全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2005, 32 (2) : 249～255
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2004 - 06 - 02; 修回日期 : 2004 - 10 - 16
基金项目 : 北京市科技新星项目 (954812900) ; 国家 ‘863’项目 (2001AA241124, 2002AA207012)3 通讯作者 Author for correspondence ( E2mail: zhangfenglan@ nercv1com)
大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建
张立阳 1, 2 　张凤兰 13 　王　美 1 　刘秀村 1 　赵岫云 1 　薛林宝 2
(1 北京市农林科学院蔬菜研究中心 , 北京 100089; 2 扬州大学农学院园艺系 , 扬州 225009)
摘 　要 : 以大白菜高抗 TuMV白心株系 912112和高感 TuMV桔红心株系 T12219为亲本建立的小孢子培
养 DH系作为图谱构建群体 , 构建了包含 10个连锁群、406个标记位点的分子连锁图谱 , 图谱总长度
82613 cM , 标记间的平均图距为 210 cM , 连锁群数目和染色体数相等。每个连锁群上的标记数在 7～111个
之间 , 连锁群的长度在 2614～15611 cM的范围内 , 平均图距在 110～318 cM之间。该连锁图谱包括 246个
AFLP标记、135个 RAPD标记、11个 SSR标记和 12个同工酶标记、1个 SCAR标记和 1个形态标记。
关键词 : 大白菜 ; 分子标记 ; 遗传图谱 ; DH群体
中图分类号 : S 63413　　文献标识码 : A　　文章编号 : 05132353X (2005) 0220249207
A L inkage M ap Con struction for Ch inese Cabbage Ba sed on AFL P, SSR,
RAPD and Isozym e M arkers Using D H Popula tion
Zhang L iyang1, 2 , Zhang Fenglan13 , W ang Mei 1 , L iu Xiucun1 , Zhao Xiuyun1 , and Xue L inbao2
(1 N ational Engineering R esearch Center forV egetables, B eijing 100089, China; 2 Horticultural D epartm ent, Yangzhou U niversi2
ty, Yangzhou 225009, Ch ina)
Abstract: A molecular genetic map for Chinese cabbage was constructed based on AFLP (Amp lified
Fragment Length Polymorphism) , RAPD (Random Amp lified Polymorphism DNA ) , SSR ( Simp le Sequence
Repeat) and isozyme markers. Marker analysis was performed on 100 random ly chosen DH lines obtained by
m icrospore culture from the F1 between two homozygous parents: 912112 and T12219. 406 markers including
246 AFLP markers, 135 RAPD markers, 11 SSR markers, 12 isozyme markers, 1 SCAR and 1 morphologi2
cal marker were integrated into 10 group s using JoinMap 310. It covered 82613 cM with a mean marker inter2
val of 210 cM. Number of markers included in linkage group s varied from 7 to 111, mean marker interval dis2
tance from 110 cM to 318 cM and the length of linkage group s from 2614 cM to 15611 cM individually. A total
of 4510% distorted markers distributed in the map. The molecular genetic map constructed in this study would
be useful in gene localization, comparative genomes research and QTL mapp ing of important agronom ic traits
for Chinese cabbage.
