全 文 ：园 　艺 　学 　报 　2001 , 28 (4) : 295～300
Acta Horticulturae Sinica
收稿日期 : 2001 - 02 - 13 ; 修回日期 : 2001 - 04 - 23
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 (39770526)
柑桔 L EAFY同源基因片段分离及特性研究
陈大明　金勇丰　张上隆
(浙江大学园艺系 , 杭州 310029)
摘　要 : 根据不同植物 L EAFY ( L FY) 同源基因 3’端序列高度保守性 , 设计合成简并引
物 , 采用 PCR 技术首次从柑桔基因组 DNA 中分离出一条长 883 bp 的柑桔 L FY 同源基因
( csL FY) 片段。序列分析表明 , 所扩增的 883 bp DNA 片段中包含一个长 476 bp 的内含子 , 拼
接位点与其他植物的 L FY 同源基因一致。由外显子推导的氨基酸序列与其它植物 L FY 同源基
因的相应区域氨基酸序列同源性为 77 %～97 % , 其中与烟草 NFL 和矮牵牛 AL F 的同源性最
高 , 达到 97 %。RT—PCR 研究表明 , csL FY 在柑桔成年结果枝上的花芽和营养芽以及童期幼
苗的营养芽中均有表达 , 但童期营养芽中的表达强度明显低于花芽。
关键词 : 柑桔 ; 童期 ; 开花 ; L EAFY ; 基因
中图分类号 : S 666 ; Q 781 　文献标识码 : A 　文章编号 : 05132353X (2001) 0420295206
作为花分生组织特征基因 , L EA FY ( L FY) 控制拟南芥花序梢分生组织向花分生组织
的转变〔1〕。转基因研究〔2〕表明 L FY 组成型表达可以将拟南芥所有侧梢转变成单花芽 , 从
而诱导植株提早开花。L FY 的这种作用不仅对于拟南芥本身有效 , 而且对于多年生木本植
物欧洲山杨同样有效〔2〕。Blazquez 等〔3〕研究发现 , L FY 基因在拟南芥营养生长阶段已有微
弱表达 , 在花分化启动时间点 (第 7 天) 表达开始增强 , 最终在花分生组织中得到很强的
表达。L FY 的表达水平被认为是开花转变的关键因子。
亲缘关系很远的植物种类的花分生组织特征基因具有很高同源性 , 现已分离克隆的
L FY同源基因有金鱼草 FLO〔4〕、烟草 N FL〔5〕、花椰菜 BOFH〔6〕、水稻 RFL〔7〕、辐射松
N EEDL Y〔8〕和蓝桉 EL F1 与 EL F2〔9〕等。比较发现 , 上述基因所编码的蛋白质氨基酸序列同
源性高达 70 % , 特别是 C端氨基酸序列极其保守。柑桔、梨等木本果树中也存在单拷贝
的 L FY 同源基因〔10〕。比较多年生木本果树与拟南芥等一、二年生草本植物开花过程 , 发
现最大的差异在于木本果树实生苗在具备开花能力之前通常需要经历一段很长的营养生长
期 , 即童期 , 在这一阶段中任何技术措施均不能诱导实生苗开花〔11〕, 这是木本果树所特
有的 , 可能与木本果树童期阶段 L FY 表达与否或表达强弱关系十分密切。本试验分离了
柑桔 L FY 同源基因的 3’端片段 , 并对 L FY 在柑桔芽中表达情况作了初步研究。
1 　材料与方法
1. 1 　材料
大山岛脐橙 ( Citrus sinensis Osbeck) 幼叶取自浙江大学华家池校区果树盆栽场。
1. 2 　方法
1. 2. 1 　柑桔基因组 DNA 制备 　按照陈大明等〔12〕所述方法提取。
1. 2. 2 　PCR 扩增 　根据拟南芥 L FY、金鱼草 FLO、烟草 N FL 、花椰菜 BOFH、水稻 RFL
等基因所编码的氨基酸序列同源性 , 选择了位于 C 端的保守序列 EVARGKKN 和 WYVP2
TKLR 分别设计合成 5’端引物 (5’2GAA/ GGTGGCGCGCGTGGG/ CAAA/ GAAGAA23’) 和 3’
端引物 (5’2CGGAGC/ TTTGGTGGGC/ AACA/ GTACCA23’) 。以柑桔基因组 DNA 为模板 , 用
