全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 04-0328-05
利用RAPD技术分析内蒙古中东部草原
三种针茅的遗传关系
宋　涛, 林　枫, 赵念席, 王金龙, 任安芝, 高玉葆*
(南开大学生命科学学院, 天津　300071)
摘要: 利用 RAPD 分子标记技术对 14 份来自内蒙古中东部草原的贝加尔针茅( S tipa baicalensis Roshev . )、大针茅 ( S .
grandis P . Smirn. )和克氏针茅( S . kry lov ii Roshev. )进行遗传多态性分析。筛选出16个引物, 扩增出223 条DNA 片段,
其中多态性片段为184 条,多态性比率为 82. 51%。结果表明: 14 份材料呈现出明显的种间相似性, 同一种针茅首先聚在
一起; 每一种针茅都获得了其特有的RAPD 条带。
关键字: 针茅; RAPD ; 种质资源; 聚类分析
中图分类号: S 812; Q943　　　　文献标识码: A
RAPD Analysis on Three Stip a Spp. of the Middle and Eastern
Inner Mongolia Steppes
SONG T ao, LIN Feng, ZHAO Nian-xi, WANG Jin-long, REN An-zhi, GAO Yu-bao
( Co llege o f L ife Science, Nanka i Univ ersity , T ianjin 300071, China )
Abstract: S tipa baicalensis Roshev. , S . grandis P. Smirn, and S. kry lovii Roshev are constr uctive species of the
Inner Mongolia steppes. They are not only the main resources of forag e in Inner Mongolia, but also the natural
ecolo gical defense of the Beijing-Tianjin area, boast ing very impor tant economical and environmental values.
Studies on these S tipa species have been repo rted both in the domest ic and overseas journals, fo cusing mainly
on the gr asses g eographical distribution, and their biolog ical and phy siolog ical characteristics. With the
development of mo lecular biolog y techniques, studies on the mo lecular biology of St ip a species have draw n the
at tention of many resear cher s. T hough analysis of the genet ic sim ilarit ies and genet ic st ructure of one species of
St ipa have been documented, research w o rk on the genet ic relat ionship betw een differ ent St ip a species are st ill
lacking . In the pr esent study, 14 populat ions of three S tipa species f rom the m iddle and easter n Inner M ongolia
steppes w ere analyzed with RAPD markers. We obtained 223 bands f rom the 16 primers, in w hich 184 bands
w er e polymorphic. T he r ate of po lymorphism w as 82. 51% . T here w er e 14 samples to show the obvious
sim ilarity among the species, and populat ions w ithin the same species w ere init ially clustered together . We
