全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2007) 03-0212-04
紫花苜蓿 ISSR-PCR反应体系的建立与优化
王 瑜, 袁庆华*
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100094)
摘要: 通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L . ) ISSR-PCR 的主要参数, 建立适于紫花苜蓿的ISSR 反应体系和
扩增程序。在20 L 体系中各反应物的最适含量为: 15 ng 模板DNA, 0. 2 mmol/ L dNT P, 0. 4 mol/ L ISSR 引物,
0. 8 U T aq DNA 聚合酶, 2 L 10×PCR Buffer, 1. 5 mmo l/ L M gCl2, 2. 5% 去离子甲酰胺。PCR 扩增程序为: 94℃
预变性4 min, 94℃变性 30 s, 62℃( 62℃～58℃)退火45 s, 72℃延伸 1 min 45 s,共 11 个循环,每个循环退火温度降
1℃; 94℃变性30 s, 52℃( 52℃～48℃)退火 45 s, 72℃延伸1 min 45 s, 共24个循环; 72℃延伸5 min, 25℃保温。
关键词: 紫花苜蓿; ISSR ; PCR 反应体系; 优化
中图分类号: S 812; Q943 文献类型: A
Establishment and Optimization of ISSR Reaction System for Alfalfa
WANG Yu, YUAN Qing-hua
*
( In st itute of Animal Sciences , Ch inse Academy of Agricultural Sciences , Beij ing 100094, Chin a)
Abstract: Al falfa ( Medicago sat iva. L . ) w as subjected to ISSR ( Inter -simple sequence repeats) -PCR to
investig ate the genet ic diversity and the specific molecular marker s linked to specific character s. By
study ing the main parameters we established the opt imal ISSR-PCR react ion conditions in alfalfa. Results
show that the opt imum concentrat ions o f seven reactants in 20 L react ion mixture are as follow s: 15 ng
genomic DNA, 0. 2 mmol L
- 1
dNT P, 0. 4 mo l L - 1ISSR pr imer , 0. 8 U Taq DNA Polymer ase, 2 L 10×
PCR Buf fer , 1. 5 mmol L
- 1
MgCl 2, 2. 5% deionized formamide. T he suitable PCR procedure is one
pr elim inary denaturat ion at 94℃ for 4 m in; 11 cycles each invo lved denaturat ion at 94℃ fo r 30 s, anneal at
62℃( 62℃～58℃) for 45 s, w ith 1℃ declined each cycle, ex tended at 72℃ for 1 min 45 s; then fo llow ed
by 24 cycles each w ith denaturat ion at 94℃ for 30 s, anneal at 52℃ for 45 s, ex tended at 72℃ fo r 1 min 45
s; and a final ex tension at 72℃ for 5 min, then keep the temperature at 25℃.
Key words : Alfalfa; ISSR; PCR react ion sy stem ; Opt imizat ion
ISSR( Inter -simple Sequence Repeats)标记,即
简单重复序列区间DNA 标记, 是由Zietkiewicz等[ 1]
于1994年创建的一种基于PCR的分子标记技术。该
技术以加锚 SSR ( Simple Sequence Repeat )寡核苷
酸作引物,对2个相距较近、方向相反的SSR序列之
间的一段短DNA 片段进行扩增。ISSR标记为随机
引物, 引物设计简单, 不需知道DNA 序列即可用引
物进行扩增, 呈孟德尔式遗传, 具显性或共显性特
点[ 2]。 ISSR 标记产物多态性远比 RFLP、SSR、
RAPD 更加丰富, 可以提供更多关于基因组的信
息, 并且由于其引物较长、退火温度较高以及 SSR
在真核生物基因组中的广泛存在,使其多态性和稳
定性明显优于RAPD 标记技术, 实验重复性好, 现
广泛应用于植物的品种鉴定、基因定位、遗传作图、
