全 文 ：第 18 卷 第 6 期
Vol. 18 No. 6
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 11 月
Nov. 2010
百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究
李玉珠1 , 陶 茸1, 王 娟1 , 师尚礼1* , 马晖玲1 , 赵小强2
( 1.甘肃农业大学草业学院, 草业生态系统教育部重点实验室, 中美草地畜牧业可持续发展研究中心,
甘肃 兰州 730070; 2.中国农业大学生物学院, 北京 100193)
摘要: 分别以百脉根里奥( L otus corniculatus L . cv. Leon)无菌苗子叶及由下胚轴和子叶形成的胚性愈伤组织为
供体材料,进行原生质体游离, 研究不同酶解条件对原生质体分离的影响, 以期为进一步开展属间体细胞杂交及培
育新品种奠定研究基础。结果表明:子叶和愈伤组织原生质体分离最适的酶液组合均为 2%纤维素酶+ 0. 5%果胶
酶+ 0. 3%半纤维素酶、以及 0. 55 mol L- 1甘露醇, 产量及活力分别可达 4. 13 106个 g- 1 , 65% 和 3. 8 106 个
g- 1 , 67. 4% ;最佳酶解时间分别为 6 h 和 12 h。预培养 8~ 10 d, CPW-10 溶液中预质壁分离 1 h 或预暗培养 1 d
等预处理措施可显著提高愈伤组织原生质体的产量及活力( P< 0. 01)。
关键词:百脉根; 子叶;愈伤组织; 酶解条件;原生质体
中图分类号: S541. 6; Q943. 1 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 06-0798-07
Enzymolysis and Isolation Conditions of Protoplasts from
Cotyledons and Calli in Lotus corniculatus
LI Yu-zhu
1
, T AO Rong
1
, WANG Juan
1
, SH I Shang- li
1*
, M A H u-i ling
1
, ZHA O Xiao- qiang
2
( 1. Pr atacultural College, Gansu Agricultural University, Key Laboratory of Grassland Ecosystem, Minis t ry of Edu cat ion,
Sino-U S Centers for Graz ingland E cosystem Sustainab ilit y, Lanzh ou , Gan su Provin ce 730070, C hina;
2. Colleg e of Biological S cien ces, Ch ina Agricu ltural U niver sity, Bei jing 100193, China)
Abstract: In v it ro-g row n hypoco tyls and coty ledons of L otus cor niculatus ser ved as explant sources fo r
studies r eported here. Protoplasts w er e isolated from cotyledons, and embryogenic calli induced from hy-
pocotyls and coty ledons. The ef fects of differ ent enzymoly sis condit ions on pro toplast isolat ion of Lotus
cor niculatus w ere invest igated to g et foundat ion data of somatic cell hybridizat ion and breeding . Results
show that the best enzyme combinat ions for both cotyledons and calli are 2% cellulase onozuka R- 10+
0. 5% pectinase Y- 23+ 0. 3% hemicellulose and 0. 55 mol L- 1 mannitol. The opt imum enzymolysis t ime
is 6 h for co ty ledons and 12 h fo r calli. T he yield and viability of pr otoplasts are 4. 13 106 / g, 65% and 3. 8
106 / g, 67. 4%, respect iv ely . Results indicate that both yield and viability of calli protoplasts significant-
ly increase ( P< 0. 01) through pre-culture for 8~ 10 d, pr eplasmo lyzing w ith CPW-10 for 1 h, or under
darkness for 1 d.
