全 文 ：第 19 卷 第 1 期
Vol. 19 No. 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 1 月
Jan. 2011
红豆草黑腐病病原鉴定及毒素组分研究
朱建兰, 郭 霞, 王国利, 李瑞华
(甘肃农业大学草业学院, 草业生态系统教育部重点实验室,中美草地畜牧业可持续发展研究中心, 甘肃 兰州 730070)
摘要: 为明确红豆草( Onobry chis viciaef olia Scop. )黑腐病的病原及其病菌的主要制病机理, 对甘肃省兰州、定西
等地红豆草黑腐病进行调查,通过对病叶进行组织分离得到病菌, 经纯化培养、致病性测定后进行病原鉴定;病菌
用 PSK 培养液在适宜条件下培养, 经乙酸乙酯萃取,获得粗毒素液,进行生物测定后,经过浓缩、纯化, 得到较纯的
毒素样品,利用气相色谱质谱联用仪( H P68905973I)测定了该毒素组分。结果表明 :该病菌属半知菌亚门极细链
格孢菌( A lternar ia tenuis Nees. ) ,病菌粗毒素液对红豆草种子根伸长、离体叶片和叶圆片具有较强的毒性;红豆草
细链格孢菌毒素的主要组成成分为乙酸N羟基琥珀酰亚胺酯( C6H 7NO 4) ,相对含量为 67. 02%。
关键词:制病机理; 萃取;毒素组分; 生物测定
中图分类号: S432. 1 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2011) 01017106
Pathogen Identif ication and Chemical Structure of the Toxin Components of
Alternaria tenuis on Sainfoin (Onobrychis viciaef olia Scop. )
ZHU Jianlan, GU O Xia, WANG Guoli, LI Ruihua
(C ol lege of Grass lan d S cien ce, Gansu Ag riculture U niver sity, Key Laboratory of Grassland Ecosys tem, Min ist ry of E ducation ,
Sin oU. S centers for Grazin glan d Ecosystem Su stain abil ity, Lanzhou, Gan su Province 730070 , China)
Abstract: In or der to understand the pathogenic mechanism o f the black rot leaf diseases of sainfoin ( Ono
br y chis viciaef ol ia Scop. ) , diseases w er e invest igated fr om f ield specimens obtained in Lanzhou, Dingx i
dist rict of Gansu provinces. The pathogen w as ident if ied by isolat ing cultur es w ith separ at ion and purif ica
t ion, and pathogenicity tests. Separat ion of the pathogenic tox ins w as incubated in PSK culture medium by
ethyl acetate ex tr act ion, and tox in act ivit ies w ere tested by biolog ical assay . Pure to xin specimens w ere ob
tained by concentrat ion and purif ication from crude tox in. T he chem ical str uctures of tox in components
w ere determ ined by gas chr omatogr aphmass spect rometer ( HP68905973I) . Results show that the black
rot disease of sainfoin w as caused by the fungus A l ter naria tenuis . T he crude tox in of the pathogen show
st rong virulence to sem inal root elongat ion, leaves in vit ro and leaf disks of sainfoin. T he main chem ical
st ructure of the tox in component is acetic acid 2, 5dioxo1py rrolidiny l ester. The mo lecular formula is
C6H7NO4, and the relat ive content is 67. 02%.