obtained the special RAPD mar kers w ithin the populat ions of the same species.
Key words : St ipa; RAPD; Germplasm ; Cluster analysis
　　贝加尔针茅( Stipa baicalensis Roshev . )、大针茅
( S tip a grand is P. Sm irn. )和克氏针茅( Stipa krylovi i
Roshev . )为内蒙古草原的建群种。它们不仅是内蒙古
主要牧草的来源, 也是京津地区的天然绿色屏障,因此
具有重要的经济和生态价值。关于针茅属植物的研究,
国内外已经做了大量的研究工作,主要集中在地理分
布、生物学和光合生理特性方面。近几年随着分子生物
学的发展,对针茅属植物分子生物学的研究工作也开
始起步。关于同种植物的遗传多样性和遗传结构的研
究有了诸多报道。然而,关于不同种针茅之间遗传关系
的研究仍旧缺乏。在本实验中, 利用RAPD 分子标记
技术对14份来自内蒙古中东部草原区的3种针茅属
收稿日期: 2006-03-02; 修回日期: 2006-07-22
基金项目: 国家重点基础研究发展规划项目( G2000018601)
作者简介: 宋涛( 1983-) ,男,天津人,本科生,从事植物抗逆性方面的研究; * 通讯作者 Au th or for correspondence; E -m ail : ybgao@ nankai, edn. cn
第14卷　第 3期
　Vo l. 14　 No . 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2006年　 9 月
　Sep. 　　 2006
植物进行遗传多态性分析。16个引物共扩增出223条
DNA片段, 其中多态性片段为184条, 多态性比率为
82. 51%。结果表明: 14份材料呈现出明显的种间相似
性,同一种针茅首先聚在一起;每一种针茅都获得了其
特有的RAPD条带。
贝加尔针茅( S tipa baicalensi s Roshev. )、大针茅
( S . grandis P. Sm ir n. ) 和 克氏 针 茅 ( S . krylovi i
Roshev . )均属于禾本科针茅属多年生密丛型禾草, 为
内蒙古草原的建群种和优势种。已有研究主要集中在
地理分布、生态生物学特性和光合生理特性方面,近几
年开始利用 RAPD技术探讨针茅属种内植物的遗传
多样性和遗传结构 [ 1～3]。有研究表明,大针茅的遗传变
异主要存在于群体之内, 只有少部分存在于群体之
间[ 4] ; 克氏针茅的不同地理种群具有丰富的遗传多样
性[ 5]。而针茅属植物种间关系的研究尚未见报道。本文
试图找出不同种的特征条带, 为野生植物种质资源利
用、种质鉴定及进化研究提供依据。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
在内蒙古中东部贝加尔针茅、大针茅和克氏针茅
天然分布区内,选取典型地段设置8个样地。其中, 霍
林郭勒市样地位于通辽市的东北部, 属于草甸草原; 克
什克腾旗样地位于赤峰市北部,其他6 个样地位于锡
林郭勒盟,均属于典型草原。取样14份,包括贝加尔针
茅3份( B1, B2, B3) ,大针茅5份( G1, G2, G3, G4, G5) ,
和克氏针茅6份( K1, K 2, K3, K4, K5, K6) (表1)。根据
种群大小,选取15～30株(株距> 3 m ) ,从每个株上剪
取2个新鲜完整叶片,形成混合样品,用变色硅胶进行
快速干燥固定,带回实验室用于DNA 提取。
表1　供试材料采集地点
T able 1　Locations o f the sample mater ials in the study
样地
Plot
霍林郭勒市
Hulin gol
西乌旗
Xi Ujimqin Oi
锡林浩特东
E as t Xilinhot
锡林浩特西
West Xil inhot
锡林浩特东南
白音锡勒牧场
Southeast Xilinh ot
Baiyinxile Farm
阿巴嘎旗
Abag Qi
苏尼特左旗
Sonid Zu oqi
克什克腾旗
Kesigten Qi
贝加尔针茅
S t ip a baicalensi s
B1 B2 B3
大针茅 S . g rand is G1 G2 G3 G4 G5
克氏针茅 S . krylov ii K1 K2 K3 K 4 K5 K6
1. 2　DNA的提取
采用改进的SDS 法 [ 5] , 具体步骤如下: 取 0. 04～
0. 06 g 硅胶干燥的叶片加液氮研磨成粉末,分别加入
2个7 mL 离心管中,各加入提取缓冲液3. 5 mL, 10%
SDS 0. 5 mL,混匀。65℃水浴10～15 m in 后加入0. 9
mL 5 mol / L KAc 混匀, 冰浴30 min, 4℃, 12000 rpm
