全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2004 , 31 (6) : 803～806
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 03 - 03 ; 修回日期 : 2004 - 06 - 01
基金项目 : 国家‘863’计划项目 (2001AA241142) ; 广东省重大科技专项资助项目3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail : Yiganjun @vip11631com ; E2mail : Gpwang @mail1hzau1edu1cn)
应用 PCR及 Nested2PCR技术检测柑橘黄龙病病原
研究
丁　芳1 ,2 　易干军2 3 　王国平1 3
(1 华中农业大学植物科学技术学院 , 武汉 430070 ; 2 广东省农业科学院果树研究所 , 广州 510640)
摘 　要 : 以采自田间和广东省农业科学院果树研究所防虫隔离网室内嫁接并感染黄龙病的 5 个柑橘品种
叶片为材料 , 以草本指示植物长春花 ( Catharanthus roseas) 和木本指示植物　柑 ( Citrus reticulata Blanco) 鉴定
为基础 , 采用改良的 CTAB 法提取总 DNA , 在此基础上进行常规 PCR 与 Nested2PCR 检测 , 并对特异目的片段
进行克隆、测序。试验证明 Nested2PCR 比常规 PCR 的灵敏度更高。这两种方法均可以检测出未显症的黄龙病
材料 , 但 Nested2PCR 可以在木本指示植物嫁接后 40 d 左右、草本指示植物摩擦接种 1 个月左右检测到病原 ;
而常规 PCR 在木本植物嫁接后 60 d 左右、草本植物摩擦接种近 2 个月左右才能检测到病原。常规 PCR 所能检
测到的最低 DNA 的量为 pg数量级 ; Nested2PCR 检测病原 DNA 灵敏度约为常规 PCR 的 104 倍。
关键词 : 柑橘 ; 黄龙病 ; PCR ; Nested2PCR ; 检测
中图分类号 : S 666 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 05132353X (2004) 0620803204
Research on the PCR and Nested2PCR Detection of Citrus Huanglongbing
Pathogen
Ding Fang1 ,2 , Yi Ganjun2 3 , and Wang Guoping1 3
(1 Plant Science and Technology Academy , Huazhong Agriculture University , Wuhan 430070 , China ; 2 Insititute of Fruit Tree Reseach ,
Guangdong Academy of Agricultural Science , Guangzhou 510640 , China)
Abstract : The experiment was conducted with five species of citrus Huanglongbing material . On the base of
the bioassay , we used PCR and Nested2PCR were used to detect precisely. The special DNA fragment was cloned
and sequenced. The results showed that : both of these two PCR methods can detect the material with no obvious
symptom. However the Nested2PCR was better : It could detect the Catharanthus roseas and Citrus reticulata Blan2
co just within one or two months after the inoculation ; but when PCR was used , the pathogen could be detected
over two months after inoculation. The lowest concentration of DNA that can be detected by Nested2PCR was lower
than fg , yet PCR is only pg. The sensitivity of Nested2PCR is nearly ten thousand times higher than that of PCR.
Key words : Citrus ; Huanglongbing ; PCR ; Nested2PCR ; Detection
1 　目的、材料与方法
柑橘黄龙病 (Citrus Huanglongbing) 是一种在柑橘生产上危害极其严重的类细菌病害〔1〕。由于其
病原一直难于进行人工培养 , 使得对该病害的研究受到了很大的限制。近年来随着 PCR 技术的发展 ,
特别是 Villechanoux 等〔2〕发表了柑橘黄龙病病原的部分 DNA 序列以来 , 运用 PCR 技术检测此类病害成
为可能。田亚南等〔3〕报道运用 PCR 技术对该病进行检测 , 李韬等〔4〕运用了嵌套式聚合酶链式反应