Key words: Pathogenic mechanism ; Extraction; Chemical st ructur e; Bioassay
红豆草( Onobry chi s viciaef ol ia Scop. )黑腐病
在甘肃省各种植区均有发生, 可危害红豆草叶、茎、
杆。高温多雨季节易发生流行, 严重时造成叶片早
落或整株提前枯死,感病叶片中纤维素、叶绿素、氨
基酸等含量明显降低, 对牧草的产量和质量均有较
大影响[ 1]。詹文平等 [ 2]对该病害病原菌生物学特性
研究表明,该病原菌生长发育和侵染寄主适应的温
度范围较广。郭霞等 [ 3]研究表明红豆草黑腐病菌的
主要致病机理是产生毒素, 并优化出了病菌产毒的
条件。自从 Mechan 和 Murphy 在 1947 年报道维
多利亚毒素以后,国内外许多研究者已对多种植物
病原真菌毒素做了广泛而深入的研究, 认为致病毒
素是植物病害中起重要作用的一类化合物[ 4~ 8] 。但
有关红豆草黑腐病的病原鉴定, 及病菌毒素组分研
究尚未见报道。
1 材料与方法
1. 1 供试菌种及致病性测定
从田间采集红豆草黑腐病叶, 采用组织分离法
分离、纯化得到菌种[ 2] ,在 PDA培养基上( 25 恒温)
收稿日期: 20090806;修回日期: 20101129
基金项目:草业生态系统教育部重点实验室基金项目资助
作者简介:朱建兰( 1956 ) ,女,宁夏中宁人,博士,教授,研究方向为植物病理学, Em ail: zhu jl@ gsau. edu . cn
草 地 学 报 第 19卷
培养 7 d,用灭菌打孔器打成直径 4 mm 菌饼, 将菌
饼有菌落一面贴接于红豆草离体叶片上, 采用刺伤
和非刺伤 2种方式进行接种, 对照接直径 4 mm 空
白培养基饼,接种后保湿,置于 25 光照培养箱中,
3 d后观察记载发病情况, 并从发病部位进行病菌
分离回接[ 9] 。
1. 2 病原菌的鉴定
根据 Simmons [ 10]提出的链格孢种级分类标准,
参照张天宇[ 11] 链格孢种级分类研究方法对该病菌
进行鉴定。
1. 3 红豆草黑腐病菌产生毒素的提取、纯化及其组
分测定[ 12]
1. 3. 1 黑腐病菌毒素的培养 转接菌种于 PDA
培养基上培养 7 d( 25 , L D= 12 12) , 用打孔器
从平板上取菌丝块, 在无菌条件下接种到 100 mL
PSK液体培养基的 150 mL 锥形瓶中, 每瓶 10块,
置于 15 恒温振荡培养 13 d[ 3]。
1. 3. 2 黑腐病菌粗毒素的制备 将培养好的菌液,
先用 4层纱布过滤, 再将滤液用滤纸抽滤,得到无菌
滤液,再用等体积乙酸乙酯萃取 3次,合并乙酸乙酯
相,将乙酸乙酯蒸馏去除,得黑腐病菌粗毒素。
1. 4 红豆草黑腐病菌产生粗毒素的生物测定
1. 4. 1 种子萌发抑制法(种子根伸长法) 选择饱
满一致、光泽明亮的红豆草种子, 50粒为一组, 设 3
个重复,经 50 的温水催芽(芽长 1~ 2 mm)后, 经
自来水冲洗 2~ 3次后置于铺好滤纸的培养皿中,每
皿加入粗毒素液 10 mL,并用干净的纱布覆盖,置于
23 的培养箱中培养 96 h, 测量种子根长度, 同时
设清水对照[ 13] 。计算根长抑制率,公式如下:
根长抑
制率( %) =
对照根长- 毒素处理的根长对照根长 100%
1. 4. 2 离体叶片针刺法 取红豆草植株一定部位
大小一致的无病叶片, 先用自来水冲洗 0. 5 h, 再用
无菌水冲洗 4次, 用灭菌的滤纸吸干叶面水分; 在叶
背面中央处针刺造成轻微伤害, 将粗毒素配成原液、
稀释 5倍、10 倍、50 倍液, 分别吸取 20 L, 对照用
空白培养液 20 L,分别滴于针刺处, 在( 25 1) ,
L D= 12 12 的条件下培养 96 h 后, 置于解剖镜
下,测定病斑直径大小 [ 14~ 16]。
1. 4. 3 叶圆片法 叶片选取和消毒方法同 1. 4. 2。
用打孔器打取圆片(直径为 6 mm) , 平放 (正面向
下)在加有 5 mL 粗毒素溶液的培养皿中滤纸上(培
养皿和滤纸都灭过菌) ,用保鲜膜封好,然后置于( 25
1) , L D= 12 12 的条件下培养, 以分级统计
方法观察和记录圆片的受害情况 [ 17]。粗毒素提取