5’端引物和 3’端引物进行 PCR。100μL PCR 反应体系 ( Tris 10 mmol/ L , pH 8. 3 , KCl
50 mmol/ L , MgCl22. 5 mmol/ L) 中 , 含柑桔基因组 DNA 50 ng , 5’端引物和 3’端引物各 0. 8
μmol/ L , 4 种 dNTP 各 200μmol/ L , 2. 5 单位 Taq DNA 聚合酶。30 个循环 , 循环条件为
94 ℃变性 50 s , 55 ℃退火 70 s , 72 ℃延伸 150 s。PCR 扩增产物在 1. 5 %琼脂糖凝胶中电泳
检测。重组质粒鉴定的 PCR 反应体系中 , 含有 20 ng 重组质粒 DNA , 其余条件同上。
1. 2. 3 　Southern 杂交 　用碱性缓冲液 (NaOH 0. 4 mol/ L) 将 PCR 产物从琼脂糖凝胶中转
移到 BIO BLOT + 尼龙膜 (Amresco) 上。探针为 pBTLFY10 质粒 DNA〔10〕, 采用 PCR 法标
记〔13〕。杂交在 6 ×SSC、5 ×Denhardt’s、0. 5 % SDS、100μg/ mL 鲑鱼精子 DNA、50 %甲酰
胺杂交液中 42 ℃下进行。在 2 ×SSC溶液中室温洗膜两次 , 各 30 min。放射自显影。
1. 2. 4 　目的片段克隆 　PCR 产物采用 WizardTM PCR Preps DNA Purification System (Promega)
进行回收和纯化 , 与 50 ng p GEM2T载体 (Promega) 在 T4 DNA 连接酶作用下连接。连接产
物转化大肠杆菌 TG1 菌株感受态细胞 , 在LB/ Amp/ IPTG/ X2gal 平板上筛选重组子。重组质
粒进一步用 PCR 和限制性内切酶酶切鉴定。
1. 2. 5 　序列分析 　采用双脱氧终止法 , PE 公司 377 型自动测序仪测定重组质粒 DNA 序
列。
1. 2. 6 　RNA 制备 　从刚萌动的成年柑桔 (广柑) 枝条上取花芽、营养芽以及一年生实生
苗中取尚处于童期的营养芽 , 其总 RNA 采用 Trizol 一步提取法 (Life Technologies) 制备。
1. 2. 7 　RT2PCR 　2 pmol Oligo (dT) 15引物与 5μg 总 RNA 退火 , 在 SuperscriptTM II Rnase H -
逆转录酶 (Life Technologies) 作用下合成单链 cDNA。1μL 逆转录反应混合液用于 PCR 反
应。PCR 所用引物系根据上述测序结果设计的柑桔 L FY 同源基因 ( csL FY) 特异性引物 ,
上游引物为 5’2TACGA GCACTGCCGTGATTT23’, 下游引物为 5’2TCAAGACTGGGATGAG
CATT23’。反应条件 : 94 ℃预变性 5 min , 35 个循环 , 循环条件为 94 ℃变性 40 s , 53 ℃退火
40 s , 72 ℃延伸 60 s , 循环结束后 72 ℃继续延伸 5 min。PCR 产物在 1 %琼脂糖凝胶中电泳
分离 , 印迹到尼龙膜上 , 以　32 P 标记的 csL FY 片段为探针 , 进行杂交 , 杂交条件同上 , 采
用高严紧洗膜。
2 　结果
2. 1 　柑桔 L FY同源基因片段的分离和克隆
为了从柑桔中分离 L FY 同源基因 , 根据拟南芥 L FY、金鱼草 FLO、烟草 N FL 、花椰
菜 BOFH 和水稻 RFL 等基因所编码的氨基酸序列的保守区设计合成了一对简并引物 , 利
用 PCR 技术从柑桔基因组 DNA 中分离 L FY 同源基因片段。PCR 结果如图 1 , A 所示 , 扩
增出一条长度大约 900 bp 的 DNA 片段。为了验证这一片段是否为 L FY 同源基因片段 , 以
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　　　　拟南芥 L EA FY 基因片段〔10〕为探针对 PCR