Key words: L otus cor niculatus ; Co ty ledons; Calli; Enzymoly sis condit ions; Pr otoplasts
百脉根( L otus corniculatus L. )又称 瘠地苜
蓿[ 1] ,是优质的多年生豆科牧草、蜜源植物及水土
保持植物,富含缩合单宁。因此,利用各种手段把百
脉根细胞中控制单宁缩合的遗传基因转移至栽培牧
草饲料品种中去,是目前牧草品质改良研究中的一
个热点。植物体细胞杂交技术即体细胞融合技术在
获取多基因控制的数量性状、细胞质基因控制的性
状及生物安全方面较转基因技术具有明显优势, 是
一种改良作物品质、创造新型物种的有力育种手段。
植物体细胞杂交技术是以原生质体的分离和培
养为基础的。豆科牧草原生质体培养始于紫花苜蓿
(M edicago sativa L. ) , 对其的研究也最多, 以幼
根[ 2 ]、子叶[ 3]、叶片[ 4, 5, 6, 7]、愈伤组织 [ 8]等为材料, 分
离和培养原生质体相继成功。近几年, 许多学者对
收稿日期: 2010-06-01;修回日期: 2010- 11-11
基金项目:国家 十一五科技支撑计划( 2007BAD52B06) ;现代农业产业技术体系建设专项资金;人工草地优质牧草生产技术研究与示范
( nyh yz x07-022)资助
作者简介:李玉珠( 1979) ,女,陕西宁强人,博士研究生,主要从事牧草和草坪草种质资源保护与育种的研究, E-mail: liyz@ gsau. edu. cn; *
通讯作者 Author for corresponden ce, E-mail: shi shl@ gsau. edu. cn
第 6期 李玉珠等:百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究
紫花苜蓿[ 9~ 11] 、普通红豆草( Onobry chi s v iciaef olia
Scop. )
[ 12]、白花草 木樨 ( M eli lotus albus ( L . )
Desr. )
[ 13]及草地早熟禾( Poa p r atensi s L. ) [ 14] 等牧
草及草坪草原生质体酶解效果进行了系统研究。但
有关百脉根原生质体培养的研究报道一直较少。英
国的 Ahuja[ 15] 和日本的 Niizeki[ 16] 曾在 20 世纪 80
年代率先进行了百脉根原生质体分离和培养的研
究;我国吕德扬 [ 17]和刘明志 [ 18]对百脉根原生质体培
养体系进行了研究。此后有关百脉根原生质体酶解
的研究国内外鲜见报道。因此, 本文以百脉根品种
里奥( L otus corniculatus L. cv . Leon)无菌苗子叶
及胚性愈伤组织为外植体, 研究不同酶解条件对其
原生质体分离的影响, 以期为进一步开展属间体细
胞杂交及培育新品种奠定研究基础。
1 材料与方法
1. 1 植物材料
百脉根品种里奥种子由甘肃农业大学提供。
1. 2 胚性愈伤组织及子叶的获得
切取百脉根无菌苗下胚轴 ( 0. 5 cm 长)及子叶
( 0. 5 mm 宽)接种于含 1, 2, 3, 5 mol L - 12, 4-D和
0. 5~ 3 mo l L - 1 KT 组合的 24 种培养基上,筛选
出最佳的愈伤组织诱导培养基。从诱导出的愈伤组
织中,选取绿色颗粒状的愈伤组织进行愈伤组织的
诱导和继代,获得稳定的胚性愈伤细胞系,用于原生
质体酶解。将待酶解的无菌苗子叶组织尽可能剪得
细小,以便原生质体的分离。
1. 3 原生质体的分离和纯化
子叶和胚性愈伤组织各取 1 g 左右, 于 10 mL
混合酶液中酶解。酶处理组合见表 1。
酶溶剂 CPW 包括 27. 2 mg L - 1 KH 2PO4 ,
101. 0 mg L - 1 KNO3 , 1480. 0 mg L - 1 CaCl2
2H 2O, 246. 0 mg L- 1 MgSO 4 7H 2O, 0. 16 mg
L
- 1
KI, 0. 025 mg L- 1 CuSO4 5H2O, 5. 0 mmol
L- 1 MES, pH 5. 8,经 0. 45 m微孔滤膜过滤灭菌。
表 1 酶液组合
T able 1 Combinations o f enzyme solut ion
酶处理编号
No. of enz yme
t reatmen t
纤维素酶, %
Cellulase Onozu ka
R-10 ( Yakult , J apan)
果胶酶, %
Pect inase Y-23
( Wako, Japan)
半纤维素酶, %
Hemicellulose