液对叶圆片伤害程度的评价标准见表 1。
表 1 粗毒素对叶圆片伤害程度的评价标准
T able 1 Evaluat ion standard of the leaf discs damaged by crude tox in ext raction liquid
病害级别
Disease grade
症状
Sym ptom s
4 圆片全部失绿,甚至腐烂 Leaf discs ch lorosis, and even rot
3 圆片 1/ 2以上失绿,但未及全圆片 Half of th e leaf dis cs ar ea chlorosis
2 狭的边缘失绿,圆片中间出现失绿小斑点 T he edge of leaf dis cs chlor os is and spots in the middle of leaf dis cs
1 仅有狭小的失绿边缘 Relat ively narrow edge of leaf discs chlorosis
0 正常 Normal
1. 5 黑腐病菌毒素的纯化
称取毒素粗提物 10 g 于 150 mL 烧杯中, 加入
100 mL 体积比为 1: 1的苯丙酮溶液, 于 60 水浴
中加热溶解,趁热过滤除去不溶物。将滤液于 60
水浴中蒸发浓缩至 50~ 60 mL, 然后置于冰水浴中
冷却, 自然挥发结晶。将所得晶体反复用体积比为
1 1的苯丙酮溶液溶解重结晶,得到一种含少量
棕色杂质的白色针状晶体。将得到的纯度较高的晶
体按质量比 11拌入柱层析硅胶, 装入 300 mm
15 mm 的硅胶柱中, 用体积比为 1 1的苯丙酮溶
液洗脱,将洗脱液浓缩至 30~ 40 mL,置于冰水浴中
冷却,自然挥发结晶,获得白色针状晶体, 即为纯化
好的黑腐病菌毒素晶体。
1. 6 黑腐病菌毒素的组分分析
将纯化好的黑腐病菌毒素晶体用丙酮溶液溶
解,利用气相色谱质谱联用仪( HP68905973I)测定
毒素组分。
色谱条件为 SE54弹性石英毛细管柱( 50 m
0. 25 mm id 0. 50 m) ;进样口 270 ,分流比 30
172
第 1期 朱建兰等:红豆草黑腐病病原鉴定及毒素组分研究
1,载气采用恒流模式 1. 2 mL min- 1 , 升温程序:
60 开始,以 20 min- 1升至 225 保持 12 m in,
溶剂延迟 5 m in, 进样量 2 L。质谱条件采用电子
轰击源( EI) , 电子能量 70 eV; 离子源温度 230 ; 四
极杆温度 150 ; 传输杆温度 280 ;扫描范围 40~
400 amu。
1. 7 试验数据的统计分析
种子根生长量随病菌粗毒素浓度变化关系, 用
逻辑斯蒂模型 S = K/ ( 1+ exp( a+ bx ) )拟合, 式中
K, a, b为待估参数。分析运算用的计算机软件为
DPS 数据处理系统[ 18]。
2 结果与分析
2. 1 红豆草黑腐病病原菌形态
病菌在 PDA 上菌落初为灰白色, 后期变为青
褐色至黑褐色;分生孢子梗单生或数根簇生,直立或
略有弯曲,具分隔,偶分枝, 淡褐色, 24. 0~ 77. 5 m
3. 5~ 5. 0 m;分生孢子单生或短链生, 淡褐色至
中褐色,倒棍棒形、倒梨形、卵形,基部略膨大,有横
隔膜 3~ 7个,纵隔膜 0~ 3 个, 分隔处略缢缩,喙部
(嘴胞)直或弯曲,具隔膜 0~ 7个(图 1) , 12. 0~ 28. 8
m 7. 2~ 14. 4 m;喙及假喙柱状, 淡褐色, 分隔,
部分假喙(次生分生孢子梗)产孢部略膨大, 5. 0~ 34. 5
m 3. 0~ 4. 5 m;根据张天宇中国真菌志链格孢
属鉴定为极细链格孢菌(A lter naria tenuis Nees. )。
2. 2 病菌致病性
接菌饼 3 d后开始出现褐色的小斑点, 以后颜
色逐渐加深,斑点扩大,病斑周围产生明显的褪绿晕
圈,发病症状与田间自然发病一致。对接种后产生
的病斑进行分离, 获得极细链格孢,说明该菌是红豆
草黑腐病的致病菌,并具较强的致病性(如图 2)。
2. 3 红豆草黑腐病菌粗毒素的生物测定
2. 3. 1 种子根伸长抑制法 由图 3可知,红豆草黑
腐病菌粗毒素对红豆草种子根伸长有明显的抑制作
用。原液处理对种子根伸长的抑制作用最强,抑制
