全 文 ：园 艺 学 报 2004，31(2)：249—252
Acta Horticulturae Si 垦
一
长寿花胚性愈伤组织的诱导及胚状体再生
陈 超 王桂兰 田立民 崔瑞生
(唐山师范学院生物科学技术系，唐山063000)
摘 要：研究了长寿花胚性愈伤组织的筛选，胚状体的诱导发生、发育过程及植株再生。经过对外观
及细胞学观察，看出外观质地疏松、颗粒状的淡黄色愈伤组织细胞圆形且形状规则，是胚性愈伤组织。诱
导胚性愈伤组织的最适培养基为：Ms+2，4-D 2 mg·L +BA 0．2 mg·L～；胚状体的诱导培养基为MS+
BA 2 mg·L +NAA 0．2 mg·L +活性炭4 g·L +蔗糖30 g·L一，胚状体诱导率可达185个 ·g 胚状
体；胚状体的再生培养基为MS+蔗糖30 g·L～。利用石蜡切片对胚状体的发生过程进行了观察。
关键词：长寿花；胚性愈伤组织；胚状体；再生
中图分类号：S 68 文献标识码：A 文章编号：0513-353X(2004)02-0249-04
Embryoid Induction and Regeneration in Calus of Kalanchoe blossfeldiana
Chen Chao，Wang Guilan ，Tian Limin，and Cui Ruisheng
(Department ofBiological Science and Technology，Tangshan Teachers College，Tangshan 063000，China)
Abstract：The study aimed on the selection of embryonic callus of Kalanchoe blossbeldiana，the induc—
tion of embryoid，morphogenesis of embryoid and regeneration．Th e grain—like，light yellow and loose callus
was embryonic callus． During the inducing of embryoid，the culture mediums with diferent grouth regulator
concentration were used．Finaly the culture medium with the hi ghest of reduction frequency Was MS+BA 2
mg·L一‘+NAA 0．2 mg·L一‘+Sucrose 30 g·L。 +Active carbon 4 g·L。 (185 embryoid per gram)．
Th e regeneration medium Was MS+Sucrose 30 g·L～． Th e appearance and growing of emb ryoid were also
observed through parafin slices of calus． Th e development procedure of emb ryoid Was procel of emb ryoid，
globular stage，heart—shape stage and cotyledonary stage．
Key words：Kalanchoe blossfeldiana；Embryonic calus；Emb ryoid；Regeneration
1 目的、材料与方法
长寿花 (Kalanchoe blossfeldiana)为景天科伽蓝菜属多年生短日照多浆植物，作为盆花栽培的多
为矮生性状较强的园艺杂交品种。花有红色、粉红色、橙黄色、黄色、白色等，是优良的室内观赏花
卉，一般不结种子，靠扦插繁殖。虽有组培快繁方面的报道【1】，但未见对胚性愈伤组织、胚状体的
诱导及再生、胚状体的发生发育过程进行深入的研究报道。
本试验采用长寿花红色品种 ‘Rako’和橙黄色品种 ‘Petero’。自本校温室取植株幼叶，流水冲
洗0．5 h以上，70％酒精消毒30 S，再用0．1％升汞消毒5 min，无菌水冲洗4～5次。将叶切成1 cm
左右的小块，接种于诱导培养基上 (也可取长寿花试管苗的叶片接种)，愈伤组织长出后，将其剥离