Key words: Chinese cabbage; Molecular marker; Genetic linkage map; Double hap loid (DH)
大白菜 (B rassica cam pestris L. ssp. pekinensis) 原产我国 , 是我国蔬菜栽培中分布最广、种植面
积最大的蔬菜作物之一 , 其遗传学和分子生物学研究一直受到高度重视。分子连锁图谱为进行植物基
因组的结构分析和比较提供了有力工具。较高密度的分子图谱已有效的应用于数量性状的基因定位、
比较基因组学研究和分子标记辅助育种等研究中。关于大白菜 (种 ) 遗传图谱的构建 , 国内外先后
有 Song等〔1〕、Teutonico等〔2〕、A jisaka等〔3〕、Tanhuanpaa等〔4〕、Matsumoto等〔5〕、张鲁刚等〔6〕、于拴
仓等〔7〕报道。但上述研究主要存在 4个问题 : 第一 , 使用的标记主要为 RFLP和 RAPD标记。RFLP
标记较为复杂 , 探针难以获得 , 不易进行大量单株筛选 ; RAPD标记虽易于操作 , 但其稳定性较差。
AFLP技术结合了 RFLP和 RAPD的特点 , 稳定性较好 , 在一次 PCR反应中能同时检测多个遗传位点 ,
园 　　艺 　　学 　　报 32卷
信息量非常丰富。SSR标记所揭示的多态性也十分丰富 , 相对于 RAPD , 重复率和可信度高 , 逐渐成
为遗传标记中的研究热点。第二 , 目前构建的遗传图谱大多利用亚种间杂交获得的群体 , 对于指导育
种来说 , 选用品种间杂交组合更贴近育种目标 , 可以获得许多重要农艺性状完整的遗传信息。第三 ,
图谱的密度不高 , 目前大白菜品种间组合所获得的图谱标记密度低 , 尚不能满足农艺性状定位和基因
组研究的要求。第四 , 大多数图谱是利用 F2群体构建的 , 为非永久性群体无法继续将其饱和 , 很难
与其它实验室合作进行比较研究 , 同时很难准确地对大白菜数量性状进行定位。采用永久群体如 DH
群体与重组自交系进行分子图谱的构建已成为国际上的主流方向。
本研究对大白菜普通白心株系 912112和桔红心株系 T12219杂交 F1 进行游离小孢子培养 , 以得到
的 100个 DH株系为作图群体〔8〕, 采用 AFLP标记、SSR标记、RAPD标记、同工酶标记、SCAR和形
态标记等 , 构建了永久高密度的大白菜分子连锁图谱 , 可为重要农艺性状的基因定位和标记辅助育种
研究参考。
1　材料和方法
大白菜普通白心株系 912112为连续自交 9代的高代自交系 , 球心为白色 , 叶面较平 , 叶球叠抱 ,
高抗芜菁花叶病毒 ( TuMV)。T12219是通过对北京地方品种和日本引进品种的杂种 F1 进行小孢子培
养得到的双单倍体株系 , 球心为桔红色 , 植株生长势弱 , 高感芜菁花叶病毒。对 912112和 T12219的
F1 进行小孢子培养 , 得到 100个双单倍体株系 , 作为白菜构建连锁图谱的分离群体。
采用 CTAB法提取基因组 DNA, 按 Murry等〔9〕的方法进行。同工酶的提取方法参照王中仁〔10〕的
方法。
参照 Vos的方法〔11〕进行 AFLP分析 , AFLP试剂盒购自美国 GIBCO2BRL公司 , AFLP分析参照试
剂盒说明书进行 , 稍有改动 , 反应体积减半。AFLP扩增产物在 EC160 DNA测序电泳槽 (B io2Rad,
America) 上分离 , 利用银染方法进行分析。
RAPD反应体系为 25μL, 包括 215μL 10 ×buffer, 210μL 25 mmol/L MgCl2 , 210μL 215 mmol/L
dNTP, 1 U TaqDNA聚合酶 , 30 ng引物 , 50 ng模板 DNA。热循环程序为 : 94℃预变性 4 m in, 然后
94℃ 15 s, 37℃ 30 s, 72℃ 75 s下循环 45次 , 72℃延伸 7 m in后保存在 4℃条件下。采用 114%琼脂
糖 (含 015 mg/L EB ) 凝胶 , 80 V电泳 2 h。用 Kodak EDAS2120凝胶成像系统照相分析。
SSR引物序列参照 Szewc等〔12〕引物序列由 Sangon公司合成。20μL反应体系含有 1 ×PCR buffer,
31125 mmol/L MgCl2 , 0125 mmol/L dNTPs, 110μmol/L引物 , 30 ng模板 DNA , 1 U TaqE。反应程序
为 : 94℃预变性 2 m in, 94℃变性 60 s, 68℃退火 30 s, 72℃延伸 45 s, 进行 2个循环 , 以后每 2个循
环降低退火温度 1℃直到 58℃, 最后 94℃变性 60 s, 58℃退火 30 s, 72℃延伸 45 s进行 20个循环。