173
草 地 学 报 第 19卷
率达 91. 43% ;稀释 50倍的粗毒素仍然对种子根伸
长有明显抑制作用, 抑制率为 51. 43%。不同处理
下种子根伸长随病菌粗毒素浓度变化的逻辑斯蒂模
型参数估计, 拟合结果表明, 不同浓度粗毒素处理
下, 种了根伸长模型的决定系数 ( R2 ) 达到了
0. 9882,模型拟合较好, 拟合度高。从图 3 还可看
出,种子根生长的模拟曲线与观察值较为接近。
图 3 粗毒素对种子根伸长的影响
Fig. 3 Effects of crude to x in on roo t g row th of sainfoin
2. 3. 2 离体叶片针刺法 叶片经不同倍数粗毒素
液处理后沿针刺伤口部位均呈现水浸状褪绿斑, 且
病斑逐渐扩大, 颜色逐渐变成黑褐色, 对照(清水和
空白培养液)则无症状(见表 2)。由表 3可知, 随着
处理浓度稀释倍数的增加, 离体叶片症状出现的时
间延迟。病菌粗毒素原液处理 24 h 供试离体叶片
即出现症状,稀释 5倍和 10 倍液处理 48 h 出现症
状,而 50倍液处理 72 h 才出现症状。受害程度与
处理浓度呈正相关。
表 2 毒素粗提液处理叶片针刺法测定结果
Table 2 Leavef loat ing bioassay o f the crude tox in
处理
Tr eatm ent
症状
S ymptom s
原液
Stock Solution
叶片布满黑色斑块,褪绿
Covered with black patch on the leaf, and chlorosis
5 有大量黑色小斑点,褪绿
Lot of black spots on the leaf, an d chlorosis
10 有零星的小斑点,未褪绿
A few spots on the leaf, an d not chlor os is
50 出现稀疏的小斑点,未褪绿
Very few spots on th e leaf , and n ot ch lorosis
CK
正常
Normal
表 3 毒素粗提液在不同时间叶片针刺法测定结果
T able 3 Leavefloating bioassa y of the crude
tox in in different times
处理
T reatmen t
处理时间 T reatmen t t ime
24 h 48 h 72 h 96 h
原液 Stock Solut ion + + + + + + + + + +
5 - + + + + + +
10 - + + + +
50 - - + +
注: + 表示发病及程度, - 表示未发病
Note: + sh ow s diseas e developm ent and severity; - sh ow s
no disease
2. 3. 3 粗提液浸渍离体叶片法(叶圆片法) 经不
同浓度的粗毒素液处理之后的红豆草叶片呈现不同
程度的症状,粗毒素原液比其他处理浓度使叶片症
状更加明显(见图 4) , 说明该毒素对红豆草叶片有
很大的毒害作用。表 4是按表 1 的评价标准,不同
浓度粗毒素处理随时间表现症状的级别程度。粗毒
素原液处理 96 h达最高级 4级, 5倍、10倍和 50倍
液处理分别为 3级、2级和 1级。
2. 4 红豆草黑腐病菌产生毒素组分测定分析
将纯化得到的毒素白色晶体, 利用气相色谱质
谱联用仪( HP68905973I)测试,所得基本数据如表
174
第 1期 朱建兰等:红豆草黑腐病病原鉴定及毒素组分研究
图 4 黑腐病菌粗毒素处理红豆草叶圆片受害症状
F ig 4 Damaged symptoms of sainfo in leaf disk t reated by pathogenic crude to xin
5所示(仅列出相对含量高于 1%的物质) ,共检测出
十几种有机化合物, 其主要成分为 A ceticacid 2, 5
dioxo1 pyrro lidiny l ester, 中文名称为乙酸N琥
珀酰亚胺酯, 化学分子式为 C6H 7NO 4 , 相对含量
67. 02%。主要物质的结构见图 5, 样品的 GCMS
总离子流量见图 6。
表 4 毒素粗提液浸渍离体叶片测定结果
