全 文 ：第 18 卷 第 2 期
Vol. 18 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 3 月
Mar . 2010
紫花苜蓿花粉生活力测定方法研究
陈 晶1, 张月学2* , 唐凤兰2 , 刘凤歧2 ,韩微波2, 刘杰淋2 , 陈积山2 , 尚 晨2 , 张海玲2
( 1. 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院生物工程与技术系, 黑龙江 哈尔滨 150025;
2.黑龙江省农业科学院草业研究所, 黑龙江 哈尔滨 150086)
摘要 : 为找到快速而有效地测定紫花苜蓿( Med icago sativa L. )花粉生活力的方法,本文通过碘-碘化钾染色、氯化
三苯基四氮唑( TT C)染色、红墨水染色以及花粉离体培养萌发 4 种方法测定紫花苜蓿花粉的生活力。结果表明:
前 3种染色的方法不能准确快速的测定肇东苜蓿花粉生活力,离体培养萌发法中的琼脂法和悬滴法可以快速而准
确的测定肇东苜蓿花粉的生活力。琼脂法和悬滴法培养花粉 1. 5h 其萌发率最高,平均萌发率为 55% ,但悬滴法更
加快捷方便,萌发率是 54% , 最适宜的浓度为蔗糖 10% , 硼酸 0. 015%。
关键词:紫花苜蓿花粉; 生活力;离体培养; 萌发率
中图分类号: S541; Q944. 42 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 02-0297-05
Methodology Study on Measurement of Alfalfa Pollen Vitality
CHEN Jing
1
, ZHANG Yue-xue
2
, TANG Feng- lan
2
, L IU Feng-qi
2
, HAN We-i bo
2
,
LIU Jie- lin
2
, CHEN J-i shan
2
, SHANG Chen
2
, ZHANG H a-i ling
2
( 1. Departm ent of Biological E ngineering an d T echnology, College of Life Science and Techn ology, H arb in Norm al Un iversity,
H arbin, Heilongjiang Pr ovin ce 150080, Ch ina; 2. Inst itute of Pratacu ltural S cien ces , H eilongjian g Academy
of Agricultural Sciences, Harbin, H eilon gjiang Province 150086, China)
Abstract: The aim of this paper w as to f ind out a quick and effect ive method for pollen v itality measure-
ment o f alfalfa. T he candidate methods tested in this paper w ere I2-KI dyeing , TT C dyeing, r ed ink dye-
ing, and in v it ro g erm inat ion. T he results show that the former thr ee dyeing methods couldnt accomplish
the target . Among in vit ro g erminat ion methods, agar and hang ing drop realized the quick and ef fect ive
measurement o f alfalfa pollen vitality; especially the germ inat ion rate of the pol len cult ivated for 1. 5 h
reached to an average of 55% . How ever , the hanging drop method w as quicker and mo re convenient and
its g erminat ion rate could reach to 54% . T he optimal nutr ient solut ion contained 10% sucrose and 0. 015%
bo ric acid.
Key words: Alfalfa pol len; V itality; Isolated culture; Germination rate
花粉生活力是花粉具有存活、生长、萌发或发育
的能力,在常规育种中,为了进行人工辅助授粉或杂
