全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 04-0384-03
三种锦鸡儿遗传多样性 ISSR分析(简报)
宋俊双, 王　赞* , 高洪文
(中国农业科学院畜牧研究所, 北京　100094)
关键词: 柠条锦鸡儿; 中间锦鸡儿; 小叶锦鸡儿; ISSR ; 遗传多样性
中图分类号: S812; S 330. 25　　　　文献类别: A
ISSR Analysis on the Genetic Diversity of Three Caragana Fabr. Species
SONG Jun-shuang , WANG Zan* , GAO Hong-w en
( Ins titute of Animal Science, Chinese Academy of Agricu lture Scien ce, Beij ing 100094, Ch ina)
Key Words : Caragana korshinski i; C. intermedia; C. micr op hy lla; ISSR; Genet ic diversity
　　柠条锦鸡儿( Caragana korshinsk ii Kom. )、中间锦
鸡儿( C. intermedia Kuang et H. C. Fu. )和小叶锦鸡儿
( C. micr op hy l la Lam. )是豆科锦鸡儿属 ( Car agana
Fabr. )的多年生落叶灌木,耐低温、酷热、干旱及沙埋,具
有极高的生态和经济价值。
目前国内外已有一些关于柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿
和小叶锦鸡儿DNA 分子水平遗传多样性的研究报道[ 1]。
魏伟等用RAPD标记对柠条群体遗传多样性进行分析,
确定了柠条群体及种间存在基因流动[ 2] ; 马成仓等用
RAPD技术对柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿种
群遗传结构进行了分析,发现3个种在内蒙古高原自东向
西形成一个地理连续渐变群[ 3]。已有研究取材范围较窄。
简单重复序列间区的多态性 ( Inter-Simple Sequence
Repeats)已成功用于植物遗传多样性检测及保护生物学
研究等诸多研究领域[ 4]。本实验试用ISSR技术,以我国
西北、华北地区的柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿
为材料,探讨和揭示3个物种的遗传多样性。
1　材料与方法
1. 1　材料
34 份材料于 2003年- 2004年, 分别采集自内蒙
古、山西、陕西和宁夏, 其中柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和
小叶锦鸡儿分别为17、12和5份(表1)。
1. 2　DNA提取及 ISSR-PCR扩增
用SDS 法提取基因组总DNA。10
L 的PCR 反
表1　供试材料编号、种名和产地
T able 1　The number , L atin name and lo cation o f mater ials
种名
Species name
编号
Number s
采集地
Location of collection
1 山西偏关县 Pianguan, Shanxi Province
2 山西偏关县 Pianguan, Shanxi Province
3 山西河曲县 Hequ, Shanxi Province
4 山西河曲县 Hequ, Shanxi Province
5 陕西府谷县 Fugu, Shaanx i Province
6 陕西神木县 Shenmu, Shaanxi Pr ovince
7 陕西榆林县 Yulin, Shaanx i Province
8 陕西靖边县 J ingbian , Shaanxi Pr ovince
柠条锦鸡儿 9 陕西定边县 Dingbian, Shaanxi Province
Caragana 10 宁夏盐池县 Yanchi, N ingxia Hui A utonomous Region
kor shinskii 11 内蒙鄂托克旗 Etuoke, Inner Mongolia A utonomous Region
Kom 12 内蒙杭锦旗 Hangjin, Inn er M ongolia Au ton omous Region
13 内蒙鄂尔多斯市 E′rduosi, Inner Mongolia Autonomou s Region
14 内蒙四子王旗 Siziwang, Inner Mongolia A utonomous Region
15 内蒙苏尼特右旗 Sun iteyou , Inner Mongolia A utonomous Region
16 山西五寨县 Wuzhai, S hanx i Pr ovince
17 内蒙巴彦淖尔市 Bayanzuoer, Inner Mongolia Autonomous Region
18 内蒙苏尼特右旗 Sun iteyou , Inner Mongolia A utonomous Region