进化和系统发育等方面的研究 [ 3～5]。在苜蓿(Med i-
cago L. )、胡芦巴( T rigonella L. )、葱( A ll ium L. )、
羊茅( Festuca L. )、拂子茅( Calamagrostis Adans. )、
冰草( A gr opyr on Gaertn. )和雀麦( Br omus L. )等属
收稿日期: 2006-9-20; 修回日期: 2007-03-04
基金项目: 国家自然科学基金( 30471230)
作者简介: 王瑜( 1981-) , 女,汉族,山东人, 博士研究生, 研究方向为牧草种质资源; * 通讯作者 Au th or for correspondence, E-mail:
Yuanqinghua@ hotmail. com
第15卷 第 3期
Vo l. 15 No . 3
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2007 年 5 月
May 2007
牧草的研究上, ISSR 标记也得到广泛应用[ 6]。
本试验旨在通过研究 ISSR-PCR反应中各项参
数变化对实验结果的影响,对 ISSR-PCR 反应体系
进行优化, 建立适用于紫花苜蓿 (M edicago sat iva
L. )的 ISSR反应体系, 为进一步对紫花苜蓿褐斑病
分子标记辅助选择育种技术体系的建立奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
供试紫花苜蓿材料为褐斑病高抗品种—伊鲁瑰
斯( Medicago sativa L. cv . Ir oquois) , 2005年4月种
植于中国农业科学院畜牧研究所实验地。
1. 2 基因组DNA提取及定量
基因组 DNA 提取采用改进 CT AB 法 [ 7]。用
0. 8%琼脂糖凝胶对DNA 质量进行电泳检测,并以
一定浓度DNA 作为定量参照标准。根据电泳检测
结果, 将 DNA 浓度调整为 10 ng /L, - 20℃保存
备用。
1. 3 ISSR扩增反应体系及程序
ISSR 引物由上海生物工程公司合成,去离子甲
酰胺购自上海生物工程公司, dNT P 和Taq DNA聚
合酶购自T aKaRa公司。由于苜蓿中广泛存在以CA
为重复基序的简单重复序列[ 8] , 因此本试验以 848
号引物为固定引物, 其序列为: CACACACACAC-
ACACARG。扩增反应在0. 2 mL 离心管中进行,利
用 M J Research 公司的 PTC-100TM 扩增仪进行
扩增。
20 L 反应体系中各反应物含量为: 15 ng 模板
DNA , 0. 2 mmol/ L dNTP, 0. 4 mol/ L ISSR引物,
0. 8 U Taq DNA 聚合酶, 2 L 10×PCR Buf fer , 1. 5
mmol/ L M gCl 2, 2. 5% 去离子甲酰胺。ISSR-PCR
程序为: 94℃预变性 4 m in, 94℃变性 30 s, 62℃
( 62℃～58℃)退火45 s, 72℃延伸1 min 45 s, 共11
个循环, 每个循环退火温度降 1℃; 94℃变性 30 s,
52℃( 52℃～48℃)退火 45 s, 72℃延伸 1 min 45 s,
共24个循环; 72℃延伸5 min, 25℃保温。
1. 4 PCR结果检测
取7. 5 L PCR扩增产物与1. 5 L 6×加样缓
冲液( TaKaRa )混匀, 点入含 0. 5 g / mL EB的 2%
琼脂糖凝胶中, 在5 V / cm 电场强度下电泳 1～2 h,
凝胶在紫外灯下观察照相。
1. 5 ISSR反应条件优化
确定最佳反应条件时, 对反应体系各个因素设
置不同梯度水平。模板DNA 用量分别设置为5、10、
20和40 ng ; Taq DNA 聚合酶用量设置为0. 4、0. 6、
0. 8、1. 0、1. 2、1. 5、2. 0和3. 0 U ; Mg 2+浓度和dNT P
浓度设置一个正交试验,其中Mg 2+浓度依次为1. 0、
1. 5、2. 0和 2. 5 mmol/ L , dNT P 浓度依次为 0. 1、
0. 2、0. 4和 0. 6 mmol/ L ; 引物浓度梯度为0. 1、0. 2、
0. 4、0. 6和0. 8 mo l/ L ;当试验中对某一因素进行梯
度设置时, 其余因素均保持不变。PCR程序则主要调
节退火温度, 退火温度依次设为 48℃、50℃、52℃、
54℃和56℃。
2 结果与分析
2. 1 模板DNA用量对 ISSR-PCR的影响
从图1 可以看出,模板DNA用量为10与20 ng
时,均能产生清晰 ISSR 条带, 低浓度时产生大量非
特异性扩增条带,高浓度则只产生几条主带, 而无弱
带。建议在苜蓿 ISSR 研究中, 20 L 反应体系模板
用量取10～20 ng 为宜。
图1 模板 DNA 浓度对扩增结果的影响
F ig . 1 Effect of template DNA concentr ation on
amplification pa ttern
注: 图中M 为M ark er, 1～4表示模板DN A 用量,分别为5, 10, 20
和40 n g; Note: M : M ark er; 1 to 4 r epresent the amount of tem plate
DNA used as 5, 10, 20 and 40 ng, respectively.