( Sigma)
离析酶, %
Macer ozym e
( Yaku lt , Japan)
崩溃酶, %
Driselas e ( Sigma)
1 2 0. 5
2 2 0. 5 0. 3
3 2 0. 5 0. 3
4 2 0. 5 0. 3
5 2 0. 5 0. 3 0. 3 0. 3
在 1号酶组合+ CPW-10( 0. 55 mol L- 1甘露
醇)的处理下分别对分离材料的酶解时间、甘露醇浓
度、预处理条件及继代培养时间等进行了研究。子
叶及愈伤组织的酶解时间分别设为 4, 6, 8, 10, 12 h
和 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 h; 子叶及愈伤组织酶解
的甘露醇浓度均设为 0. 4, 0. 45, 0. 5, 0. 55, 0. 6 mol
L - 1共 5 个梯度; 愈伤组织预处理措施包括: 4
下培养 1 d的预低温处理、0. 55 mo l L- 1蔗糖溶液
和 0. 55 mol L - 1 CPW 溶液分别处理 1 h 的预质
壁分离、黑暗条件下生长 1 d的预暗培养共 4种; 愈
伤组织继代天数设为 4, 6, 8, 10 d。
子叶于( 25 1) 黑暗条件下静置酶解。愈伤
组织于( 25 1) 黑暗条件下在50 r min- 1的摇床
上震荡,分离原生质体。经过一定时间的酶解,取酶
解材料分别经 100, 400 目无菌尼龙网筛过滤, 除去
没有酶解完全的组织和细胞团, 滤液经 500 r
min- 1离心 5~ 10 m in 收集原生质体。用相应的
CPW (成分同上)悬浮, 再离心, 这样反复 1~ 2次。
最后用原生质体培养液洗涤 1次。
1. 4 原生质体的培养
将经洗涤的原生质体重新悬浮于原生质体培养
基中, 调整密度为 0. 5 105 ~ 2. 0 105个 L- 1。
原生质体培养基采用 KM8P 培养基, 附加 2. 0 mg
L- 1 2, 4-D、0. 5~ 1 mg L - 1 KT、100 mg L - 1水
解酪蛋白、100 mg L - 1水解乳蛋白、1%蔗糖、0. 4
mol L - 1甘露醇, pH 5. 8,经 0. 22 m 微孔滤膜过
滤灭菌。吸取 3~ 4 mL 原生质体悬浮液于直径为 6
cm的培养皿中,在( 25 1) ,黑暗条件下液体浅层
静置培养。在第 7 d和14 d时更换甘露醇浓度依次
减半的新鲜培养基。定期观察原生质体的分裂情
况,记录培养结果。
799
草 地 学 报 第 18卷
1. 4 原生质体产量和活力的测定
利用血球计数板在倒置显微镜下观察计数, 在
酶解一定的时间后, 统计原生质体的产量, 重复 5
次。同时采用荧光素双醋酸酯( Fluorescein Diace-
tate, FDA)法在荧光显微镜下对原生质体活力进行
染色鉴定,随机选取 5个视野统计原生质体的数量。
计算公式如下[ 19] :
1 mL 悬浮液中的原生质体数= 1个大方格悬浮液
( 0. 1 mm3 , 即 0. 1 L)中的细胞数 10 1000
原生质体活力= (有活力的原生质体数
/原生质体总数) 100%
1. 5 统计分析
用 SPSS 13. 0软件中的 Compare M eans 法对
试验数据进行单因素方差分析,差异显著性用 LSD
法和 SSR法进行多重比较。
2 结果与分析
2. 1 酶解时间对百脉根子叶和愈伤组织原生质体
分离的影响
酶解时间是影响原生质体分离的关键因素, 时
间过短,原生质体产量低,时间过长则导致较早游离
出来的原生质体破裂。本试验在 1 号酶液组合+
CPW-10处理下,研究了不同酶解时间对 2 种外植
体原生质体产量和活力的影响,结果见图 1。
随着酶解时间的增加, 子叶原生质体产量呈增
加的趋势, 原生质体活力则变化较大。酶解 6 h时,
产量为 2. 3 106 个 g- 1 , 子叶原生质体活力达最
大值 55. 0% ,随着酶解时间的延长, 原生质体产量
缓步增加,于 12 h达最高,为 2. 7 106 个 g- 1 , 但
此时原生质体活力明显下降, 仅为 20. 4% ,因此, 6
h为百脉根子叶原生质体最佳的游离时间。
愈伤组织酶解 4~ 6 h, 原生质体产量较低, 平
均为 8. 5 105 个 g- 1 ,这是由于酶解时间太短, 细
胞酶解不充分, 游离出的原生质体较少。愈伤组织
酶解 12 h原生质体产量达到峰值( 3. 1 106 个
g- 1 ) , 活力较高,为 60%。酶解 14 h时原生质体活
力达最大值 65% , 但产量较 12 h 减少 12. 9%, 为
2. 7 106 个 g- 1。酶解 16~ 18 h, 原生质体产量