转入继代培养基获得大量愈伤组织。挑取质地疏松、呈颗粒状的淡黄色胚性愈伤组织继代培养，再转
接到胚状体诱导培养基上，最后将诱导出的胚性愈伤组织接种到再生培养基上。以上各种培养基中均
加入蔗糖30 g·L～，琼脂6 g·L～，pH 5．8。培养温度 (25±2)oC，光照2 000 lx，14 h·d～。
挑取各种愈伤组织制成压片，用Motic数码显微镜进行观察照相。挑选带有各阶段胚状体的胚性
愈伤组织，用卡诺固定液固定，常规石蜡制片法切片，厚度 8 pin，番红染色，用Nikon LABPHOTO
收稿日期：2003—06—23；修回Et期：2003—10—08
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园 艺 学 报 3l卷
Ⅱ型显微镜进行观察照相。
2 结果与分析
2．1 胚性愈伤组织的诱导及细胞学观察
愈伤组织诱导以Ms作为基本培养基，先后添加 1、2、3、4 mg‘L～2，4一D，2 mg。L～2，4一D+
0．1 mg．L一 BA，2 mg·L一 2，4一D+0．2 mg·L BA，2 mg·L一 2，4一D +0．3 mg·L一 BA等，经对
愈伤组织的诱导速度、诱导率及生长速度等几个方面的比较，认为培养基MS+2 mg。L。。2，4一D+0．2
mg．L BA效果最好。外植体接种15 d，膨胀变厚，边缘出现白色绒状物质，随后愈伤组织在切口
附近出现，随时间的延长叶片的厚度可达到原来的2～3倍 (见图版，1)，这一现象可能是长寿花叶
表皮较厚，叶内部产生的愈伤难于突破表皮所致。如在接种时将叶片剖开，有助于解决这一问题。诱
导出的愈伤组织在外观上可分为淡黄色、黄褐色、黄绿色、暗黄表面带黑、白色等几种。细胞学观察
结果显示，淡黄色愈伤组织细胞呈圆形且形状规则，可正常分化 (见图版，2)，此种愈伤组织即为
胚性愈伤组织。长寿花两个品种诱导出的愈伤组织种类及外观形态差异不大。将挑选出的淡黄色愈伤
组织在相同配方的培养基上继代即获得胚性愈伤组织 (见图版，3)。2，4一D浓度过高或过低均不利于
胚性愈伤组织的诱导，在胚性愈伤的诱导中添加一定浓度的BA是必要的。
利用试管苗切取外植体进行接种时，不要把一株小苗接种于培养基上，这样会导致小苗不断生长
发育，一定要茎、叶分离后分别接种才能诱导出愈伤组织。
2．2 胚状体诱导
不同生长调节剂的配比试验 (如表1)结果显示，胚性愈伤组织诱导产生胚状体速度最快、诱导
率最高的是5号培养基，6、7、8号培养基也出现了较多的胚状体。1、3、9、11、13、19号培养基
中出现愈伤组织变绿且向外突出的现象，有少量的胚状体发生。其余培养基中无胚状体发生。从试验
结果看，MS培养基较 1／2MS培养基更利于胚状体的诱导，这可能与长寿花胚状体的诱导需要较高的
表1 胚性愈伤组织胚状体的诱导率
Table 1 The induction rate of embryonic callus
培辈基 6枞 Aa 一 № r(mg’L-I) mg．L-I) (mg’L-I L⋯
- I)
每克胚性愈伤组织中胚状体个数
The number of embryoids in embryonic calus per gram
未成熟胚状体 成熟胚状体 总数
Unmature emb ryoid Mature embryoid Total amount
18
19
20
0．3
0．3
0．3 4
注：此表数据为红色品种诱导处理38 d的统计结果。
Note：The data in this table were results from red variety in 38 days since induced treatment
．
8 O 8 O "铝"9 O¨ O 7 O O O O O 5 O
O O 2 O 鼹 2 O O O O O O O O O
8 O 6 O ％ 7 O m O 6 O O O O O 5 O
2 2 1 1 2 1 3 3 3 2 2 1 1 2 l
O O O O O O — O O O O O O O O O 一
2 2 1 1 2 1 — 3 3 3 2 2 1 1 2 1 一
2 3 4 5 6 7 8 9 m ¨ B H ：2 "
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2期 陈 超等：长寿花胚性愈伤组织的诱导及胚状体再生 25l