扩增产物用 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 , 55 W预电泳 1 h后 , 60 W电泳约 115 h, 直至二甲苯青
跑到胶的 2 /3处为止 , 停止电泳 , 进行银染分析。
同工酶分析采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳 , 凝胶制备参照周顺伍的〔13〕的方法 , 分离胶的浓度
是 7% , 浓缩胶浓度是 3% , 在 4℃条件下 300 V恒压电泳。染色参照王中仁〔10〕的方法进行。用 10%
的甘油制成干胶保存或照相记录电泳结果。
数据整理将各个株系的带型按亲本类型分类 , 与 912112带型相同者赋值为 A, 与 T12219带型相
同者赋值为 B, 由各种原因造成的数据不清或缺失者赋值为 “ - ”。根据与 100 bp DNA ladder标准谱
带的相对位置 , 估计多态性条带的分子量大小。RAPD和 SSR标记名称用引物名称加扩增片段的碱基
长度表示 , 由于 AFLP采用的是 ( E + A ) / (M + C) 组合 , 所以 AFLP标记用引物中后两个选择性碱
基组合加扩增片段大小表示。两个选择性碱基组合之间用 “ - ”分开。
连锁分析利用 JoinMap 310〔14, 15〕软件构建大白菜遗传图谱。先用 “New p roject”命令创建一个新
的文件 , 用 “Load data”命令导入数据 ; 然后 , 在 “ Individual genot. freq”下排除缺失数据过多的
052
　2期 张立阳等 : 大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建 　
单株 , 在 “Locus genot. freq”下分析标记的偏分离情况 ; 最后将 LOD 值的范围设定为 “2”到
“10”, 用 “Group”命令进行分组 ; 选用 “Kosambi”函数计算图距 , 用 “Map”命令构建连锁图谱。
2　结果与分析
211　分子标记多态性
利用亲本与 F1 代进行 AFLP引物组合的筛选 , 最后从 64对引物中筛选出 20对条带清晰、多态性
高的引物组合进行 AFLP分析。20对引物共产生 810个条带 , 平均每个引物扩增出 4015条带。810
个位点中 263个位点在双亲间具有多态性 , 占 3215%。263个多态性位点中有 26个标记为共显性标
记 , 占 919%。
对 462个 RAPD引物进行分析 , 筛选出在双亲间稳定表现多态的引物 99个。其共产生 406条扩
增谱带 , 平均每个引物扩增 411条带 , 其中多态性谱带 150条 , 占 3215%。150个多态位点中有 2个
共显性标记 , 占 113%。
对 15个 SSR引物对进行分析 , 其中 6对引物产生的扩增产物多态性明显 , 带型清晰且稳定性好。
6对 SSR引物共产生 17个多态性位点 , 多态率为 218条 /引物对。
通过对天冬氨酸转氨酶 (AAT)、苹果酸脱氢酶 (MDH )、苹果酸酶 (ME )、乳酸脱氢酶
(LDH)、磷酸葡萄糖变位酶 ( PGM )、甲酸脱氢酶 ( FDH )、谷氨酸脱氢酶 ( GDH ) 7种同工酶进行
电泳分析 , 得到在双亲间表现差异的谱带 14条 , 其中共显性标记 10个 , 占 7114%。
212　遗传图谱的构建
对 446个多态性标记进行分析构图 , 得到包含 406个标记、10个连锁群的遗传图谱 (图 1, 表
1) , 其中包括 246个 AFLP标记 , 135个 RAPD标记 , 11个 SSR标记、12个同工酶标记、1个 SCAR
标记和 1个形态标记。连锁群数目和大白菜的染色体数相等 , 连锁图编号为 LG1到 LG10, 总长度为
82613 cM , 标记间平均图距为 210 cM。每个连锁群上的标记数在 7～111个之间 , 连锁群的长度在
2614～15611 cM的范围内 , 平均图距在 110～318 cM之间。406个分子标记中 , 来自父本的标记为
222个 , 占 5417% , 来自母本的为 184个 , 占 4513% , 符合 1∶1的理论分离比。各位点上 , 912112的
基因频率为 7916% ～2317% , 平均为 51165% ; T12219 的基因频率为 2014% ～7613% , 平均为
48135%。所以 , 亲本在群体中的分离比例接近 , 说明该群体总体上没有出现严重的偏分离。
试验分析的 446个标记中 , 有 910%的标记未进入连锁群 , 包括 17个 AFLP标记、15个 RAPD标