和活力均降低, 平均为 1. 45 106 个 g - 1 , 52. 6%。
酶解时间增加使早先游离出的原生质体开始破碎,
计数时发现细胞碎片增多,原生质体活力降低。因
此,综合考虑, 12 h 为百脉根愈伤组织原生质体的
最佳酶解时间。
图 1 酶解时间对百脉根子叶和愈伤组织原
生质体产量与活力的影响
F ig . 1 Effects of enzymolysis time on protoplast yield and
v iability of co tyledon and calli from Lotus corniculatus
2. 2 酶液组合对百脉根子叶和愈伤组织原生质体
分离的影响
酶解是原生质体游离中重要的一步, 不同材料
适宜的酶种类及浓度组合不同。本试验设计了 5种
不同的酶液处理 (表 1) , 对子叶和胚性愈伤组织分
别酶解 6 h 和 14 h, 甘露醇浓度均为 0. 55 mol
L - 1。结果如图 2所示, 在 2号酶组合处理下,子叶
和愈伤组织原生质体产量均达最大值,分别为 4. 13
106 个 g- 1和 3. 8 106 个 g- 1 ,活力较高,分别
为 65%和 67. 4%。
子叶原生质体产量最低的为 4号酶液组合,仅
为 1. 07 106 个 g- 1 ,尽管活力达最大值 75. 0%,
但过低的产量说明添加 0. 3%的崩溃酶对于子叶原
生质体的分离效果不佳。5号酶液组合子叶原生质
体的活力较高( 73. 5% ) , 但产量偏低( 1. 5 106 个
g- 1 ) , 说明酶制剂的添加并不是越多越好,崩溃酶
对百脉根原生质体具有一定的毒害作用。3号与 1
号酶液相比,原生质体产量增加了 22. 2%, 说明添
加 0. 3%离析酶有利于子叶原生质体的分离。
愈伤组织原生质体最低产量出现在 3 号酶处
理,仅为 2. 0 106 个 g- 1 (活力 69. 1% ) , 这可能
是酶浓度偏低造成的。4号和 5号酶液组合的原生
质体产量比 1号酶液分别增加了 7. 1%和 21. 4%,
但同时细胞碎片的比例增加,造成原生质体的活力
降低,较 1号酶液分别低 10%和 21. 4%。综上所
述,对于百脉根子叶和愈伤组织原生质体的分离,最
佳酶液组合均为 2号酶组合。
800
第 6期 李玉珠等:百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究
图 2 酶液组合对子叶和愈伤组织原生质体产量与活力的影响
Fig . 2 Effects o f enzyme combinations on pro toplast
yield and viability of coty ledon and calli
2. 3 渗透压稳定剂浓度对百脉根子叶和愈伤组织
原生质体分离的影响
在原生质体分离中,常加入一定浓度的渗透压稳
定剂,如甘露醇、葡萄糖、蔗糖或山梨醇等来调节酶液
的渗透压,浓度过高会使原生质体皱缩,过低会使原
生质体胀裂[ 7] , 因此, 适宜浓度的渗透压稳定剂的添
加对原生质体的产出和稳定具有重要意义。试验在
分离 2种外植体原生质体的酶液中分别加入 0. 4~ 0. 6
mol L- 1的甘露醇(图 3) ,结果表明 0. 55 mol L- 1的
甘露醇浓度最适于百脉根子叶和愈伤组织原生质体
的分离,此时原生质体的产量最高,分别是 2. 4 106
个 g- 1和 2. 6 106个 g- 1 ,活力平均达65. 1%。
甘露醇浓度为 0. 6 mol L - 1时,原生质体的产
量也较高, 子叶为 2. 3 106 个 g - 1 , 愈伤组织为
2. 4 106 个 g- 1 ,但该浓度下细胞碎片增加, 原生
质体活力降低,平均为 58%。渗透压浓度为 0. 4~
0. 5 mo l L - 1时, 子叶和愈伤组织原生质体的产量
与活性均较低。
图 3 甘露醇浓度对子叶和愈伤组织原生
质体产量与活力的影响
F ig. 3 Effects of mannitol concentr at in on protoplast
y ield and v iability o f co tyledon and calli
2. 4 预处理条件对愈伤组织原生质体酶解的影响
酶解前对材料进行预处理, 可改变细胞和细胞
壁的生理状态,增加细胞膜的强度,提高细胞壁酶解
的效率,减少原生质体损失 [ 15]。因此, 试验设置了 4
种不同的预处理措施, 以研究其对愈伤组织制备原
生质体的影响,结果如表 2所示。
4种不同预处理方法与未预处理的对照相比,
原生质体产量和活力均呈增大趋势, 其中,将供试材