离子浓度、较丰富的营养条件有关。在培养基中添加生长调节剂对提高胚状体的诱导率是有利的，加
入活性炭有促进胚状体诱导的作用，而Ad(硫酸腺嘌呤)与活性炭的组合中均未出现胚状体，说明
Ad对胚状体的诱导起副作用。
比较不同品种长寿花胚状体发生发育过程发现，在胚性愈伤组织的分化中，红色品种 14 d便有
大量胚状体长出，胚性愈伤组织颜色首先由淡黄变褐随即诱导出胚状体 (见图版，4)；而橙黄色品
种则分化较慢，胚性愈伤组织颜色由淡黄变绿随之诱导出胚状体。
2．3 胚状体发生的形态细胞学观察
胚性愈伤组织的切片观察显示，胚状体起源于胚性愈伤组织内部单个胚状体原始细胞，该细胞的
细胞质浓，染色深，细胞核大而圆。胚性细胞进行多次分裂，形成小细胞团，历经多细胞胚、球形
胚、心形胚、子叶胚最后发育成熟 (见图版，6～12)。这和正常双子叶合子胚的发育过程相似 。
2．4 胚状体的再生
将诱导出胚状体的胚性愈伤组织接于①MS+蔗糖30 g·L +琼脂6 g·L 和@us+蔗糖30 g·
L +琼脂6 g·L +活性炭4 g·L 再生培养基，不同发育时期的胚状体陆续发育成幼苗 (见图版，
5)。培养基中加入活性炭对苗的形成具有不利的作用，会出现大量的玻璃化苗。如在胚状体诱导培
养基上持续培养，也可直接成苗，但也发生大量玻璃化苗。所以，胚状体再生最好将诱导出胚状体的
胚性愈伤组织转接到不加活性碳的MS培养基上。多种因素可能造成玻璃化 j，本研究中此现象的
出现推测可能是活性炭吸附营养物，造成大量胚状体在进一步发育中营养缺乏以及渗透压增高等综合
因素造成的。
2．5 试管苗移栽
移栽前在温室内对瓶苗进行增光 (5000～10000 lx)降温 (20℃左右)锻炼，出瓶前2～3 d开瓶
盖降湿。移栽时取出小苗，洗去培养基，将小苗栽人以蛭石和草炭 (1-1)为基质的穴盘中，基质在
栽苗前用0．1％甲基托布津喷淋消毒。移栽后湿度保持在90％以上，逐步降低至温室正常湿度。温度
控制在25~C左右，7 d后叶面喷施 1／2 MS大量元素营养液，每周1次，30 d后进入常规管理。依以
上方法进行试管苗的出瓶，成活率可达98％以上。
2
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9
图版说明：1．愈伤组织诱导；2．胚性愈伤组织中的小细胞团．600×；3 N．愈伤组织；4 状体再生；5 再生成苗；6 胚性
愈伤组织中的胚状体，400 ；7．多个胚状体原始细胞 (箭头所示)，600×：8．胚状体多细跑呸阶段，400 ；9，10．胚状体球形
胚阶段，100 ；11．胚状体心形胚阶段．40 ；12．胚状体成熟胚阶段．40×
Explanation of plates：1． Calus indu( tion；2．Smal cel group in embr~
．
0niI callus； 3． Elnbryonic callus；4． Regenerated embr)oid；
5． Regenerated plal+：6． Embryoid in emb]、fl『i【 callus，400 ；7． Sevm‘at procel of embryoid。600 ×：8． Multi—cel stage of embryoid．
4OO ；9， 10． Globular stage of Pmbnoid，100 ： 11． Heart—shape stage of embrvoid．40 ： 12． Cot?ledonary stage of embryoid，40×．
参考文献：
1 韦三立．花卉绀织培养．北京：中国林业出版社，2001 99
2 胡适宜．被子植物胚胎学．北京：高等教育出版社，198-*
3 李映红，郭仲琛．青扦体细胞胚胎发生及小苗形成的研究
179～182
见：中国科学院植物研究所，兰州大学生物系主编．植物细胞工程应
用基础研究新进展．北京：学术期刊出版社，1989．49～53
4 学贤，陈维伦．试管植物的玻璃化现象．见：中国科学院植物研究所，兰州大学生物系主编．植物细胞工程应用基础研究新进
展．北京：学术期刊出版社，1999．90～96
⋯ ⋯’7
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