全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2002 , 29 (4) : 363～366
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 09 - 27 ; 修回日期 : 2002 - 02 - 263 本试验所用月季切花试验材料由中国农业大学观赏园艺与园林系俞红强老师提供 ; 从立题到成文 , 还得到本系高俊平教授、
赵梁军副教授和义鸣放教授的指导和帮助 , 在此一并致谢。
月季切花乙烯受体 ETR1 cDNA克隆及其序列分析 3
刘青林1 　白双义1 　欧阳青2 　屈　浩2 　蔡文启2
(1 中国农业大学观赏园艺与园林系 , 北京 100094 ;　2 中国科学院微生物研究所 , 北京 100080)
摘 　要 : 根据乙烯受体基因 ETR1 保守区设计引物 , 分别以瓶插寿命差异显著的月季切花品种‘德克
萨斯’和‘维亚蒂’为材料 , 通过 RT2PCR 从花瓣中扩增出了 797 bp 的 cDNA 片段 , 它编码 265 个氨基酸。
测序和序列分析表明 ,‘德克萨斯’重组质粒中插入片段的核苷酸序列之间完全相同 , 命名为 pRT2 ETR1。
而‘维亚蒂’所获得的重组质粒中插入片段的核苷酸和氨基酸序列之间存在差异 , 同源性分别为 85. 2 %和
92. 1 % , 分别命名为 pRV2 ETR12V4 和 pRV2 ETR12V5。pRV2 ETR12V5 的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’
pRT2 ETR1 的同源性均达 99 %以上 ; pRV2 ETR12V4 中的核苷酸和氨基酸序列与‘德克萨斯’pRT2 ETR1 的同
源性分别为 85. 0 %和 92. 5 %。上述插入片段与桃、苹果、天竺葵、拟南芥等植物的 ETR1 相应区域高度同
源 , 其氨基酸同源性均大于 90 %。
关键词 : 月季 ; 切花 ; 乙烯受体基因 ETR1 ; 克隆 ; 序列分析
中图分类号 : S 68 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2002) 0420363204
近年关于植物乙烯的研究已从生物合成途径转移到乙烯信号转导途径 , 其中很多关键基因已经分
离和鉴定〔1〕。乙烯受体基因 ETR1 在乙烯信号转导途径的开始阶段发挥作用 , 其疏水区是乙烯分子与
细胞膜结合的区域。利用基因工程策略延缓花器官的衰老 , 最有效的方法就是修饰乙烯受体 , 改变植
物对乙烯的响应。月季品种乙烯代谢类型和乙烯敏感性比较复杂〔2 ,3〕, 为了通过基因工程调控其对乙
烯的敏感性 , 作者利用同源引物 RT2PCR , 从不同瓶插寿命的品种中首次获得了 ETR1 cDNA 片段。
1 　材料与方法
月季切花采自北京昌平卉隆花卉公司栽培的两个品种 :‘维亚蒂’和‘德克萨斯’, 其瓶插寿命差
异显著〔4〕。在开花指数为 2 级时采收 , 重蒸水中瓶插 ; 以开花指数为 4 级的花瓣作为试材。Superscript
Ⅱ反转录酶和 p GEM2T Easy 载体为 Promega 产品。Taq Plus DNA Polymerase、限制性内切酶等生物学试
剂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。大肠杆菌 ( Escherichia coli) JM109 由中国科学院微生物
研究所植物生物技术实验室提供。月季切花花瓣总 RNA 参照 Chang 等〔6〕的方法提取。以总 RNA 为模
板 , oligo (dT) 17为引物 , 在 Superscript Ⅱ反转录酶作用下合成第一链 cDNA。根据桃、苹果等异源植物
乙烯受体基因 ETR1 编码区 (包括疏水区) 的序列〔5〕, 设计合成了一对引物。其中上游引物 P1 为
5’2CTTGTTCAGTTTGGTGCTTT ( C/ T) A23’, 下游引物 P2 为 5’2CTCGTACAGTTTGGTGCTTTCA23’。
PCR 扩增体系含 dNTP 2 mmol/ L、Taq Plus DNA Polymerase 0. 012～0. 025 U/μL , 引物浓度 20～40 pmol/
L。以花瓣总 RNA 反转录产物 1μL 为模板 , 94 ℃预变性 4 min ; 94 ℃变性 1 min , 53 ℃退火 1 min ,
72 ℃延伸 1. 5 min , 共 35 个循环 ; 72 ℃延伸 10 min。PCR 反应产物通过 1. 2 %琼脂糖电泳检查。用低
溶点胶回收 PCR 产物 , 与 p GEM2T Easy 载体连接 , 转化大肠杆菌 JM109 感受态细胞 ; 在含 X2gal/ IPTG
的培养基上 37 ℃培养过夜 , 挑取白色菌落 , 煮沸法提取质粒。EcoR Ⅰ酶切后 , 电泳鉴定插入片段大
小正确的重组质粒 , 送上海博亚公司测序 (每个品种送两个不同的重组质粒) 。测序引物用 T7 和 SP6 ,
测序结果进行 Blast 同源性检索 , 用 DNASTAR 进行序列分析。
2 　结果与分析
2. 1 　月季乙烯受体基因 ETR1 cDNA片段的扩增和克隆
　　　　　
图 1 　RT2PCR产物电泳
1、2、4 : H2O、‘德克萨斯’和‘维亚蒂’为模板的
RT2PCR 产物 ; 3 : 分子量标记
Fig. 1 　The agarose electrophoresis of PCR products
1 , 2 , 4 : RT2PCR products amplified from H2O ,‘Texas’
and‘Viraldi’; 3 : GeneRulerTM DNA Ladder Mix
图 2 　pRV2 ETR1 重组克隆鉴定
1、4 : 分子量标记 ; 2、3 : pRT2 ETR1 和 pRV2 ETR1
重组质粒的 PCR ; 5、6 : 重组质粒的 EcoR Ⅰ酶切
Fig. 2 　Identification of pRV2 ETR1 recombinants
1 , 4 : DL2000 , GeneRulerTM DNA Ladder Plus ; 2 , 3 : PCR products