离心15 min; 吸取上清液,加入等体积氯仿/异戊醇, 混
匀,静置10 min, 4℃, 8000 rpm ,离心10 min。吸取上清
液,加入 2/ 3体积的异丙醇( - 20℃预冷)混匀,沉淀
30 min, 4℃, 8000 rpm, 离心10 min。弃上清液, 室温晾
干,用70%乙醇洗涤沉淀1次,晾干。将沉淀与750 LL
TE 缓冲液在1. 5 mL 的 Eppendorf 管中混合,加入1/
100体积的RNase, 37℃反应1 h。加入等体积的酚/氯
仿混匀,室温放置10 min, 4℃, 8000 rpm ,离心5 min。
吸取上清液, 加3倍体积的3 mol/ L N aAc, 2. 5倍体积
的无水乙醇, 混匀,室温沉淀30 min, 4℃, 10000 rpm ,
离心10 min,弃上清, 晾干。用70%乙醇洗涤沉淀2～3
次,室温晾干10～15 m in, 加入等体积的TE 缓冲液或
重蒸水, - 20℃保存备用。
1. 3　PCR扩增
经优化的扩增反应总体积为 25 LL, 其中含有
10 mmol/ L T ris-HCl( pH8. 3) , 1. 5 mmo l/ L M gCl2 ,
50 mmo l/ L KCl, 0. 1 mmol/ L dNTPs, 0. 25 Lmol/ L
随机引物, 20 ng 模板DNA , 1U T aqDNA 聚合酶。反
应程序为: 94℃预变性 4 min, 94℃ 40 s, 36℃ 1 min,
72℃ 2 min,经40个循环后, 72℃延伸10 m in。扩增产
物在1. 4%的琼脂糖凝胶中(含EB)电泳,在紫外灯下
观察结果并照相。
1. 4　数据处理
每个样品的扩增产物电泳分离谱带在某一位点上
按有或无记录,存在时赋值为1,否则为0。统计各引物
检测各群体的多态位点比率, 并将所得结果输入计算
机构建二元矩阵, 利用SPSS 软件进行分析。
2　结果与分析
2. 1　RAPD多态性分析
对Operon 公司的100个10核苷酸引物进行筛选,
329第 4期 宋　涛等:利用RAPD 技术分析内蒙古中东部草原三种针茅的遗传关系
选择能够扩增出清晰、稳定带的引物进行正式扩增, 共
得到16个引物, 表2中列出了本实验所使用的16个引
物的序列。在14个不同地理种群内共扩增到 223 条
DNA 片段,平均每个引物扩增出13. 94条带。在223条
带中,多态性片段为184条, 占总扩增数的82. 51% ,平
均每个引物有11. 5条多态性条带。
表 2　16个有效引物的编号及序列
Table 2　Number s and sequences of the 16 primers used
in the st udy
引物
Prim er
5-3 序列
S equence 5 to 3
引物
Primer
5-3 序列
Sequ ence 5 to 3
A 01 CAGGCCCT TC N08 ACCTCA GCT C
A 02 TGCCGA GCT G N 09 T GCCGGCT TG
A 04 A A T CGGGCTG N 20 GGTGCTCCGT
A 08 GT GA CGTA GG Q01 GGGACGA TGG
I 03 CA GAA GCCCA Q05 CCGCGT CTT G
I 07 CA GCGA CAA G Q09 GGCT A A CCGA
N 02 A CCA GGGGCA Q12 A GTA GGGCA C
N 04 GA CCGA CCCA Q18 A GGCT GGGT G
2. 2　3种针茅属植物遗传相似性分析
贝加尔针茅、大针茅和克氏针茅不同地理种群的
遗传相似性系数分别为0. 781～0. 858(平均 0. 823)、
0. 742～0. 874(平均 0. 807) 和 0. 764～0. 914(平均
0. 837)。种间遗传相似性系数分别为,贝加尔针茅与大
针茅0. 380～0. 449(平均0. 416)、贝加尔针茅与克氏针
茅0. 376～0. 425(平均 0. 399)、大针茅与贝加尔针茅
0. 427～0. 564(平均0. 470) (表3)。在所选取的14个样
地中, 同种针茅不同地理种群之间的遗传相似性明显
大于种间,表明针茅种内的不同地理种群之间差异性,
但是远小于种间。
在同一地点, 种内相似性系数大于种间。B2、G1
和K1均采自西乌旗,种间相似系数B2和G1为0. 438,
G1和K 1为0. 516, B2和K1为0. 412,远小于贝加尔针
茅( 0. 823)、大针茅( 0. 807)和克氏针茅( 0. 837)的种内
的不同地理种群(表3)。同样采集了3种针茅样本的白
音锡勒牧场所得结果也相同(图1)。
表3　3 种针茅不同地理种群RAPD结果所得Jaccard相似性系数矩阵
Table 3　Jaccard similarity co efficient matr ix by the RAPD results of the thr ee species