交授粉,需要早期采集和贮存花粉,尤其是在杂交育
种工作中,研究花粉的生活力和育性是必不可少的
基础性工作[ 1]。紫花苜蓿(M edicago sat iv a L. , 以
下简称苜蓿)属严格的异花授粉植物, 自交结实率
低[ 2] , 苜蓿花粉质量对其结实率及种子品质都有一
定的影响,因此需要找到快速而有效地测定苜蓿花
粉生活力的方法。
测定花粉生活力的方法主要有室内形态测定
法[ 3]、染色法包括碘-碘化钾染色[ 4] 、T T C染色 [ 4, 6]、
红墨水染色[ 5]和荧光染料反应法 [ 7]、萌芽测定法包
括离体萌发测定法和活体萌发测定法[ 8] 、田间授粉
测定法 [ 9]。但目前国内外对苜蓿花粉生活力的测定
并没有一个系统性的研究。本文主要通过碘-碘化
钾染色、氯化三苯基四氮唑( T TC)染色、红墨水染
色以及离体萌发 4种方法, 以肇东苜蓿( M. sativa
L. cv. Zhaodong)为研究对象, 对其花粉生活力进
行测定,并对结果进行比较分析,以期找到一种测定
苜蓿花粉生活力的快速而准确的方法, 为雄性不育
株的选育,提高杂交的结实率以及揭示内外因素对
花粉育性及结实率的影响奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 实验材料和地点
肇东苜蓿花粉, 2009年 8月初取自黑龙江省农
业科学院草业研究所试验田。位于黑龙江省农业科
收稿日期: 2009-09-28;修回日期: 2009- 11-06
基金项目:牧草现代产业技术体系研究与建立( nyhyzx07-022) ,小宗作物空间环境诱变育种关键技术研究与示范( 2008BAD97B07) ,黑龙
江省农科院创新工程资助项目( 200705)
作者简介:陈晶( 1984- ) ,女,黑龙江哈尔滨人, 硕士研究生,研究方向为牧草遗传育种; * 通讯作者 Auth or for correspondence, E- mail :
zyx nky@ 163. com
草 地 学 报 第 18卷
学院实验地, 126b37cE、45b41cN, 海拔 169 m , 年平
均日照时数 2670 h,年总辐射量 111. 55 @ 104 KJ #
m
- 2
, \10 e 的积温平均为 2421. 6 e , 年无霜期 119
- 146 d,年平均降水量 569. 1 mm,属中温带大陆性
季风气候。
1. 2 实验方法
对肇东苜蓿花粉进行 4 种不同处理方法,在 10
@ 10显微镜下观察,计数时每种处理观察 300个花
粉粒,重复 3次,然后对实验数据进行统计分析。实
验用药品为化学分析纯。
1. 2. 1 碘-碘化钾染色法: 取 1 g 碘化钾溶于 5 mL
蒸馏水中, 然后加入 0. 5 g 碘, 再加蒸镏水稀释到
100 mL,室温下避光保存于棕色瓶中备用 [ 5, 10]。取
一张干净的载玻片, 用镊子轻轻挤压苜蓿花龙骨瓣,
使龙骨瓣张开, 花粉自然弹落于载玻片上。滴一滴
I2-KI于花粉上, 用解剖针混合均匀, 盖上盖玻片, 经
5 min染色后,在显微镜下观察。凡是被染成蓝色的均
为有活力的花粉粒,呈黄褐色的为活力弱的花粉粒。
花粉生活力( % ) = 变色的花粉数目/花粉粒总
数@ 100%
1. 2. 2 改良氯化三苯基四氮唑染色法( TT C 法) :
称取 1. 673 g 十二水磷酸氢二钠和 0. 273 g 磷酸氢
二钾溶解于 100 mL 的蒸馏水, 调至 pH 值为 7. 17
后。称取 0. 03 g T T C溶解在 10 mL 磷酸盐缓冲溶
液中,后放于棕色瓶中于暗处保存待用[ 4, 6] , 此溶液
为溶液Ñ。改良 TT C 法在溶液 Ñ中加入 200 g/ L
PEG4000
[ 10] 。取苜蓿花粉方法如 I2-KI 法, 滴一滴
改良的 T TC 染色液,在 25 e - 35 e 下染色 20- 30
m in,显微镜下观察。有活力的花粉粒呈红色,淡红
色次之,无活力的花粉粒无色。
测定花粉粒活性公式:
花粉生活力(%) = 变色的花粉数目/花粉粒总数@ 100%
1. 2. 3 红墨水染色法:红墨水 5 mL 加蒸馏水稀释
到 100 mL, 取花粉方法与 I2-KI 法相同, 滴一滴红
墨水染色液,染色 15 min。凡是被染成红色的花粉
为无活力的花粉, 而未被染色的为有活力花粉, 染成
淡红的花粉粒的活力次之,以染色率表示花粉的败
育率[ 5, 11]。
花粉败育率( %) = 变色的花粉数目/花粉粒总
数 @ 100%
1. 2. 4 花粉粒的离体萌发法:离体培养萌发有多种
方法,主要有井式法、点式法、琼胶法和悬滴法[ 12]。
本文选用了琼胶法: 固体的 B5培养基和蔗糖硼酸
培养基; 悬滴法。萌发的花粉是以花粉管长度超出
花粉直径为准。
萌发率( % ) = 萌发的花粉数/花粉粒总数@ 100%。
琼胶法的离体培养: 选用固体的 B5 培养基和
蔗糖硼酸培养基, 其中蔗糖硼酸培养基为蔗糖