记、6个 SSR标记和 2个同工酶标记 (表 1)。10个连锁群中 , LG1包含的标记最多 , 有 111个 , LG8
最少 , 只有 7个。标记在 LG1、LG4和 LG5上的分布不均匀 , 分别出现不同程度的标记密集区 , 尤其
是 AFLP标记 ; 其余连锁群上的标记分布比较均匀 , 只有 0～3个间距大于 10 cM的空隙。LG8的平均
图距最大 , 为 3177 cM; LG6的平均图距最小 , 为 110 cM (表 2)。
表 1　构建遗传图谱的分子标记
Table 1　M olecular markers used for genetic map con struction
分子标记
Molecular
marker
多态性标记数 /引物对
Number of polymorphic
markers/p rimer
combination
偏分离标记数
Number of
distorted
markers
偏分离标记比率
Rate of distorted
markers( % )
连锁标记数
Number
of linked
markers
未连锁标记数
Number of
unlinked markers
未连锁标记比例
Rate of unlinked
markers( % )
AFLP 263 /20 116 4711 246 17 615
RAPD 150 /99 50 3710 135 15 1010
SSR 17 /6 　6 5415 11 6 3513
同工酶 Isozyme 14 / - 10 8313 12 2 1413
SCAR 　1 / - 　0 0 　1 0 0
形态标记 Morphological marker 　1 / - 　0 0 　1 0 0
合计 Total 446 /125 182 4510 406 40 910
152
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　2期 张立阳等 : 大白菜永久高密度分子遗传图谱的构建 　
图 1　用 D H群体构建的大白菜分子连锁图
“3 ”和 “3 3 ”表示标记的分离偏离理论分离比例 1∶1, 3 : P≤0105, 3 3 : P≤0101。
F ig. 1　The linkage map con structed w ith D H popula tion in Ch inese cabbage
‘3 ’and‘3 3 ’ indicate markers showing deviations from the expected 1∶1 segregation ratio, 3 : P≤0105, 3 3 : P≤0101.
213　偏分离分析
连锁图上的所有 406个标记位点中 , 在 1%水平上有 112个位点不符合孟德尔分离比例 , 即表现
极显著偏分离 , 比率为 2712% ; 在 5%水平上有 70个位点偏离孟德尔分离比例 , 即表现显著偏分离 ,
比率为 1713%。所有偏分离的标记中 , 偏向 912112者占 6615% , 偏向 T12219者占 3315%。从偏分
离位点的分布来看 , 除了 LG10没有偏分离位点外 , 其余均有 , 其中 LG2、LG3和 LG6均为偏分离标
记。大部分偏分离标记在连锁群上表现为多个位点集中分布 , 如 LG9的两端 , LG7的下半部分。
LG2、LG3、LG8和 LG9上的偏分离标记全部偏向 912112, LG6上的偏分离标记全部偏向 T12219, 其
余连锁群中除了 LG10外 , 大部分偏向 912112 (表 1、表 2)。
表 2　分子标记在遗传图谱上的分布
Table 2　D istr ibution of m olecular markers on linkage map
连锁群
L inkage group
LOD值
LOD score
长度
Length
( cM)
标记数
Number of
markers
平均距离
Average distance
( cM)
偏 T12219标记数
Number of markers
distorted to T12219 偏 91212标记数Number of markersdistorted to 91212 偏分离标记数Number of distortedmarkers
LG1 9 14517 111 113 13 24 37
LG2 9 3214 14 213 0 14 14
LG3 7 7114 24 310 0 24 24
LG4 8 15611 68 213 1 10 11
LG5 8 12314 52 214 13 　3 16