(Nested2PCR) 对柑橘木虱及其寄主‘九里香’的带菌率进行了研究。本研究同时采用 PCR 和 Nested2
PCR 技术对柑橘黄龙病进行检测 , 对特异的柑橘黄龙病病原 DNA 片段进行克隆 , 测序分析 , 并对两
种方法加以比较 , 以期为柑橘黄龙病的检测提供更为灵敏的检测方法。
以采自田间和广东省农业科学院果树研究所防虫隔离网室内嫁接的 5 个柑橘品种的黄龙病叶片为
材料 , 即 : ①　柑、②红江橙、③暗柳橙、④十月桔、⑤萝岗甜橙 , 以及经汁液摩擦接种的草本指示
植物长春花 ( Catharanthus roseas) 为待检材料 , 以健康的柑橘及长春花叶片为对照材料。通过汁液摩
擦接种长春花 , 多芽腹接木本指示植物　柑 , 以表现典型黄龙病症状的指示植物总 DNA 为阳性对照 ,
以健康的指示植物总 DNA 为阴性对照。叶片总 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法〔5〕。PCR 及 Nested2
PCR 引物根据柑橘黄龙病病原亚洲株系 16SrDNA , 参考李韬等〔4〕、孔维文等〔6〕的设计 , 由上海生工生
物工程技术服务有限公司合成。PCR 反应均在 PTC2100 , MJ Research INC PCR 仪上进行 , 25μL 体系中
含有 215μL 10 ×PCR Buffer , 150μmol/ L dNTP , Taq 酶 016 U , 5 ng 提取的总 DNA。两对引物均为 014
μmol/L , PCR 引物 (即 Nested2PCR 外侧引物 ) : P1 5pi2TGAATTCTTCGAGGTTGGTGAG23pi, P2 5pi2A2
GAATTCGACTTAATCCCCACCT23pi; Nested2PCR 内侧引物 : P3 5pi2GCGTTCATGTAGAAGTTGTG23pi, P4 5pi2
CCTACAGGTGGCTGACTCAT23pi。PCR (即 Nested2PCR 第 1 轮扩增) 反应程序为 , 94 ℃3 min , 94 ℃30 s ,
53 ℃30 s , 72 ℃1 min , 30 个循环 , 最后 1 次 72 ℃延伸 10 min。Nested2PCR 第 2 轮扩增程序为 94 ℃3
min , 94 ℃30 s , 55 ℃1 min , 72 ℃1 min , 35 个循环 , 最后 72 ℃延伸 10 min。每个扩增反应都重复 3 次 ,
均设阴性对照及黄龙病阳性材料对照。
2 　结果与讨论
211 　草本指示植物鉴定结果
草本指示植物长春花摩擦接种 3 个月左右开始显示症状 , 表现为下部叶片最先从叶脉开始黄化 ,
上部叶片仍表现为健康的绿色。之后整个叶片逐渐均匀黄化 , 并且黄化的叶片由下而上逐渐增多 , 最
后黄化叶片逐渐脱落。
212 　木本指示植物鉴定结果
木本指示植物感病品种　柑从嫁接后近 10 个月左右显现症状 : 初始叶片变黄 , 后期为黄绿相间
的斑驳型黄化 , 病叶明显较健康叶片小 , 叶片角质化变硬。
213 　PCR产物电泳观察
用改良的 CTAB 法提取的 DNA 为模板 , 对田间采取的 5 个品种共计 52 个标样进行 PCR 检测 , 46
个标样扩增得到了特异目的 DNA 片段 535 bp (图 1) 。所检测材料中包括典型的黄化、斑驳症状 , 以
及无症状的疑似材料 , PCR 扩增有 6 个标样未检测出病原 , 主要是无症状疑似材料。黄龙病病菌在寄
主体内分布不均 , 可能是造成部分材料未检测出的原因。
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214 　Nested2PCR检测结果
对防虫隔离网室内嫁接后 40 d 左右 4 个品种的黄龙病叶片材料以及通过汁液摩擦接种 1 个月左右
的长春花在常规 PCR 的基础上进行了 Nested2PCR 检测 , 扩增出了特异目的 DNA 片段 400 bp , 试验结
果如图 2 , 图 3。长春花在汁液摩擦接种 1 个月左右 Nested2PCR 可检测到病原存在 ; 木本指示植物　
柑嫁接接种后 40 d Nested2PCR 可检测到病原的存在 ; 而常规 PCR 直到两个月以后才能检测到病原存
在 (图 4) 。
215 　PCR产物的克隆和序列分析
PCR 扩增得到的特异目的片段 535 bp , 经
PCR Fragment Recovery Kit 回收纯化 , 与 pMD182T
Vector 连接后转化 E1 Coli JM109 菌株感受态细胞 ,
经蓝白斑筛选 , 挑取白色菌落进行培养。经 PCR
鉴定获得重组质粒 , 阳性克隆中扩增出特异目的
DNA 片段 535 bp (图 5) 。
所获得的阳性重组质粒 , 由上海生工生物工
程技术服务有限公司进行序列测定 , 经 GeneBank
BLAST搜索 , 与已发表的柑橘黄龙病病原 DNA 序
列的同源性为 9919 % , 证明所克隆的 DNA 片段为
柑橘黄龙病病原的 DNA 序列 (图 6) 。
图 5 　特异 DNA片段 535 bp 克隆 PCR鉴定
M. 100 bp DNA Ladder Marker ; 1. 阳性对照 ;
2. 阴性对照 ; 3～5. 重组质粒 PCR 产物。
Fig. 5 　PCR Detection of cloned DNA fragment
M. 100 bp DNA Ladder Marker ; 1. Positive control ; 2. Negtive
control ; 3 - 5. Recombination plasmid PCR product .