B1 B2 B3 G1 G2 G3 G4 G5 K1 K2 K3 K4 K5 K6
B1 1. 000
B2 0. 858 1. 000
B3 0. 828 0. 781 1. 000
G1 0. 435 0. 438 0. 409 1. 000
G2 0. 437 0. 416 0. 418 0. 830 1. 000
G3 0. 401 0. 380 0. 389 0. 755 0. 874 1. 000
G4 0. 413 0. 400 0. 385 0. 742 0. 847 0. 856 1. 000
G5 0. 449 0. 435 0. 429 0. 748 0. 801 0. 796 0. 819 1. 000
K1 0. 425 0. 412 0. 421 0. 516 0. 503 0. 475 0. 473 0. 564 1. 000
K2 0. 401 0. 396 0. 389 0. 492 0. 478 0. 443 0. 432 0. 497 0. 810 1. 000
K3 0. 408 0. 395 0. 388 0. 484 0. 470 0. 427 0. 432 0. 473 0. 803 0. 844 1. 000
K4 0. 397 0. 376 0. 377 0. 489 0. 484 0. 456 0. 453 0. 486 0. 778 0. 855 0. 914 1. 000
K5 0. 403 0. 398 0. 384 0. 495 0. 481 0. 446 0. 443 0. 492 0. 804 0. 870 0. 875 0. 887 1. 000
K6 0. 401 0. 418 0. 397 0. 461 0. 440 0. 420 0. 425 0. 481 0. 764 0. 839 0. 807 0. 830 0. 883 1. 000
　　注: B1～B3为贝加尔针茅的3个种群, G1～G5为大针茅的5个种群, K1～K6为克氏针茅的6个种群; Note: B1～B3 are the three pop ulation s
of S tip a baicalensis, G1～G5 are the five populat ions of S. g rand is, K1～K6 are th e six populat ions of S . krylov ii .
图1　不同地理种群3 种针茅RAPD结果聚类图
Fig. 1　Dendrogr am of the three species a cco rding t o the RAPD dat a of differ ent geogr aphical populat ions
注: B1～B3为贝加尔针茅的3个种群, G1～G5为大针茅的5个种群, K1～K6为克氏针茅的6个种群; Note: B1～B3 are the three pop ulation s
of S tip a baicalensis, G1～G5 are the five populat ions of S. g rand is, K1～K6 are th e six populat ions of S . krylov ii .
330 草　地　学　报 第 14卷
2. 3　物种特有条带统计分析
贝加尔针茅共得到扩增条带141条, 其中 17条为
该物种特有;大针茅169条, 其中17条为特有带;克氏
针茅164条, 其中 20 条特有带(图 2, 表 4)。其中, 以
OPN 08为引物扩增出的大针茅特有带和贝加尔针茅
特有带,以及以OPN 20为引物扩增出的克氏针茅特有
条带(如图中箭头所指)。
图2　3种针茅不同地理种群RAPD电泳结果
F ig . 2　Electr opho r esis phot og raphs of differ ent g eog r aphical populations
注:图 2是以OPN 08 (上) 和OPN 20(下) 为引物的RAPD电泳图片。B1～B3为贝加尔针茅的3个种群, G1～G5为大针茅的5个种群, K1～K6
为克氏针茅的 6个种群; Note: Figur e 2 is the RAPD elect rophoret ic picture w ith the prim ers of OPN 08( Top) an d OPN 20( Bottom) B1～B3 are the
three populat ions of S tip a baicalensis, G1～G5 are the f ive p opu lations of S. g rand is, K1～K6 are the s ix p op ulation s of S . krylov ii . M refers to the
marker.
