTM DNA Ladder Mix。
Fig. 1 The RAPD amplified profile using the primer S2 ( Left) and S35 ( right)
1- 16 is the number of materials, see table 1. M is GeneRulerTM DNA Ladder Mix.
3593 期 李晨东等: 不同来源红 木材料的 RAPD 分析及分类学探讨
看出, 55个随机引物共产生 632个扩增产物, 其中 427个具有多态性, 占 67. 6%。产生多态性结果
的随机引物的所有扩增产物都用于分析, 由于RAPD是显性标记, 所以每个扩增产物都可以看作是一
个性状, 相当于比较了 16份供试材料的 632个性状, 其中 427个性状是多态的。
表 2 产生 RAPD 多态性带的随机引物
Table 2 The li st of the used primers which amplified polymorphic bands by RAPD
引 物
Primers
序 列
Sequences
总带 数
Total bands
多态 性带
Polymorphic bands
%
S1 GTTTCGCTCC 8 5 62. 5
S2 TGATCCCTGG 8 4 50. 0
S4 GGACTGGAGT 16 13 81. 3
S6 TGCTCTGCCC 8 5 62. 5
S7 GGTGACGCAG 15 13 86. 7
S8 GTCCACACGG 18 17 94. 4
S10 CTGCTGGGAG 12 5 41. 7
S21 CAGGCCCTTC 8 4 50. 0
S23 AGTCAGCCAC 5 1 20. 0
S24 AATCGGGCTG 12 4 33. 3
S25 AGGGGTCTTG 18 8 44. 4
S26 GGTCCCTGAC 13 9 69. 2
S27 GAAACGGGTG 15 10 66. 7
S29 GGGTAACGCC 18 15 83. 3
S30 GTGATCGCAG 10 5 50. 0
S31 CAATAGAAGT 15 12 80. 0
S32 TCGGCGATAG 18 14 77. 8
S33 CAGCACCCAC 11 4 36. 4
S34 TCTGTGCTGG 14 11 78. 6
S35 TTCCGAACCC 21 16 76. 2
S36 AGCCAGCGAA 15 13 86. 7
S38 AGGTGACCGT 15 10 66. 7
S98 GGCTCATGTG 7 3 42. 9
S99 GTCAGGGCAA 7 4 57. 1
S103 AGACGTCCAC 17 9 52. 9
S111 CTTCCGCAGT 19 15 78. 9
S147 AGATGCAGCC 13 4 30. 8
S159 ACGGCGTAGT 16 15 93. 8
引 物
Primers
序 列
Sequences
总带 数
Total bands
多 态 性带
Polymorphic bands
%
S161 ACCTGGACAC 12 9 75. 0
S162 GGAGGAGAGG 8 6 75. 0
S165 TGTTCCACGG 6 5 83. 3
S166 AAGGCGGCAG 10 2 20. 0
S182 CCTCTGACTG 15 12 80. 0
S183 CAGAGGTCCC 9 4 44. 4
S186 GATACCTCGG 6 4 66. 7
S187 TCCGATGCTG 6 2 33. 3
S188 TTCAGGGTGG 6 5 83. 3
S189 TCCTGGTCCC 7 4 57. 1
S190 ACCGTTCCAG 6 3 50. 0
S202 GGAGAGACTC 10 6 60. 0
S203 TCCACTCCTG 6 3 50. 0
S208 AACGGCGACA 13 9 69. 2
S209 CACCCCTGAG 17 10 58. 8
S431 TCGCCGCAAA 12 11 91. 7
S432 CACAGACACC 9 6 66. 7
S433 AGCGTCACTC 10 7 70. 0
S434 TCGTGCGGGT 11 9 81. 8
S436 AAGCGACCTG 16 8 50. 0
S437 CATTGGGGAG 12 11 91. 7
S439 CTCCGTACTG 13 10 76. 9
S440 GGTGCTCCGT 8 5 62. 5
S1291 GACCCCGACA 14 12 85. 7
S1295 GGCAGCAGGT 5 4 80. 0
S1299 CTCGATCACC 5 4 80. 0
S1475 TGCCTGGACC 8 7 87. 5
Total 632 427 67. 6
图 2 根据 RAPD资料计算的不同材料间亲缘关系聚类图(左)与 PCA分析图(右)
1~ 16如表 1。
Fig. 2 Genetic relationship dendrogram of different materials generated from RAPD data( left) , figure based on PCA( right)
1- 16 andM indicates as in table 1.