图 6 　特异 DNA片段 535 bp 的碱基序列 (划线部分为引物序列)
Fig. 6 　The sequence of the special DNA fragment ( Sequence of primers used for PCR amplification are underlined)
508　6 期 丁 　芳等 : 应用 PCR 及 Nested2PCR 技术检测柑橘黄龙病病原研究 　
216 　PCR与 Nested2PCR检测灵敏度比较
总 DNA 经浓度调整为 10 ng/μL , 运用 PCR 检
测只能检测出 10 - 4倍稀释 , 相当于 pg 数量级 ; 而
Nested2PCR 可检测出 10 - 8倍稀释 , 低于 fg 数量级
(图 7) 。
按照理论上讲 , 只要有单拷贝的完整模板存
在 , 应用 PCR 技术进行扩增应该会得到预期的产
物。但实际上 , 当病原含量太低时 , 特别是应用
PCR技术进行病原检测时 , 微量 (低于 pg 数量
级) 的模板以常规 PCR 有可能检测不出来 , 本试
验对通过汁液摩擦接种 1 个月左右的长春花以及
嫁接后 40 d 左右的 5 个品种的 32 个黄龙病材料运
用常规 PCR 进行检测时 , 均未检测出病原 DNA ,
图 7 　Nested2PCR可检测的 DNA稀释度
M. DNA Marker ; 1. 100 ; 2. 10 - 1 ; 3. 10 - 2 ;
4. 10 - 3 ; 5. 10 - 4 ; 6. 10 - 5 ; 7. 10 - 6 ;
8. 10 - 7 ; 9. 10 - 8。
Fig. 7 　Detectible DNA concentration of Nested2PCR
M. DNA Marker ; 1. 100 ; 2. 10 - 1 ; 3. 10 - 2 ;
4. 10 - 3 ; 5. 10 - 4 ; 6. 10 - 5 ; 7. 10 - 6 ;
8. 10 - 7 ; 9. 10 - 8.
而随后运用 Nested2PCR 进行了进一步检测 , 结果均扩出了特异性目的片段 , 这说明并非只要有病原
存在就能用常规 PCR 检测。试验中对从 013 g 叶脉中提取的总 DNA 经浓度调整后进行了梯度稀释 ,
常规 PCR 仅能检测到稀释 10 - 4倍 , 相当于 110 pg ; Nested2PCR 可检测到稀释 10 - 8 , 相当于 011 fg , 这
表明 Nested2PCR 技术在检测灵敏度上远高于常规 PCR。
参考文献 :
1 　Jagoueix S , BovèJ M , Garnier M. The phloem2limited bacterium of greening disease of citrus is a member of a subdivision of the proteobacteria. J .
of Syst . Bacteriol . , 1994 , 44 (3) : 379～386
2 　Villechanoux S , Garnier M , Renaudin J , et al . Detection of several strains of the bacterium2like organism of citrus greening disease by DNA probes.
Current Microbiology , 1992 , 24 : 89～95
3 　田亚南 , 柯　穗 , 柯　冲. 应用多聚酶链式反应 (PCR) 技术检测和定量分析柑橘黄龙病病原. 植物病理学报 , 1996 , 26 (3) : 243
～250
4 　李　韬 , 柯　冲. 应用 Nested2PCR 检测柑橘木虱及其寄主九里香的柑橘黄龙病带菌率. 植物保护学报 , 2002 , 29 (1) : 31～35
5 　易干军 , 霍合强 , 蔡长河 , 等. 适用于 AFLP 分析用的荔枝 DNA 的提取方法. 华南农业大学学报 , 1999 , 20 (3) : 123～124
6 　孔维文 , 邓晓玲 , 梁志慧 , 等. 柑橘黄龙病病原 DNA 片段的克隆及序列分析. 植物病理学报 , 2000 , 30 (1) : 71～75
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