料在 CPW-10溶液中预质壁分离 1 h, 原生质体的
产量最高, 为 3. 06 106个 g - 1 , 比对照增加
25. 4% ( P < 0. 01 ) , 活力比对照增大 6% ( P <
0. 01) ; 预暗培养也有较佳的酶解效果, 原生质体产
量和活力分别较对照提高 17. 2% 和 13. 4% ( P<
0. 01) ; 预低温处理及在蔗糖溶液中预质壁分离 1 h
与对照相比,原生质体产量及活力增加均不显著,平
均为 5. 35%和 4. 1%( P> 0. 05)。
表 2 不同预处理条件对胚性愈伤组织原生质体产量及活力的影响
T able 2 Effects of var ious pretr eat ment conditions of embryogenic calli on pr otoplast yield and viability
预处理条件
Conditions of pr et reatment
原生质体产量 105 , 个 g- 1
Yield of pro toplast( g F resh w eight)
原生质体活力
Viabilit y of pr otoplasts, %
对照 Cont ro l 24. 4 2. 07 60. 6 2. 07
预低温处理( 4 下生长 1 d)
Pret reatment of low temperatur e ( culture o f 4 fo r 1 d) 25. 4 1. 14 63. 4 2. 07
预质壁分离( 0. 55 mo l L - 1蔗糖溶液中处理 1 h)
Preplasmo ly sis ( solut ion w ith 0. 55 mol L - 1 suga r for 1 h) 26. 0 2. 00 62. 8 2. 86
预暗培养(黑暗下培养 1 d)
Pret reatment in darkness for 1 d
28. 6 1. 14** 68. 7 3. 08**
预质壁分离( 0. 55 mo l L - 1 CPW 溶液中处理 1h)
Preplasmo ly sis ( solut ion w ith 0. 55 mol L - 1 CPW fo r 1 h) 30. 6 2. 30** 64. 4 2. 88*
注: * 表示差异显著(P< 0. 05) , ** 表示差异极显著( P< 0. 01)
No te: A ll the data in t he table ar e means standard er ro r. * means significant differ ence ( P< 0. 05) ; ** means signif-i
cant difference ( P< 0. 01)
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草 地 学 报 第 18卷
2. 5 继代培养天数对愈伤组织原生质体酶解的影响
愈伤组织的生长状态对原生质体的游离和培养
起到关键性作用,不同继代培养天数的愈伤组织在
其原生质体酶解过程中的反应见表 3。结果表明,
随着继代天数的增加, 愈伤组织原生质体的产量及
活力均增大。预培养 8~ 10 d再行酶解较预培养 4
~ 6 d可显著提高原生质体产量及活力( P< 0. 01)。
表 3 不同继代天数对胚性愈伤组织原生质体产量及活力的影响
Table 3 Effects of differ ent callus age on prot oplast
yield and viability from embryogenic calli
继代天数, d
Callu s age
原生质体产量 105,个 g- 1
Yield of protoplas t
( g Fresh w eight )
原生质体活力, %
Viabilit y of
protoplast s
4 15. 0 2. 24Aa 47. 8 3. 66Aa
6 19. 4 1. 67Bb 55. 7 6. 66Aa
8 30. 6 1. 14Cc 71. 3 10. 45Bb
10 26. 2 2. 28Dd 73. 1 4. 75Bb
注:同列中不同大写字母间差异极显著( P < 0. 01) ,不同小写字
母间差异显著( P < 0. 05)
Note: Differ ent capital let ters indicate signif icant dif f erences ( P
< 0. 01) . Di fferent small let ters indicate signif icant dif f erences ( P<