LG6 8 3210 32 110 32 　0 32
LG7 7 10219 42 215 2 22 24
LG8 4 2614 　7 318 0 　5 　5
LG9 3 7718 36 212 0 19 19
LG10 9 5812 20 219 0 　0 　0
总计 Total - 82613 406 210 61 121 182
352
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3　讨论
本研究主要利用 AFLP、RAPD、SSR和同工酶标记构建大白菜连锁图谱 , 由结果可知多态性检出
效率 : AFLP > SSR > RAPD。说明 AFLP是一种多态性丰富 , 高通量的分子标记类型 , 对于构建图谱
和增加图谱密度是高效的。这与 McGregor〔16〕的试验结果一致。
本研究所得到的大白菜遗传图谱总长度为 82613 cM , 约为 Song等〔1〕 (1850 cM , 280个标记 ) 和
Teutonico等〔2〕 (1785 cM , 139个标记 ) 所构建图谱的 1 /2。笔者认为图谱大小除与基因组大小有关
外 , 尚与所用材料和群体的种类有关。构建的遗传图谱大小与作图群体双亲间遗传差异的大小密切相
关 , 当双亲间遗传距离大 , 差异位点多 , 且在染色体上分布均匀时 , 构建的遗传图谱较长 , 也更接近
基因组实际。本研究中采用 912112和 T12219两个大白菜品种间杂交产生的 DH群体为作图群体 , 是
导致覆盖基因组较小的原因之一。此外 , 由于本研究中的主要标记为 EcoR I2M se I AFLP标记 , 其在染
色体上的簇状排列可能是导致基因组覆盖面积小的又一原因。EcoR I2M se I AFLP标记检测的位点多聚
集在着丝粒两侧甲基化较高的重复序列区域 , 标记聚集而形成 “簇 ”, 这种现象可能与异染色质区重
组率低有关。该缺陷可以利用不同分子标记特性的互补来弥补 , 如 Pst I2M se I AFLP标记 , Pst I可以在
非甲基化的常染色质区识别酶切位点 , 另外在连锁图中增加 RFLP标记可以增加标记在染色体上分布
的均匀性和图谱的稳定性。
本研究中偏分离标记的频率 ( 4510% ) 比芸薹属其他研究 ( Teutonico 等 , 23% ; Chyi等 ,
24% )〔2, 17〕中的频率高。异常分离现象在自然界中普遍存在 , 在远缘杂交组合的分离群体及 DH和 R I
群体中尤为明显。导致偏分离现象的原因很多 , 主要有 : (1) 由配子体或孢子体不同发育阶段基因
型的选择所造成。A jisaka等〔18〕曾对 B 1cam pestris的游离小孢子培养过程中 F2代单株胚状体发生能力
与 RAPD标记分离相关性进行研究。结果表明 , 多数 RAPD标记出现偏分离频率与胚状体发生能力成
正相关 , 这从一个侧面证实了配子体或合子的选择性是形成偏分离的主要原因。 (2) 由小孢子培养
和植株再生过程的选择压造成。DH群体来自雄配子体的花粉培养 , 花粉培养导致的偏分离可能偏向
高花粉培养反应能力的亲本 , 这在玉米和白菜的 DH群体中已有报道〔19, 22〕。 (3) 由于遗传搭车效应 ,
与影响偏分离的遗传因子紧密连锁的分子标记表现为严重的偏分离。 (4) 与 F2群体相比 , DH群体中
隐性有害基因的选择压增大 , 很可能导致偏分离的发生。此外 , 环境因素和群体的随机效应也会引起
偏分离。对芸薹属作物曾有偏分离标记集中分布于某几个连锁群的特定区域内 , 并明显偏向某一亲本
型的研究报道 〔20〕。本研究中 , LG2、LG3、LG8和 LG9上的偏分离标记全部偏向 912112, LG6上的
偏分离标记全部偏向 T12219, 该结果与 Moriguch〔21〕的研究结果相似。利用 JoinMap 310中软件构建连
锁图谱 , “Map”命令对每个连锁群根据标记间连锁的紧密程度进行 1～3次不等的标记添加 , 对于含
有较多偏分离标记的连锁群不宜采用经过 3次添加才构成的 , 以选取第 2次添加后所得的连锁群为
宜 , 这样既可避免丢失有效标记 , 又可避免由于过多添加偏分离标记导致连锁图失去真实性。
综上所述 , 对于具有重要经济价值的大白菜来说 , 构建一张永久高密度的遗传连锁图具有重要的
意义。本研究采用永久群体 (双单倍体群体 )、利用 AFLP、RAPD、SSR和同工酶等多种分子标记构
建了高密度大白菜分子遗传图谱 , 标记间的平均距离只有 210 cM , 可为今后进行白菜重要性状精细
的 QTL (数量性状位点 ) 定位作参考。
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