10%,硼酸 0. 015% ,琼脂 1%。其方法:在载玻片上
滴一滴培养基,使其表面平整,待稍凝后。以不同花
粉接种方式将花粉均匀撒在培养基的表面 (见表
1) ,然后将载玻片放于铺有潮湿滤纸的培养皿中,盖
上培养皿盖。每隔 0. 5 h观察一次, 共观察 4次,进
行计数统计和方差分析。
表 1 实验培养基和接种方式的处理
Table 1 Cultur e medium and inoculation manner in this study
方法
Method
固体培养基种类
Variety of s olid m edium
花粉接种方式
Pollen inocu lat ion manner
1
B5培养基
B5 cultur e medium
花粉用发丝播撒在培养基表面
Pollen was spr ead on the su rface of th e medium by hair
2
B5培养基
B5 cultur e medium
花粉用少量蒸馏水稀释滴在培养基表面
Pollen diluted w ith a lit t le of dist il led w ater w as dropped on th e surface of the m edium
3
蔗糖硼酸培养基
Acid su crose m edium
花粉用发丝播撒在培养基表面
Pollen was spr ead in the su rface of th e medium by the h air
4
蔗糖硼酸培养基
Acid su crose m edium
花粉用少量蒸馏水稀释滴在培养基表面
Pollen diluted w ith a lit t le of dist il led w ater w as dropped in the surface of the m edium
5
蔗糖硼酸培养基
Acid su crose m edium
花粉用含 10%蔗糖、0. 015%硼酸的溶液稀释后滴在培养基表面
Pollen diluted w ith 10% sucrose an d 0. 015% boric acid w as dropped on the surface of the medium
悬滴法:将花粉撒于干净载玻片上,滴上蔗糖硼
酸培养液( 0. 015%硼酸) ,试验中培养液采用不同的
蔗糖浓度: 10%、15%、20%、25%。将载玻片置于铺
有潮湿滤纸的培养皿中, 盖上皿盖。每隔 0. 5 h 观
察一次,共统计 4 次, 对实验数据进行统计和方差
分析。
298
第 2期 陈晶等:紫花苜蓿花粉生活力测定方法研究
2 结果与分析
2. 1 碘-碘化钾染色法
用此方法染色的苜蓿花粉短时间内呈黄棕色,
虽有深浅之分, 但不可见明显蓝色。放置 15h 以上
可见花粉粒变蓝,但此时 I2-KI 已干涸, 花粉失去活
性。这可能由于苜蓿花粉中淀粉含量不高或花粉粒
外壁较一般花粉厚, 溶液不易进入。此法耗时长, 且
易造成有活性花粉计数偏高, 与真实值差异较大, 并
不适用于苜蓿花粉活力的测定。
2. 2 改良的 TTC染色法
此方法染色的苜蓿花粉 30 min 后显微镜下观
察,除干瘪的花粉粒外, 大部分呈淡黄色, 没有见到
明显变红的花粉粒。当培养时间超过 5 h, 乃至更
长时间,可见部分变为红色。但此时培养液早已干
涸, 花粉已失去活性。改良后的 TT C 溶液 Ò,
PEG4000可增加溶液的通透性,但对于苜蓿花粉效
果不大,如果按照淡黄色计数结果可能偏高, 若按照
红色花粉粒计数结果可能偏低, 因此认为 T T C 染
色法也不适用于苜蓿花粉活力的测定。
2. 3 红墨水染色法
此法培养的苜蓿花粉可见被染成红色的花粉粒
以及外围被染色的淡粉色花粉粒,干瘪花粉粒亦不
被染色。但人眼对颜色的差异亦有差别, 因此此法
计数因人而异, 对于有活性的花粉,容易造成较大误
差。培养液杂质较多, 被染色的红色花粉粒四周模
糊,易与其它花粉粒粘连成一片, 不易计数, 因此红
墨水染色法也不适用于苜蓿花粉生活力的测定。
2. 4 苜蓿花粉离体萌发法
2. 4. 1 琼胶法中花粉不同苜蓿接种方式的结果
(表 2)。
表 2 不同培养方法的花粉萌发率
Table 2 Po llen germination rate by different cultivation methods
方法(具体操作见表 1)
Meth od( r efer to T ab le 1)
萌发率
Germin at ion rate ( % )
方法 1
M ethod 1
花粉成团不便于计数
Pollen conglobat ion did not facilit ate the counting
方法 2
M ethod 2
23. 47
方法 3
M ethod 3
花粉成团不便于计数
Pollen conglobat ion did not facilit ate the counting