Table 4 Leavedipping bioassay o f the crude tox in
处理
T reatmen t
处理时间 T reatmen t t ime
24 h 48 h 72 h 96 h
原液 Stock S olut ion 1 2 3 4
5 0 1 2 3
10 0 0 1 2
50 0 0 1 1
表 5. 检测样品中所含物质
Table 5 Substances of tested sam ples
英文名称
E nglish name
中文名称
Ch ines e nam e
分子式
Molecular formu la
相对含量
Relat ive Content
Acet icacid 2, 5diox o1 pyr rol idinyl ester 乙酸N琥珀酰亚胺酯 C6H 7NO 4 67. 02
Acetamide 乙酰胺 C2H 5NO 5. 65
1, 2dieth ylhydraz ine 1, 2二乙基联氨 C4H12N 2 5. 32
4( phenylamino)pheno 4苯氨基苯酚 C12H 11NO 3. 60
4Cyclohexylamin o3nit roben zophen one 3硝基4环己胺二苯甲酮 C19H 20N 2O3 2. 68
1methylPiperidine 1甲基哌啶 C6H 13N 2. 10
6methoxyQu inoline1oxide 6甲氧基喹啉N 氧化物 C10H8N 2O 2 1. 56
2, 4dinit rophenyl hydraz on e 2, 4二硝基苯腙 C12H 10N 4O4 1. 23
图 5 检测样品主要物质
F ig . 5 Main substance of t ested samples
3 结论与讨论
本试验通过对兰州地区及其周边县区的红豆草
黑腐病病样进行常规组织分离, 得到菌种,再采用单
孢分离法进行纯化,致病性测定,获得了较高纯度的
菌种。对该菌种在 PDA 培养基上的培养性状, 菌
落形态、质地颜色、色素沉积的观察, 以及分生孢子
和产孢细胞的形态观察与测定, 查阅有关资料明确
了该病菌为极细链格孢菌。这与刘若等[ 19] 报道的
红豆草黑腐病是由细链格孢等链格孢引起的一致。
红豆草黑腐病菌产生的毒素经种子根伸长抑制
法、离体叶片针刺法、叶圆片浸渍法等 3种方法进行
生物测定,结果均表明该毒素具有较强的毒性。据
报道,在已知的 21种寄主选择性植物病原真菌毒素
中,有 8种是由链格孢属( A lter nar ia) 病原菌产生
的,可引起多种病害。来源于某一病原真菌不同种
的真菌毒素,其化学结构基本上是相似的。如 AK
毒素 ( A . kikuchiana 产生 ) 对 日本 梨 ( Py rus
175
草 地 学 报 第 19卷
py r if ol ia Nakai)毒性很强, 是一种脂类物质; AF
毒素( A. f r agariae产生)的分离物 引起梨叶脉坏
死,其化学结构与 AK毒素类似, 可能是脂类化合
物; AA L毒素是由链格孢番茄致病型产生的一种选
择性毒素,化学结构是脂类 [ 20]。细链格孢( A . ten
uis)产生的毒素是细链格孢酮酸, 是一种吡咯啉衍
生物,含 4个氨基酸残基的环肽, 它对多种植物有
毒[ 21]。本研究利用气相色谱质谱联用仪( HP6890
5973I)测试红豆草链格孢菌毒素,共检测出十几种
有机化合物, 其主要成分为乙酸N琥珀酰亚胺酯
( Aceticacid 2, 5dioxo1 pyrro lidiny l ester ) , 又名
乙酸1羟基吡咯啉2, 5二酮酸, 分子量为 157. 12,
相对含量 67. 02%。与前人报道的细链格孢菌产生
毒素的主要成分结构基本符合。且该物质具有毒
性,可能是导致红豆草发生黑腐病的主要原因, 其致
病机理尚需进一步研究。
图 6 检测样品的总离子流量图
F ig . 6 GC/MS results of tested samples
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(责任编辑 李美娟)
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