0. 05)
3 讨论
3. 1 供体材料对百脉根原生质体分离及培养的影响
原生质体的来源是植物原生质体分离和培养成
功的关键。只有具备较高细胞分裂、分化和形态建
成潜力的供体材料才能提供高质量的原生质体及其
再生植株[ 20] 。在前人对百脉根的研究中, 幼根 [ 15]、
子叶及下胚轴[ 15, 17] 、幼茎愈伤组织 [ 18]及悬浮培养细
胞[ 15]都曾被用作供体材料分离原生质体,均仅获得
了原生质体再生愈伤组织。本试验利用子叶和胚性
愈伤组织材料分离出较多高活力的原生质体(图版
A, B, C) ,子叶及愈伤组织原生质体产量分别可达
4. 13 106 个 g - 1和 3. 8 106个 g- 1。
进一步将子叶和愈伤组织来源的原生质体放在
KM8P 液体培养基上进行培养,发现 2个群体在形
态及分化再生能力上具有一定的差别。由子叶产生
的原生质体呈绿色、形态大小一致, 胞质浓(图版
D) ,而由愈伤组织游离出的原生质体颜色淡黄(图
版 E) ,较大的原生质体可见明显的液泡。前者通常
在第 2~ 4 d出现原生质体再生细胞的第 1次、第 2
次和第 3次分裂(图版 F, G, H , I, J) , 经过不断添加
新鲜培养液及降低渗透压, 来源于子叶原生质体的
小细胞团很快长成肉眼可见的小愈伤颗粒(图版
K) ;后者用附加 2. 0 mg L - 1 2, 4-D, 0. 5~ 1 mg
L
- 1
KT 激素的 KM8P 培养基继续培养并定期进行
降渗处理,细胞分裂的时间较迟, 数量较少。因此,
相比愈伤组织,幼嫩的子叶是百脉根原生质体分离
较理想的供体材料,可获得质量好、分裂频率高的原
生质体。
3. 2 适宜于百脉根原生质体分离的酶液组成、酶解
时间及渗透压的确定
酶成分是原生质体游离的关键所在, 不同植物
材料因其细胞壁成分和结构不同,所用酶的种类、浓
度和处理时间均有差异[ 21]。此外, 为了保持释放出
的原生质体活力和膜稳定性,酶液的渗透压必须与
处理细胞的渗透压相近似,使用的浓度范围随植物
材料的不同而异[ 19] 。对于豆科牧草,最常见的酶制
剂及渗透压稳定剂为纤维素酶、果胶酶及甘露醇,常
用浓度分别为 1%~ 2% , 0. 5%及 0. 35~ 0. 8 mol
L - 1 ,酶解时间从几小时到十几小时不等。白静仁
等[ 2 1] 用于游离野生黄花苜蓿 ( M edicago f alcata
Linn. )叶片的酶液组合是 1%纤维素酶、0. 5%果胶
酶和 1%半纤维素酶,酶解 5~ 7 h,最终获得完整的
再生植株。徐子勤等 [ 22] 将紫花苜蓿胭脂碱型农杆
菌转化愈伤组织用 2% 纤维素酶、0. 5%果胶酶及
0. 5%半纤维素酶的酶液处理, 0. 5 mol L - 1甘露
醇,酶解 6 h, 原生质体细胞分裂并长成愈伤组织。
刘明志[ 18] 采用 2%纤维素酶+ 1%果胶酶+ 0. 5%离
析酶+ 0. 3%半纤维素酶+ 0. 2%崩溃酶的组合, 0. 5
mol L - 1甘露醇,酶解 6~ 10 h,获得百脉根愈伤组
织原生质体再生植株。本研究经反复试验证明 2%
纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶的酶液
组合, 0. 55 mo l L - 1甘露醇, 酶解 6 h 和 12 h, 百脉
根子叶和愈伤组织可获得最好的酶解效果。可见,
对于不同植物材料因用于酶解的外植体种类及状态
的差异,最佳的酶液组成、酶解时间及渗透压稳定剂
的选择等酶解条件需进行具体试验来确定。
3. 3 预处理对百脉根愈伤组织原生质体分离及培
养的影响
酶解前对愈伤组织进行预质壁分离, 可使细胞
壁内的原生质部分收缩,细胞膜结构改变,避免酶解
时所造成的损伤, 同时促进酶解时细胞壁在小面积
破损条件下释放原生质体, 增加原生质体产量。预
暗培养和预低温处理条件可促使细胞分裂同步, 生
理状态达到一致[ 19] 。本研究将胚性愈伤组织放到
802
第 6期 李玉珠等:百脉根原生质体的分离和酶解条件的研究
注: A:胚性愈伤组织; B:子叶原生质体的活力检测; C :愈伤组织原生质体的活力检测; D:子叶游离的原生质体; E:愈伤组织游离的原生质;
F:子叶原生质体再生细胞的第一次分裂; G :愈伤组织原生质体再生细胞的第一次分裂; H :子叶原生质体再生细胞的第二次分裂;
I:愈伤组织原生质体再生细胞的第二次分裂; J:子叶原生质体产生的小细胞团; K :子叶原生质体再生的愈伤组织
Note: A: Emb ryogenic calli ; B: Viabilit y detect ing of cotyledon protoplast s; C: Viabilit y detect ing of cal li protoplast s ; D: Freshly isolated