19 内蒙锡林浩特市 Xilinhaote, Inner M ongolia Autonomous Region
20 内蒙巴林右旗 Balinyou ,I nner Mongolia A utonomous Region
21 内蒙奈曼旗 Naiman, Inner Mongolia Autonomous Region
22 山西五寨县 Wazhai, Shanxi Province
中间锦鸡儿 23 山西岢岚县 Kelan, S hanx i Province
C. inter med ia 24 山西右玉县 Youyu, S hanxi Pr ovince
Kuang et 25 内蒙乌审旗 Wushen, Inner Mongolia Autonomous Region
H. C. F 26 内蒙达旗 Da, Inner Mongolia A utonomous Region
27 内蒙和林县 Helin, Inn er M ongolia Au ton omous Region
28 内蒙和林县 Helin, Inn er M ongolia Au ton omous Region
29 内蒙和林县 Helin, Inn er M ongolia Au ton omous Region
30 内蒙锡林浩特市 Xilinhaote, Inner M ongolia Autonomous Region
小叶锦鸡儿 31 内蒙库伦旗 Ku lun ,In ner M ongolia A utonomous Region
C. micr ophylla 32 内蒙奈曼旗 Naiman, Inner Mongolia Autonomous Region
Lam. 33 内蒙奈曼旗 Naiman, Inner Mongolia Autonomous Region
34 内蒙奈曼旗 Naiman, Inner Mongolia Autonomous Region
收稿日期: 2006-04-17; 修回日期: 2006-08-15
基金项目: 国家“863”项目( 2002AA241091)
作者简介: 宋俊双( 1980-) ,女,硕士,主要从事牧草种质资源研究; * 通讯作者 Author for correspondence, E-mail: wangzan999@ 163. com
第14卷　第 4期
　Vo l. 14　 No . 4
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2006年　 12 月
　Dec. 　　 2006

应体系为: 模板DNA10 ng , 2. 0 mmol/ L MgCl2, 0. 15
mmol/ L dNT P, 200 nmol/ L 引物和 0. 5 UT aq 酶。
PCR 扩增条件为: 94℃预变性 5 min; 然后进行 40 个
循环( 94℃变性45 s, 52℃退火45 s, 72℃延伸90 s) ; 循
环结束后72℃延伸 7 m in。PCR 反应在 PT C-225 型
Gradient PCR 仪上进行。PCR扩增产物在1. 5%琼脂
糖凝胶上电泳分离, 以上海生工生物工程有限公司的
200 bp DNA ladder 为分子标记, 用BIO-RAD公司的
Gel Doc1000型凝胶成像系统观察并照相记录。PCR
反应的 10×buf fer、Mg2+ 、Taq 酶、dNTP 均购自上海
生工生物工程有限公司。
表 2　ISSR 引物序列
T able 2　L ist of I SSR pr imer s sequence in t his st udy
编号
Number
引物序列
Pr imer list( 5- 3)
编号
Number
引物序列
Primer lis t( 5- 3)
U 807 A GAGAGAGAGAGA GA GT U846 CA CACACACACACACA ( A , G) T
U 826 A CA CACACACACACA CC U847 CA CACACACACACACA ( A , G) C
U 827 A CA CACACACACACA CCG U848 CA CACACACACACACA ( A , G) G
U 828 T GTGTGTGTGTGTGTGA U851 GTGTGTGTGT GT GTGT ( C, T ) G
U 829 T GTGTGTGTGTGTGTGC U861 ACCACCACCACCACCACC
U 834 A GAGAGAGAGAGA GA G( C, T )T U862 AGCAGCA GCAGCAGCA GC
U 836 A GAGAGAGAGAGA GA G( C, T )A U865 CCGCCGCCGCCGCCGCCG
U 840 GA GA GAGAGAGAGAGA ( C, T )T U868 GAAGAA GA AGAAGA AGAA
U 841 GA GA GAGAGAGAGAGA ( C, T )C U880 GGAGAGGAGAGGAGA
U 842 GA GA GAGAGAGAGAGA ( C, T )G
1. 3　数据处理与统计分析
电泳图谱中按照凝胶同一位置上DNA 带的有无
进行统计,有带的记为“1”, 无带的记为“0”。根据Nei-
Li相似系数法求得材料 i 和 j 之间的相似系数( S ij ) :