360 园 艺 学 报 29 卷
2. 2 供试材料间的遗传关系
聚类分析结果 (图 2) 显示作为对照的红 木聚在一起, 供试的 14个红 木材料聚在一起, 说
明它们分属不同类型; 在红 木中通过聚类图又可以细分出四类: 5号为第一类, 12号为第二类, 11
号为第三类, 其他红 木材料 1~ 4、6~ 10、13和 14号为第四类。PCA 结果同样很好地显示了它们
之间的亲缘关系, 将 木和红 木以及红 木各类间区分开来。根据它们间的遗传距离 (表 3) , 我
们发现第四类红 木与湖南浏阳 木的亲缘关系较近, 而第一、三类红 木与湖南桑植 木的亲缘关
系较近, 第二类红 木与两个不同生态型 木的遗传距离相同。并且RAPD分析得到的结果与各材料
间叶片的形态差异非常吻合, 第一类红 木为紫色菱形叶片, 第二类为紫红色卵圆形叶片, 第三类为
紫红色椭圆形叶片, 第四类为红赭色椭圆形叶片。
表 3 根据 RAPD 资料计算的不同材料的遗传距离
Table 3 The genetic distance matrix of different material s based on RAPD data
编号 No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 0
2 0. 0482 0
3 0. 0373 0. 0285 0
4 0. 0548 0. 0504 0. 0482 0
5 0. 3969 0. 3794 0. 3772 0. 3991 0
6 0. 0592 0. 0548 0. 0395 0. 0614 0. 3772 0
7 0. 0504 0. 0504 0. 0351 0. 0658 0. 3860 0. 0395 0
8 0. 0724 0. 0768 0. 0702 0. 0877 0. 4035 0. 0614 0. 0658 0
9 0. 0746 0. 0658 0. 0592 0. 0855 0. 3969 0. 0636 0. 0724 0. 0461 0
10 0. 0746 0. 0614 0. 0548 0. 0680 0. 3925 0. 0636 0. 0680 0. 0855 0. 0658 0
11 0. 3377 0. 3465 0. 3311 0. 3531 0. 4452 0. 3399 0. 3355 0. 3531 0. 3553 0. 3553 0
12 0. 3706 0. 3531 0. 3596 0. 3596 0. 4123 0. 3596 0. 3596 0. 3640 0. 3662 0. 3706 0. 3706 0
13 0. 0724 0. 0680 0. 0614 0. 0746 0. 4035 0. 0658 0. 0746 0. 0746 0. 0636 0. 0680 0. 3575 0. 3684 0
14 0. 1009 0. 0921 0. 0855 0. 1031 0. 3969 0. 0855 0. 0899 0. 0943 0. 0877 0. 0921 0. 3640 0. 3882 0. 0680 0
15 0. 4518 0. 4693 0. 4539 0. 4671 0. 4846 0. 4539 0. 4539 0. 4583 0. 4693 0. 4737 0. 4430 0. 4539 0. 4671 0. 4649 0
16 0. 4211 0. 4386 0. 4320 0. 4364 0. 4934 0. 4232 0. 4189 0. 4364 0. 4474 0. 4518 0. 4518 0. 4539 0. 4452 0. 4386 0. 4123 0
注: 编号见表 1。 Note: No. see table 1.