of pRT2 ETR1 and pRV2 ETR1 ; 5 , 6. Digested with EcoR Ⅰ
　　以花瓣总 RNA 为模板 ,
oligo (dT) 17为引物 ,在 Superscript
Ⅱ反转录酶作用下合成第一链
cDNA。根据桃、苹果等与切花
月季同科植物 ETR1 cDNA 的保
守区设计的引物 , 分别从‘德克
萨斯’和‘维亚蒂’两个品种的
月季切花花瓣 cDNA 中扩增出与
预期大小相符的 797 bp 特异性
片段 (图 1) 。将该片段克隆到
p GEM2T2Easy 载体中 , 通过 EcoR
Ⅰ酶切和 PCR 鉴定 , 初步筛选
出与目的片段大小相符的重组克
隆 (图 2) 。‘德克萨斯’和‘维
亚蒂’的重组克隆分别命名为
pRT2 ETR1 和 pRV2 ETR1。
2. 2 　乙 烯 受 体 基 因 ETR1
cDNA序列分析
重组质粒 pRT2 ETR1、pRV2
ETR1 序列测定的结果表明 , 插
入片段为 797 bp , 编码 265 个氨
基酸 (图 3) 。其中‘德克萨斯’
的两个重组质粒中插入片段的核
图 3 　‘德克萨斯’pRT2 ETR1 cDNA片段核苷酸和氨基酸序列
( Genbank 登陆号为 AF380127)
Fig. 3 　The partial nucleotide sequence of pRT2 ETR1 and deduced
amino acids from‘Texas’
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苷酸序列完全相同。而‘维亚蒂’的两个重组质粒中 , 其插入片段的核苷酸序列同源性为 85. 2 % ,
氨基酸同源性为 92. 1 % , 存在差异。其中一个的核苷酸、氨基酸序列与‘德克萨斯’的同源性均达
99 %以上 , 命名为 pRV2 ETR12V5 ; 另一个的核苷酸、氨基酸序列与‘德克萨斯’的同源性分别为
85 %和 92. 5 % , 命名为 pRV2 ETR12V4 (图 4) 。Genbank 检索表明 , 两个品种月季切花不同重组质粒的
插入片段的氨基酸序列与桃、苹果、天竺葵、拟南芥等植物 ETR1 相应编码区氨基酸序列同源性高达
90 %以上 , 说明 ETR1 在包括疏水区的 N - 端非常保守。有意义的是 , Genbank 检索结果显示 , ‘维亚
蒂’pRV2 ETR12V4 的核苷酸序列与微型月季的 ETR2 cDNA 部分区域的同源性高达 98 %。
图 4 　‘维亚蒂’pRV2 ETR12V4 cDNA片段核苷酸和氨基酸序列
Fig. 4 　The partial nucleotide sequence of pRV2 ETR12V4 and deduced amino acids from‘Viraldi’
3 　讨论
乙烯受体基因家族包括 ETR1 , ETR2 , ERS1 , ERS2 和 EIN4 共 5 个基因 , 其蛋白质结构相似 ,
它们在植物的不同组织、或不同发育阶段特异表达 , 造成了对乙烯响应的差异〔7 ,8〕。这种对乙烯敏感
性的差异 , 可能是造成月季切花‘德克萨斯’和‘维亚蒂’采后寿命差异显著的主要原因之一 , 因此
推测乙烯受体基因在这个品种之间会有差异。试验结果表明 , 在月季切花中不仅存在乙烯受体基因
ETR1 , 还可能存在着 ETR1 家族其它成员 (如 ETR2) 。迄今为止 , 有关月季乙烯受体基因 ETR1 克隆
的研究报道只有微型月季一例〔8〕, 但该片段与桃、苹果等植物 ETR1 在核苷酸与氨基酸序列上差异过
大 , 无法用作设计引物的参照。事实上 , 我们从月季切花中所得 ETR1 的氨基酸与微型月季的序列同
源性仅为 49 %左右。现代月季是由 15 个中外蔷薇原种杂交形成的复合种 , 切花月季与微型月季属于
两个不同的品种群 , 后者是几个原种的自发突变杂交而成的 , 这种巨大的种源差异可能是造成同源性
较低的主要原因。月季不同品种瓶插寿命差异的原因 , 既与现代月季的杂交起源及其复杂的品种基因
5634 期 　　　　　　　　　　刘青林等 : 月季切花乙烯受体 ETR1 cDNA 克隆及其序列分析 　　　　　　　　　　
型的差异有关 , 还可能与不同品种的乙烯受体基因家族的不同成员对乙烯的不同响应有关。
通过基因工程途径阻断乙烯受体功能 , 改变植物组织对乙烯的响应 , 是延缓衰老的有效方法。如
含有 etr121 的转基因拟南芥对乙烯不敏感 , 相对于野生型植株的乙烯结合量减少了 4/ 5〔9〕。乙烯不敏
感性还可通过拟南芥 etr121 在异源植物中表现出来。如将 etr121 转入矮牵牛 , 花的寿命从 3 d 延长至
8 d〔10〕。‘德克萨斯’和‘维亚蒂’2 个瓶插寿命差异显著的月季切花品种中的克隆得到的 ETR1 cDNA
片段 , 为进一步研究乙烯受体基因在月季切花衰老进程中的作用 , 以及从受体水平上抑制乙烯的效
应 , 延长月季切花的采后寿命 , 奠定了基础。
参考文献 :
1 　Chang C , Shockey J A. The ethylene2response pathway : signal perception to gene regulation. Current opinion in plant biology , 1999 , 2 : 352～
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2 　高俊平 , 张小红 , 黄绵佳 , 等. 月季开花和衰老进程中乙烯变化类型初探. 园艺学报 , 1997 , 24 (3) : 274～278
3 　Muller R , Andersen A S , Serek M. Differences in display life of miniature potted roses ( Rosa hybrisa L. ) . Scientia Horticulturae , 1998 , 76
(1) : 59～71
4 　白双义 , 刘青林. 月季切花不同品种衰老征兆及瓶插寿命的比较研究. 园艺学报 , 2001 , 28 (4) : 364～366