方法 4
M ethod 4
24. 69
方法 5
M ethod 5
55. 37
实验结果表明,方法 1和 3观察到花粉成团(图
1: A) ,计数不清,这与苜蓿花粉本身粘性较大有关。
方法 2、4、5中花粉较为分散, B5培养基的花粉萌发
率明显低于蔗糖硼酸培养基的花粉萌发率, 方法 5
所得的萌发率最高, 通过对方法 5的观察结果进行
方差分析(表 3)。
表 3 蔗糖硼酸培养基中不同培养时间的
苜蓿花粉萌发率及方差分析
Table 3 Germination rate of alfalfa pollen at different culture
time in sucrose and boric acid medium and variance analysis
培养时间
Cu lture
tim e
重复
Repet it ion
萌发率
Germin at ion
rate
平均萌发率
Averag e
germin at ion rate
差异显著性
Dif ference
signif icance
(A= 0. 01)
0. 5 h 1 19. 98% 20. 18% C
2 20. 54%
3 20. 03%
1. 0 h 1 49. 16% 49. 47% B
2 50. 88%
3 48. 37%
1. 5 h 1 55. 67% 55. 24% A
2 55. 08%
3 54. 98%
2. 0 h 1 55. 37% 55. 13% A
2 54. 86%
3 55. 15%
苜蓿花粉在蔗糖硼酸培养基中, 20 min 左右开
始萌发; 0. 5- 1. 5 h 内萌发率逐渐升高, 在 0. 01水
平差异极显著, 花粉管逐渐伸长; 1. 5- 2 h 萌发率
趋于平稳,在 0. 01 水平没有差异显著性(图 1: B-
E)。培养 1. 5 h之后, 花粉管伸长过长,不易观察计
数。因此蔗糖硼酸培养基培养苜蓿花粉 1. 5 h, 在
显微镜下观察计数, 可以准确而有效的测定苜蓿花
粉粒活性。
2. 4. 2 悬滴法不同蔗糖浓度观察结果(表 4)。
表 4 不同蔗糖浓度对花粉萌发率的影响
Table 4 Effect of sucrose concentration on pollen germination rate
培养液
Cu lture
f luid
蔗糖浓度
Su crose
concentration
硼酸浓度
Boric Acid
concent ration
萌发率
Germinat ion
rate
差异显著性
Dif feren ce signi ficance
A= 0. 05 A= 0. 01
1 10% 0. 015% 54. 53% a A
2 15% 0. 015% 45. 35% b AB
3 20% 0. 015% 41. 72% b B
4 25% 0. 015% 48. 11% ab AB
培养苜蓿花粉 1. 5 h, 统计结果表明, 培养液 1
的萌发率最高,其次为 4 和 2, 3 的萌发率最低。培
养液 1和 4的萌发率差异不显著; 1和 2 差异显著;
299
草 地 学 报 第 18卷
1和 3 差异极显著。可见, 最适宜的浓度为蔗糖
10% ,硼酸 0. 015%。
采用 10%蔗糖和 0. 015%硼酸浓度的悬滴法培
养苜蓿花粉,对培养不同时间的花粉萌发率结果进
行统计和方差分析, 见表 5。
表 5 悬滴法不同培养时间的花粉萌发率及方差分析
Table 5 Germination rate of a lfalfa po llen at different
cultur e t ime by hang ing drop method and variance analysis
时间
Cultur e
t ime
重复
Repetit ion
萌发率
Germinat ion
rate
平均萌发率
Average
germinat ion rate
差异显著性
Difference
s ignifi can ce
( A= 0. 01)
0. 5 h 1 23. 44% 23. 44% C
2 24. 57%
3 22. 31%
1. 0 h 1 50. 85% 49. 90% B
2 49. 09%
3 49. 77%
1. 5 h 1 54. 38% 54. 53% A
2 55. 01%
3 54. 20%
2. 0 h 1 54. 93% 54. 56% A
2 54. 63%
3 54. 11%
用悬滴法培养的苜蓿花粉 20 m in左右开始萌
发; 0. 5- 1. 5 h内萌发率逐渐升高, 在 0. 01水平下
差异极显著,花粉管伸长; 1. 5- 2 h 萌发率趋于平
稳(图 1: F) ,在 0. 01水平下没有差异。因此 1. 5 h
为比较方便而准确的观测时间。悬滴法能够快速而
准确地测定苜蓿花粉萌发率, 且方法简便。
3 讨论