产物进行 Southern 杂交 , 结果如图 1 , B 所
示 , 证明所扩增的DNA 片段确为 L FY 同源
基因片段。
该片段与 p GEM2T 载体连接 , 获得了
两个重组质粒 , 分别命名为 csL FY9003 和
csL FY9005 , 选择 csL FY9003 做进一步鉴定。
以 csL FY9003 DNA 为模板 , 用上述两个引
物进行 PCR 反应 , 得到了与柑桔基因组
DNA 的 PCR 产物大小完全一样的 DNA 片
段 (图 2 , A) , 说明 PCR 扩增的 DNA 片段
已克隆到 p GEM2T 载体中。KspI 和 Pst I 双
酶切从 csL FY9003 DNA 中释放出一条与
PCR 产物长度相当的 DNA 片段 (图 2 ,
B) 。
图 1 　柑桔 L FY同源基因片段的 PCR扩增
A. PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果 , B. Southern 杂交
结果 , 探针为拟南芥 L FY 基因片段。1. GeneRulerTM
100 bp DNA Ladder Plus , 2. PCR 扩增产物。
Fig. 1 　PCR amplification of a fragment of the L FY
homologue from citrus
A. Agarose gel electrophoresis analysis of the PCR products.
B. Southern blotting analysis of the PCR products probed with
a L FY fragment . 1. GeneRulerTM 100 bp DNA Ladder Plus ,
2. PCR products.
图 2 　csL FY9003 的鉴定
A. PCR 分析　1. GeneRulerTM 100 bp Ladder Plus , 2. 阳性对照 : 柑桔基因组 DNA 的 PCR 扩增产物 ,
3. 阴性对照 : p GEM25zf ( + ) 作为模板的 PCR 结果 , 4. csL FY9003 克隆的 PCR 结果。B. KspI 和 Pst I 酶切
1. GeneRulerTM 100 bp Ladder Plus , 2. p GEM25zf ( + ) / Ksp I + Pst I , 3. csL FY9003/ Ksp I + Pst I.
Fig. 2 　Analysis of the csL FY9003 clone
A. PCR analysis 　1. GeneRulerTM 100 bp Ladder Plus , 2. PCR products amplified from citrus genomic DNA as positive control ,
3. PCR results of the p GEM25zf ( + ) vector as negative control , 4. PCR products amplified from the csL FY9003 clone.
B. Restriction digestion of the csL FY9003 clone by Ksp I and Pst I together 　1. GeneRulerTM 100 bp Ladder Plus ,
2. p GEM25zf ( + ) / Ksp I + Pst I , 3. csL FY9003/ Ksp I + Pst I.
2. 2 　序列比较
csL FY9003 的测序结果如图 3 所示 , 该DNA 片段长 883 bp , 位于 L FY 基因的 3’端。利
用 BCM Gene Finder 主页 (http : / / dot . imgen. bcm. tmc. edu : 933I/ gene2finder/ gf . html) 上的
SPL (search for potential splice sites) 程序对该序列进行分析 , 发现其中含有一个长 476 bp
的内含子 , 拼接位点如图 3 中箭头所示 , 供体位点位于第 124 个核苷酸 , 受体位点位于第
7924 期 　　　　　　　　　陈大明等 : 柑桔 L EAFY 同源基因片段分离及特性研究 　　　　　　　　　
600 个核苷酸 , 拼接位点的位置与其它植物的 L FY 同源基因完全一致 , 但内含子长度相互
间差异很大 , 如拟南芥在这一位置的内含子长度为 910 bp。
根据外显子序列推导的氨基酸序列与烟草 N FL1 (U16172) 、N FL2 (U16174) , 矮牵牛
AL F ( AF030171 ) 、 Populus balsamifera ( U93196 ) 、金鱼草 FLO ( M55525 ) 、豌豆 UNI
(AF010190) 、水稻 RFL (AB005620) 、蓝桉 EL F1 (AF034806) 、辐射松 PrFLL (U92008) 、
　　　　　　
图 3 　csL FY9003 克隆的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
箭头所指位置为拼接位点。
Fig. 3 　Nucleic acid sequence and deduced amino acid sequence of csL FY9003 clone
The two arrowheads above the sequence indicate the splice donor and acceptor site respectively.