S ij= 2N ij/ ( N i+ N j ) , 其中 N i 表示材料 i中的条带数
目, N j 表示材料j 的条带数目, N ij表示材料i、j 共有的
条带数目。用NTSYS2. 02软件,采用类平均聚类方法
( U PGMA )进行聚类分析。
2　结果和分析
2. 1　3种锦鸡儿遗传多样性
用19条引物(见表2)对34份DNA 样品进行扩增,
共扩增出177条带, 平均每个引物扩增出9. 3条带, 多
态性条带为154条,多态位点比率为87% ,扩增片段大
小为400～1800 bp(表3)。
2. 2　遗传一致度及聚类分析
34份材料之间的相似系数在0. 62以上。柠条锦鸡
儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿种内各材料间的相似系
数分别为0. 66～0. 84(平均 0. 73)、0. 70～0. 86(平均
0. 75)和0. 73～0. 88(平均0. 82)。柠条锦鸡儿和中间锦
鸡儿种间的相似系数为0. 72, 柠条锦鸡儿和小叶锦鸡
儿间为0. 71,中间锦鸡儿与小叶锦鸡儿间为0. 72。3个
绵鸡儿种间分子水平差异不显著,亲缘关系较近。
表3　3 种锦鸡儿 ISSR 标记扩增结果
Table 3　Result s o f the detect ion o f ISSR markers in this study
项目 Item s 结果 Data
多态性引物数 Num ber of polym orphic primers 19
扩增条带数目Total IS SR bands 177
平均每条引物扩增出的带数 Average bands of p rimer 9. 32
多态性条带数 No. of polymorph ic bands 154
多态性条带百分率( % ) Percen tage of polymorphic bands 87%
　　以遗传相似系数0. 73为界限, 将34份材料划分为
5组(图1)。第1组包括柠条锦鸡儿的 3份材料( 1、3、
8) ;第2组是柠条锦鸡儿的4份材料( 2、4、6、7) ;第3组
包括中间锦鸡儿的6份材料( 19、20、24、25、26、27)和1
份柠条锦鸡儿的材料( 5) ;第 4组包括部分中间锦鸡儿
的材料( 18、21、22、23、28和 29)和所有小叶锦鸡儿的
材料( 30、31、32、33 和34) ; 其余的材料都被归为第 5
组。
3　讨　论
3. 1　3种锦鸡儿遗传多样性
基于ISSR分子标记,在供试材料中筛选出具有多
态性的 ISSR 引物19个,共扩增出多态性带154条, 多
态性条带比率为87. 0% ,说明3个绵鸡儿分子水平多
态性较高。其中柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿
的种内遗传相似系数分别为0. 73、0. 75和0. 82。小叶
锦鸡儿种内分子水平遗传差异相对较小, 这可能与其
地理差异不显著有关, 也可能与其取材数少有关。3个
绵鸡儿的种间平均遗传相似系数为0. 72、0. 71和 0.
72。表明3个绵鸡儿的亲缘关系比较近。聚类分析显示
柠条锦鸡儿的17份材料被分散到4个类别中,柠条锦
鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿绵鸡儿呈现交叉状态,
原因尚待深入研究。
3. 2　3种锦鸡儿的分类地位
柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿在分类学
上原为一个种,即小叶锦鸡儿。1907年,俄国分类学家
建立了柠条锦鸡儿新种。1977年, 匡可任和富象乾又
建立了中间锦鸡儿新种, 形态特征反映为上述 2个种
的中间类型。长期以来,人们对锦鸡儿属这3种植物的
分类学地位一直存在着较大的分歧。贾丽等从解剖学
的角度认为中间锦鸡儿决非小叶锦鸡儿和柠条锦鸡儿
385第 4期 宋俊双等:三种锦鸡儿遗传多样性 ISSR 分析
的杂交种,也并非是哪个种的种下等级,而是一个完全
独立的种[ 5] ; 徐朗然等利用杂交试验,得到生长正常的
中间锦鸡儿和柠条锦鸡儿杂交后代, 认为中间锦鸡儿
应该是柠条锦鸡儿的一个亚种 [ 6] ; 王洪新等通过种子
蛋白研究,主张回到一百多年前的 3个种归并为一个
种[ 7]。本实验表明, 这3个物种种间差异不大,亲缘关
系比较近,难以明确区分。目前这些研究结果又不能充
分证明3个物种在分类学上是1个种,笔者认为关于3
个物种在分类学上的地位, 还有待于进一步深入研究。
图1　基于 ISSR 标记的34份供试材料间的聚类图
Fig. 1　Dendrogr am of clust er o f 34 mater ials based on ISSR markers
4　结　论
4. 1　19条多态性引物,共扩增出多态性带154条, 多
态性条带比率为87. 0% ; 3个物种分子水平的遗传多
样性比较丰富。
4. 2　柠条锦鸡儿、中间锦鸡儿和小叶锦鸡儿种间差异
不大,亲缘关系较近,难以明确区分。
参考文献:
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(责任编辑　张蕴薇)
386 草　地　学　报 第 14卷