碘-碘化钾染色法、氯化三苯基四氮唑染色法
( TT C法)染色时间过长, 染色液易干涸, 会将已失
去活性的花粉染色,导致花粉萌发率的测定结果不
准确。T TC 法中改良的溶液 Ò加入了 PEG [ 10]。
PEG4000可增加内膜柔软性和通透性, 使染色液更
快进入花粉粒内, 但结果没有达到预期效果。红墨
水染色法极易上色, 但杂质过多,被染色的花粉四周
模糊,计数不清,造成测定值偏高。因此这 3种染色
方法统计花粉粒活性结果可能偏高或偏低, 不能准
确反应花粉粒的真实活性,这可能与其花粉壁较厚,
花粉粒较粘, 不易分散有关。李晓霞[ 13] 等人用
TT C法对几个紫花苜蓿的(亚)变种花粉进行活力
测定,得到相关数据,但此法在本实验中并没有达到
理想效果,可能和苜蓿品种、生长的地理位置以及取
材时间有关,需要进一步验证。
通过离体培养法来测定花粉生活力, 方法简便
准确,适合于多种植物,但不同植物的培养基类型和
其组分含量各不相同。例如矮牵牛 ( P etunia hy-
br id e )离体培养基为蔗糖150 g/ L + H 3BO 3 20 mg/
L+ CaCl2 10 mg/ L[ 14] , 小豆 ( Vigna ang ular i s )为
0. 0120% 硼酸+ 25% 蔗糖[ 15]、猕猴桃 ( A ct inidia
chinensis )为 10% 蔗糖+ 0. 015%硼酸 [ 16] 等。试验
中发现, B5培养基萌发率低,蔗糖硼酸培养基则较
为适用。本实验中所采用的培养基成分主要参照了
小豆、猕猴桃和桃( Amyg dalus p er sica L. )花离体
培养的基本培养基[ 15~ 17] 。做了大量预实验的结果
发现,离体培养中琼胶法( 10%蔗糖+ 0. 015%硼酸
+ 1%琼脂)和悬滴法( 10%蔗糖+ 0. 015%硼酸)是
可行的。结果表明,肇东苜蓿花粉萌发率 55. 24%、
54. 53%在 0. 01水平下没有差异, 所以认为这两种
方法都适用于苜蓿花粉生活力的测定。
考虑到悬滴法较琼脂法更为方便快捷, 对悬滴
法培养液的组分浓度进行进一步筛选得到最适宜的
浓度为蔗糖 10%, 硼酸 0. 015%。但此法也有一定
弊端,其培养液易干涸, 不适于长期培养, 对短时间
即可观察计数的植物比较适合; 培养液有一定的流
动性,对于观察同一视野下花粉粒不同时段的发育
情况并不适宜。认为可将含有一定比例蔗糖硼酸培
养液的花粉稀释液滴于稍凝的 1% 琼脂上, 可延长
干涸时间,便于观察同一视野下花粉粒的萌发过程,
更方便测定不同组分培养液对苜蓿花粉生活力的影
响,但此方法还有待进一步的研究验证。可见, 对于
不同种植物花粉粒的鉴定, 方法亦不相同。
4 结论
利用 4种方法对肇东苜蓿的花粉生活力检测,
结果表明, 碘-碘化钾染色、氯化三苯基四氮唑
( T T C)染色、红墨水染色 3种方法并不适合于肇东
苜蓿花粉生活力的测定, 而离体萌发法能够快速而
准确的测定其花粉生活力。其中 10% 蔗糖、
0. 015% 硼酸、1% 琼脂的琼胶法和 10% 蔗糖、
0. 015%硼酸的悬滴法,在培养苜蓿花粉 1. 5 h 时观
察统计,最能准确快速测定花粉生活力,但悬滴法更
加快捷方便。
300
第 2期 陈晶等:紫花苜蓿花粉生活力测定方法研究
图 1 离体萌发法中不同处理方式萌发的花粉
Fig . 1 Germinated pollen in vitro germ inat ion by different tr eatment methods
A:培养 1. 5 h时聚团的苜蓿花粉; B:琼脂法培养 0. 5 h花粉; C:琼脂法培养 1 h花粉;
D :琼脂法培养 1. 5 h花粉; E:琼脂法培养 2 h花粉; F:悬滴法培养 1. 5 h花粉。
( A~ E为 10@ 物镜下图片,图 F为 5@ 物镜下图片)
A : Crowded alfalfa pollen cultured for 1. 5 h in agar medium ; B: Pollen cultured for 0. 5 h in agar medium; C: Pollen cultured for 1. 0 h
in agar medium; D: Pollen cul tu red for 1. 5 h in agar medium; E: Pollen cul tu red for 2. 0 h in agar medium; F: Pollen cultu red
for 1. 5 h by h angin g drop meth od ( A to E w ere pictures un der 10@ object len s, F w as picture under 5@ ob ject lens)
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(责任编辑 米 佳)
301