5 　Lee S A , Ross G S , Gardener R C. An apple homolog of the ethylene receptor gene ETR1 (Accession No. AF 032448) . Plant Physiology ,
1998 , 117 (3) : 1126
6 　Chang Shujun , Puryear Jeff , Cairney John. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter ,
1993 , 11 (2) : 113～116
7 　Hua J , Meyerowitz E M. Ethylene responses are negatively regulated by a receptor gene family in Arabidopsis thaliana. Cell , 1998 , 94 : 261～
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8 　Muller R , Lind2Iversen S , Stummann B M , et al . Expression of genes for ethylene biosynthetic enzymes and an ethylene receptor in senesceing
flowers of miniature potted roses. Journal of Horticultural Science and Biotechnology , 2000 , 75 (1) : 12～18
9 　Chang C , Kwok S F , Bleecker A B , et al . Arabidopsis ethylene2response gene ETR1 : similarity of product to two2component regulators.
Science , 1993 , 262 : 539～544
10 　Wilkinson J Q , Lanahan M B , Clark D G, et al . A dominant mutant receptor from Arabidopsis confers ethylene insensitivity in heterologous plants.
Nature Biotechnology , 1997 , 15 : 444～447
Cloning and Sequence Analysis of Ethylene Receptor ETR1 cDNA from Cut
Roses
Liu Qinglin1 , Bai Shuangyi1 , Ouyang Qing2 , Qu Hao2 , and Cai Wenqi2
(1 Department of Ornamental Horticulture and Landscape Architecture , China Agricultural University , Beijing 100094 , China ;　2 Plant
biotechnology lab , Institute of Microbiology , Chinese Academy of Sciences , Beijing 100080 , China)
Abstract : The primers were designed according to the conservative domain of ETR1 cDNA from other
heterogeneous plants. The fragments of 797 bp cDNA , which encoding 265 amino acid residues were amplified
through RT2PCR from petals of cut roses‘Texas’and‘Viraldi’with different vase lives. Sequence analyses
show that the nucleotides of insert fragments in recombinants of ‘Texas’are completely identical ; which named
pRT2 ETR1. Sequence homologies of nucleotide and deduced amino acid residues between two kinds of
recombination of‘Viraldi’are 85. 2 % and 92. 5 % respectively , the two kinds of recombination were named pRV2
ETR12V4 and pRV2 ETR12V5. The nucleotide sequence of pRV2 ETR12V5 is 99 % of homology with that of
‘Texas’. Sequence homologies of nucleotide and deduced amino acid residues between pRV2ETR12V4 and those of
‘Texas’are 85. 0 % and 92. 5 % respectively. Compared with other heterogeneous high plants , all of the above
fragments of ETR1 cDNA of cut roses are highly homologous with other high plants , such as peach , apple ,
Arabidopsis and geranium , and homology of amino residues are all beyond 90 %.
Key words : Cut roses ; ETR1 ; Cloning ; Sequence analysis
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