图 4 　不同植物 L FY同源基因氨基酸序列比较3 表示相同的氨基酸基团
Fig. 4 　Sequence comparison of L FY like proteins3 Represents identical residue
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NL Y ( U76757) , 花椰菜 BOFH ( Z18362)
等蛋白的相应区域氨基酸序列同源性为
77 %～97 % (图 4) ; 核苷酸序列同源性在
80 %左右。
2. 3 　csL FY在柑桔不同类型芽中的表达
利用 RT—PCR 技术初步研究了成年结
果母枝上花芽和营养芽以及童期幼苗上的
营养芽中 csL FY 的表达情况 , 结果如图 5
所示 , 3 种类型芽中均有 L FY 基因表达 ,
其中以花芽中表达最强 , 而在童期芽中表
达较弱。
3 　讨论
图 5 　柑桔童期营养芽 ( JB) 、成年营养芽 ( AV)
和花芽 ( FB) 中 csL FY表达的 RT—PCR分析
Fig. 5 　RT—PCR analysis of csL FY transcripts
level in the juvenile buds ( JB) , adult vegetative
buds ( AV) and flower buds ( FB) in citrus
　　本研究中 , 我们从柑桔基因组 DNA 中分离出了 L FY 同源基因 3’端的一个片段 , 序列
分析表明它与其它植物的 L FY 同源基因有极高的同源性 , 特别是与烟草 N FL1、2 , 矮牵
牛 AL F , 金鱼草 FLO、豌豆 UNI、拟南芥 L FY 等基因相应区域编码的氨基酸序列同源性
高达 91 %～97 % , 这种结构上的高度相似性使我们有理由推测它们在功能上的相似性。
对拟南芥 L FY 基因已有十分深入的研究 , 作为花分生组织特征 (或开花启动过程) 基因 ,
控制开花转变过程 , 它是所有花特异性表达基因中表达最早的基因 , 并且也是对分生组织
特征影响最大的基因 , 说明 L FY 与花分化过程的最初步骤有关。因此 , csL FY 基因分离对
于深入探索柑桔花分化过程控制机制具有重要意义。
观察到 csL FY 在童期的营养芽和成年营养芽中均有表达 , 但表达水平低于花芽 (图
5) , 这一结果与 Kelly 等〔5〕、Mouradov 等〔8〕和Blazquez 等〔3〕分别在烟草、辐射松和拟南芥上
观察到的结果相一致。拟南芥中 L FY 在叶原基中呈低水平表达 , 环境信号和植株年龄对
L FY 表达具有调节作用。通过增加 L FY 拷贝数 , 提高 L FY 表达水平可以加速开花 , 说明
在转录水平上对 L FY 表达的调节是决定拟南芥开花时间的一个十分重要的因素。
处于营养生长阶段或童期的分生组织对 L FY 活性的响应能力有可能是某些植物种类
(如烟草等) 开花转变的主要控制点。尽管烟草的 L FY 同源基因 N FL 在营养生长阶段呈组
成型表达〔5〕, 但 N FL/ L FY 仍可能在花分化过程中发挥作用 , 因为拟南芥 L FY 基因在烟草
中过度表达诱导烟草植株提早开花。高水平的 L FY 活性可能可以弥补幼苗阶段的低响应
能力。
柑桔等木本果树通常从种子萌发到第 1 次开花需要经过数年时间 , 这段时间被称为童
期 , 在这一阶段植株通常不能被诱导开花。由于 csL FY 在童期芽中表达 , 因此导致童期植
株不能开花的原因可能有两种 , 一种是分生组织中 L FY 表达不能达到一定的水平 , 另一
种可能是处于童期的分生组织对 L FY 活性的响应能力极低 , 详细作用机理有待研究。
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Cloning and Characterization of the L EAFY Homolog in Citrus
Chen Daming , Jin Yongfeng , and Zhang Shanglong
( Horticultural Department , Zhejiang University , Hangzhou 310029)
Abstract : A pair of degenerate oligonucleotides to highly conserved regions at the 3’terminus of
L EA FY ( L FY) gene and its homologues , the flower meristem identity genes , is used to amplify a
fragment of 883 bp by PCR from the citrus genomic DNA. Sequencing indicated that there is an intron
of 473 bp in the fragment . The splice donor site and the splice acceptor site are in identical position to
the L FY gene and its homologues. The amino acid sequence deduced from the exons is 77 % - 97 %
homologous to that of the corresponding regions of L FY and its orthologues. The expression patterns of
the citrus L FY homolog ( csL FY) were analyzed by RT2PCR. The result indicates that csL FY
expression was detected in vegetative and flower buds from the adult tree as well as vegetative buds
from the several month old seedlings. However , the level of the csL FY transcripts in the juvenile buds
is lower than in the flower buds.
Key words : Citrus ; Juvenile period ; Flowering ; L EA FY; Gene
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