2. 2 Taq DNA聚合酶用量对 ISSR-PCR的影响
T aq DNA 聚合酶是扩增反应的关键因素。由图
2可见, Taq DNA 聚合酶用量在0. 4～1. 5 U 之间时
均产生清晰稳定扩增条带,在高浓度2. 0～3. 0 U 下
则会产生非特异性扩增条带及大于1500 bp 的条带
213第 3期 王 瑜等:紫花苜蓿 IS SR-PCR反应体系的建立与优化
(图2)。综合实验效果和费用,在20 L 反应体系中,
Taq DNA聚合酶用量选择0. 8～1. 0 U 较为适宜。
2. 3 Mg2+ 与dNTP用量对 ISSR-PCR的影响
在Mg2+ 与 dNT P 的正交实验中, Mg 2+ 浓度为
1. 0 mmol/ L 时, 无扩增产物; Mg 2+ 浓度为 1. 5
mmol/ L , dN TP 浓度为0. 1和0. 2 mmol/ L 时, 均可
产生清晰稳定扩增条带; Mg 2+ 浓度为 2. 0～2. 5
mmol/ L 时, 产生非特异性扩增条带, 使得主带过粗
且过于模糊, 不易分辨条带(图3)。在 ISSR-PCR反
应体系中, Mg 2+ 浓度为1. 5 mmo l/ L , dNTP 浓度为
0. 1～0. 2 mmol / L 较为适宜。
图2 Taq DNA 聚合酶浓度对扩增结果的影响
Fig. 2 Effect o f Taq DNA po lymerase concentrat ion on
amplifica tion pattern
注:图中M 为Marker, 1～8表示Taq DNA 聚合酶用量,分别为
0. 4, 0. 6, 0. 8, 1. 0, 1. 2, 1. 5, 2. 0和3. 0 U; Note: M : M ark er; 1 to 8
repres ent th e am ount of T aq DNA polymerase used as 0. 4, 0. 6, 0.
8, 1. 0, 1. 2, 1. 5, 2. 0 and 3. 0 U, respectively.
图3 Mg2+和dNTP 浓度对扩增结果的影响
Fig. 3 Effect of M g2+ and dNT P concentr ation on
amplifica tion pattern
注:图中M 为Marker, Mg2+浓度: 1～4为 1. 0 mmol/ L; 5～8为
1. 5 mmol /L ; 9～12 为 2. 0 mm ol / L; 13～ 16为 2. 5 mmol/ L ; dNT P
浓度: 1, 5, 9, 13为 0. 1 mm ol / L; 2, 6, 10, 14为 0. 2 mmol /L ; 3, 7, 11,
15为 0. 4 mmol/ L ; 4, 8, 12, 16 为 0. 6 mmol /L ; Note: M : Marker ;
Concent ration s of Mg2+ represen ted by 1～4 are 1. 0 mmol /L ; 5～8:
1. 5 mmol/ L; 9～ 12: 2. 0 mmol /L ; 13 ～ 16: 2. 5 mmol/ L ;
Concent ration s of dNT P rep res ented by 1, 5, 9, and 13 are 0. 1
mmol / L; 2, 6, 10, 14: 0. 2 mmol/ L; 3, 7, 11, 15: 0. 4 mmol / L; 4, 8,
12, 16: 0. 6 mmol / L.