3 讨论
3. 1 供试红 木材料的分类
本研究结果显示红 木不同材料间的遗传距离在 0. 029~ 0. 399间, 而与 木的遗传距离都在
0. 42以上, 大多在 0. 45左右。如果我们将供试材料分成两大类 (比如在遗传距离 0. 40处划分) , 则
可将 木与红 木明显分开, 结合生理上的结论5 , 我们认为红 木为 木的一个变种。若对 14个
不同来源的红 木材料再细分成 4个类型, 则可将 5号划为第一类, 12号划为第二类, 11号划为第
三类, 其它红 木材料划为第四类。其中第四类的11个材料间的遗传距离在 0. 03~ 0. 10之间, 说明
彼此间的亲缘关系十分密切, 这些红 木材料很可能来源于同一个株系, 相互之间仅存在着微小的个
体差异。
对供试材料的形态特征与分子聚类结果对比分析, 发现聚类结果与各材料叶片间的形态特征基本
吻合。14个红 木材料的叶色为红色, 木叶片为绿色, 从形态和分子水平都可以明显地将红 木
和 木分成两大类。在红 木 4类中, 第一类叶色为紫色, 第二、三类为紫红色, 第四类为红赭色。
并且第一类叶形为菱形, 其它类型都为扁圆形。第二类与第三类是各类之间遗传距离最近的 (根据表
3计算得到) , 从二者的形态上也能够得到相似的结论, 但它们之间也有一定差异, 第二类的叶形是
卵圆形, 第三类的叶形与大部分红 木相似, 为椭圆形。结合这些形态特征和我们得到的聚类结果,
3613 期 李晨东等: 不同来源红 木材料的 RAPD 分析及分类学探讨
进一步说明了 RAPD标记技术是寻找种类差异和多态性研究的有效手段。上述 RAPD分析结果可为合
理开发红木资源提供依据。
3. 2 红 木突变途径的探讨
红 木是 木的变种。第一类红 木 ( 5号) 与 木的平均遗传距离是 0. 4890, 第二类红 木
( 12号) 是 0. 4539, 第三类 ( 11号) 是 0. 4474, 第四类 (其它) 是 0. 4488。因此推测 木可能首先
突变到第三类红 木, 经过第四、第二类, 最后突变到第一类。
从遗传距离 (表 3) 中不难发现, 第四类红 木与两个不同生态型 木的遗传距离也不尽相同,
第四类红 木与 15号 木的遗传距离大于与 16号 木的遗传距离, 所以可以初步认为第四类红 木
更可能是由湖南浏阳 木突变而来。但对第一类、第三类红 木与不同生态型 木的遗传距离分析情
况则完全相反, 这两类的红 木材料都是与 16号 木的遗传距离大于与 15号 木的遗传距离, 说明
这二类的红 木更可能是由湖南桑植 木突变而来。再对第二类红 木与 15、16号 木的遗传距离
进行分析, 发现遗传距离相同。由于我们不了解浏阳 木与桑植 木之间的突变过程, 所以也就无法
对红 木原产地的问题进行探讨, 但本文结果可以初步说明红 木的突变过程不是仅由一个生态型
木单独突变而成的, 有可能是由多个生态型 木共同突变而成的。也就是说红 木的突变是一个非常
复杂的过程, 其中存在着不同生态型 木间的作用, 红 木与 木间的作用, 还有红 木之间的相互
作用。
参考文献:
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76: 5269~ 5273
RAPD Analysis and Taxology Discussion on Loropetalum chinense var. rubrum
Materials from Different Fountainhead Areas
Li Chendong1, Tang Qianrui2, Chen Defu1, Xia L ixin1, Chen Xiwen1, and Chen Youyun2
( 1Department of Biochemistry and Molecular Biology , Nankai University , Tianjin 300071, China; 2Department of Horticulture,
Hunan Agricultural University , Changsha 410128, China)
Abstract: Contrasted with 2 different Loropetalum chinense ecotypes, fourteen Lorop etalum chinense var.
rubrum materials representing almost all the types could be were analyzed by RAPD in this paper. Fiftyfive random
primers produced 632 steady amplified bands in total, among them 427 bands were polymorphic. Strong and clear
bands were scored for their presence or absence in a binary data matrix. Nei# s similarity coeff icients and genet ic
distances were calculated by NTSYSpc software, and principal components analysis was done by SAS software.
The result demonstrated that L . chinense var. rubrum is a mutant of L . chinense on molecular level and 14 L.
chinense var. rubrum materials were classified into 4 groups. The mutant pathway of 4 groups is possibly a
complicated process, including interactions between different ecotypes L . chinense , interactions between L.
chinense and L . chinense var. rubrum, and ineractions between different L . chinense var. rubrum.
Key words: Loropetalum chinense var. rubrum; RAPD; Genetic distances; Cluster analysis
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