表4　RAPD 扩增条带统计表
Table 4　Statistical results o f RAPD amplified bands
种群代码
Population code
种群扩增总数
T ota l amplified
band number
of each
population
种扩增条带总数
T ot al amplified
band number
of each
species
种特有条带数
N umber o f
special bands
shared by the
three species
贝加尔针茅 B1 125
St ipa. baicalensis B2 124 141 17
B3 120
大针茅 G1 142
S . grandi s G2 138
G3 130 169 17
G4 128
G5 143
克氏针茅 K1 140 164 20
S . krylov ii K2 137
K3 134
K4 132
K5 136
K6 137
　　3种针茅的共有条带为82条,贝加尔针茅和大针
茅、克氏针茅和大针茅、贝加尔针茅和克氏针茅的共有
条带分别为25、45和17条。
3　讨　论
3. 1　Demeke 等 [ 6]认为, 充分反映芸苔属( B rassica)
植物亲缘关系, 至少需要10种引物的约100个RAPD
标记。陈新露等 [ 7]也认为采用RAPD技术分析作物品
种间的遗传关系时,至少使用13种引物才能得到客观
的结果。本文从100条随机引物中筛选出16条有效引
物,共得到223个RA PD标记,条带清晰,重复性好, 具
较高的可信度。
3. 2　RAPD 技术不仅可以用于植物种内遗传分析,
也可用于种间乃至属间的分类研究 [ 8]。可以将鹅观草
属( Pseudoroegneria)的物种分开,而且形态相似、地理
分布相同或相近的物种聚类在一起 [ 9] ; 对燕麦属 [ 10]
( A vena)、黑麦属[ 11] ( S ecale L)和早熟禾属[ 12]的研究
结果几乎与传统分类结果完全一致。本试验得到的聚
类分析和主成分分析的结果与3种针茅的经典分类学
331第 4期 宋　涛等:利用RAPD 技术分析内蒙古中东部草原三种针茅的遗传关系
结果一致,表明RAPD技术可以有效区分这3种针茅。
3种针茅各自的特有条带经进一步的实验验证之后,
可以作为种鉴定的重要依据。
3. 3　来自不同地理环境的同一物种之间也具有一定程
度的遗传差异,与生态因子对植物的遗传变异有修饰作
用有关。张红梅等[ 13]在利用RAPD技术研究放牧压力
下大针茅群体遗传多样性时也得出了类似的结论。
3. 4　由于条件限制,贝加尔针茅只采集了3个地理种
群的植物样品,分析结果只初步揭示了其内在客观性。
本文只对针茅属的 3种具有代表性的种进行了研究,
RAPD 分析是否适用于所有的针茅属植物种间鉴定
尚需进一步研究探讨。
4　结　论
4. 1　从100条引物中筛选16条对 3种针茅属植物进
行RAPD分析,得到的条带清晰,重复性好。
4. 2　3种针茅属植物种内遗传相似性系数大于种间。
4. 3　得到种特有条带,其中贝加尔针茅17条, 大针茅
17条,克氏针茅20条。
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(责任编辑　张蕴薇)
首届中国草业企业家高层论坛在京召开
　　由中国草学会、中国农业大学草业科学研究中心等单位联
合举办的中国草业企业家高层论坛于 11 月 24 日在京隆重举
行。全国政协常委、经济委员会副主任洪绂曾,农业部草原监理
中心副主任刘加文、国家开发银行研究员范小克、全国畜牧总
站草业处处长 旭疆等有关领导和部门负责人出席会议并发
表重要讲话, 成都大业国际投资有限公司、美国百绿集团中国
代表处、克劳沃集团等来自草种业、草坪业、草产品加工业、草
业经营、草原畜牧业、草业机械产业等20 多位企业家和部分高
校的知名专家教授参加了本次论坛。
本次论坛的主题是“洞悉草业发展规律, 研究推进政策问
题, 把握企业发展机遇”, 国家开发银行研究员范小克、成都大
业投资公司董事长罗蜀杭、美国百绿集团中国代表处首席代表
陈谷、北京厚德瑞商贸有限公司总经理杨茁萌分别就多功能农
业背景下认识和发展草业、草业发展的思考、中国应尽早加入
OECD 成员建立种子认证体系和中国草业发展面临的问题及
对策作了专题报告。
与会企业家和专家就国家需求与草业发展、重大政策体制
与草业出路、草业科技创新与产品开发、西部开发与草业发展、
新农村建设与草业开发等方面畅所欲言,重点讨论了草业行业
发展和企业发展所面临的困境与机遇。
大家一致认为, 发展草业是维护国家生态安全、建设环境
友好型社会的战略举措 ,是建设现代农业、增加农牧民收入的
重要途径, 是建设社会主义新农村、构建和谐社会的迫切需要。
然而由于受多种因素影响, 近几年来,草业行业发展出现低迷
状态,大多数草业企业的发展受到影响, 急需要采取多种措施,
扭转当前的不利局面。
与会代表一致建议, 国家要对草业进行重新准确定位, 将
草业列为优先发展产业,在政策、资金等方面给予倾斜和支持,
与会代表还就成立中国草学会草产业专业化委员会、中国草业
协会等草业民间团体达成共识。 (杨富裕)
332 草　地　学　报 第 14卷