2. 4 引物浓度对 ISSR-PCR的影响
引物浓度在 0. 6～0. 8 mol/ L 时,有非特异性
条带且产生引物二聚体, 在0. 1～0. 2 mol/ L 时, 不
产生或仅产生少数条带,扩增效率低(图4) ,最适引
物浓度定为0. 4 mol/ L。
图4 引物浓度对扩增结果的影响
Fig . 4 Effect of pr imer concentr ation on
amplification pa ttern
注:图中 M 为 Marker , 1～ 5 表示 IS SR 引物浓度,分别为 0. 1,
0. 2, 0. 4, 0. 6和 0. 8 mol/ L; Note: M : Marker; 1 to 5 rep resent
th e concent ration s of ISSR p rimer us ed as 0. 1, 0. 2, 0. 4, 0. 6, and
0. 8 mol / L, respect ively.
2. 5 退火温度对ISSR-PCR的影响
退火温度为52℃时, 条带清晰稳定,低于52℃时
产生一条主带, 若干条弱带(图5) , 高于52℃时,特异
性增强,只有两条主带,无弱带,且产生引物二聚体,
所以, 848号引物的最适退火温度确定为52℃。
图5 退火温度对扩增结果的影响
Fig. 5 Effect of annealing t emperature on
amplification pa ttern
注:图中M 为M ark er, 1～5 表示退火温度,分别为 48, 50, 52, 54
和 56℃; Note: M-Marker, 1 to 5 repr esent anneal ing temperature
applied at 48, 50, 52, 54 and 56℃, respect ively.
3 讨 论
3. 1 合适的PCR 参数是保证 ISSR-PCR 扩增效果
的基本条件。文献报道的ISSR-PCR反应体系,不同
植物使用的模板DNA用量各不相同[ 9, 10]。本试验中
T aq DNA 聚合酶具有很高活性,在很广的用量范围
内均产生理想结果, 综合考虑确定其最适用量为
214 草 地 学 报 第 15卷
0. 8～1. 0 U。
3. 2 ISSR-PCR 反应中必须保证有足量的引物以
使PCR效率达到最高, 同时,为了保证PCR 反应的
特异性,引物与模板的比例需控制在一定范围, 如果
引物模板比太高, 则倾向于产生非特异性产物, 且容
易形成引物二聚体,如果太低, PCR的效率又会下
降[ 11 ]。
3. 3 Mg2+ 与dNTP 均是反应中的重要成分。Mg2+
是Taq DNA 聚合酶的激活剂,其浓度不仅影响酶的
活性及合成的可靠性, 而且还影响引物与模板的结
合效率、模板与PCR产物的解链温度以及产物的特
异性和引物二聚体的形成[ 12]。当游离Mg 2+ 浓度为
1. 2～1. 3 mmol / L 时, T aq DNA 聚合酶有最高活
性[ 13 ]。对于dNTP,如果浓度太高, T aq DNA 聚合酶
会以比正常速率高很多的速率使之错配而影响保真
性;如果浓度太低, 又会降低 PCR 的效率。另外,
M g2+ 与dNT P 可以等量结合[ 13]。本试验将这两个因
素综合考虑, 设计正交试验。
3. 4 PCR 反应中, 退火温度的高低直接影响到引
物与模板DNA 的特异性结合,退火温度过低则扩增
特异性差,背景深;退火温度过高则引物与模板结合
差, PCR产物丰度低。对于不同的ISSR引物需要各
自确定其最适退火温度。
3. 5 总之,在确定最适反应体系时,既要保证扩增
产物足量,条带清晰,重复性好, 又要兼顾节约成本
和尽量缩短试验周期的原则。
4 结 论
4. 1 确立了紫花苜蓿 ISSR-PCR反应体系。20 L
体系中各主要反应物最适含量分别为: 15 ng 模板
DNA , 0. 8 U Taq DNA 聚合酶, 0. 4 mo l/ L ISSR
引物, 0. 2 mmol / L dNT P, 1. 5 mmo l/ L M gCl2。
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Pub lish ers . 2000, 24-25
(责任编辑 张蕴薇)
215第 3期 王 瑜等:紫花苜蓿 IS SR-PCR反应体系的建立与优化