protoplas ts f rom cotyledon; E : Fresh ly i solated p rotoplast s f rom cal li; F: First divis ion of protoplast-derived cell f rom cotyled on;
G: First division of protoplast-derived cell from calli; H : Second division of protoplast-derived cell fr om cotyledon; I: Second divis ion
of protoplast-derived cel l f rom calli; J: C ell cluster s formed f rom cotyled on protoplast s; K : Calli f orm ed fr om cotyledon protoplast s
新鲜培养基上培养 4~ 10 d 后再分离原生质体, 该
方法相当于对愈伤组织进行了预培养。试验结果表
明,在分离原生质体前,把愈伤组织转移到新鲜培养
基上预培养 8~ 10 d 或把培养材料放置在( 25
1) 、黑暗条件下 1 d, 再行酶解,可获得质量好、分
裂能力强的原生质体。或者将材料先放到与酶溶液
同浓度的 CPW 溶液中预培养 1 h 左右,使其细胞发
生质壁分离,然后再放入酶液去壁,这既可加快原生
质体的释放,又能缓解酶液对原生质体的损伤,提高
原生质体的分裂频率。因此, 这 3种预处理措施均
提高了百脉根愈伤组织原生质体的酶解效果, 是较
为理想的预处理方法。
3. 4 愈伤组织的继代培养对百脉根原生质体分离
和生长的影响
愈伤组织的长期继代培养, 会使植物细胞产生
生理代谢的变化, 引起组织衰老, 再生能力降低[ 23]。
马晖玲等[ 24]发现使用继代培养 75 代以后的美味猕
猴桃( A cit inidia del iciosa C. F. liang et A. R. Fer-
guson)子叶愈伤组织 A16N 1和 30代以后的毛花猕
猴桃( Actinidia chinensi s Planch. )子叶愈伤组织
E1分离的原生质体已丧失了分裂及再生的能力。
薛美凤和郭余龙认为[ 25] ,随继代培养时间的增加,
愈伤组织的分化能力降低, 但是并非完全丧失, 只要
提供合适的培养条件, 仍有可能分化成再生植株。
赵小强等[ 14] 用于分离草地早熟禾品种新格莱德
803
草 地 学 报 第 18卷
( Poa p ratensis L. cv. Nuglade)原生质体的愈伤组
织继代 10~ 12次,淡黄色,松软且易分散的小颗粒,
经过培养成功获得了该品种的原生质体再生植株。
本研究用于原生质体分离的愈伤组织继代培养了 5
~ 6次, 愈伤组织的状态良好而稳定, 获得的原生质
体具有较高的活力和分裂能力(图版 B, J)。由此可
见,利用愈伤组织作为外植体进行原生质体的分离
时,不同种或品种其愈伤组织最佳的继代时间是不
同的,有的材料经过长期的继代培养不再适合于原
生质体的分离和培养, 有的材料则能在长期的继代
培养中保持较高的分化潜力, 原生质体再生能力强。
因此,针对不同酶解材料应进行具体试验以研究继
代培养对愈伤组织产生的影响。
4 结论
本研究对百脉根品种里奥的子叶和胚性愈伤组
织进行了原生质体的分离和前期培养, 摸索出了适
宜的酶解条件和技术指标。即百脉根下胚轴和子叶
在含 1. 0 mg L- 1 2, 4D和 1~ 3 mg L- 1 KT 的
MS 培养基上可形成胚性愈伤组织。用于子叶和胚
性愈伤组织原生质体分离的最适酶液组合均为 2%
纤维素酶+ 0. 5%果胶酶+ 0. 3%半纤维素酶+ 甘露
醇 0. 55 mo l L- 1 ; 最佳酶解时间分别为 6 h 及
12 h。二者原生质体最高产量和活力分别为 4. 13
106 个 g - 1 , 65%和 3. 8 106 个 g- 1 , 67. 4%。
预培养 8~ 10 d、预质壁分离 1 h 或预暗培养 1 d等
预处理措施可增加愈伤组织原生质体的产量, 提高
原生质体的活力。子叶是制备百脉根原生质体较为
理想的外植体。
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(责任编辑 李美娟)
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