全 文 ：第 19 卷 第 4 期
Vol. 19 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2011 年 7 月
Jul. 2011
疯草内生真菌 FEL3生产 SW培养基的
最佳碳氮比优化
郭 伟, 李勤凡* , 孔祥雅, 任 杰, 荆新堂
(西北农林科技大学动物医学院,陕西 杨凌 712100)
摘要:为探讨碳氮比对甘肃棘豆( Oxy tr op is kansuensis )内生真菌 FEL3 产苦马豆素( Swainsonine, SW )的影响, 利用
单因素试验对最佳碳源和氮源进行了筛选。结果表明: 蔗糖和蛋白胨分别是理想的碳源和氮源; 采用中心组合设
计( Cent ral Composite Design, CCD)考察液体培养基中蔗糖和蛋白胨的比率对内生真菌 FEL3 产 SW 的影响, 并利
用 Design-Exper t 7. 1. 6 软件模拟得到二次多项式回归方程的预测模型; 当蔗糖为 1. 47 g L - 1 , 蛋白胨为
0. 29 g L - 1时, SW 浓度达到最大值 6. 71 10- 4 mol L- 1。试验结果将为利用疯草内生真菌 FEL3批量生产 SW
提供技术支持。
关键词:疯草内生菌 FEL3;液体培养; 响应面分析;苦马豆素;碳氮比
中图分类号: Q949. 32 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2011) 04-0674-04
Optimal C/ N Ratio for Producing Swainsonine ( SW)
Using Locoweed Endophytes FEL3
GUO Wei, LI Qin- fan* , KONG Xiang-ya, REN Jie, JING Xin- tang
( College of veterinary medicine, Northw es t A& F University, Yangling, S haanxi Province 712100, China)
Abstract: Effect of C/ N ratio in culture medium on producing Sw ainsonine ( SW) using Oxy tr op i s kansuen-
sis endophytes FEL3 w as studied by Central Composite Design ( CCD) . T he best carbon source and nit ro-
gen source w ere determ ined through single factor experiment. Results show ed that sucrose and peptone
w ere the best carbon and nit rog en source respect iv ely . T he predict ive po lynomial quadrat ic equations mod-
el w as obtained by Design-Expert 7. 1. 6 sof tw ar e. When sucro se and peptone w er e 1. 47 g L- 1 and 0. 29
g L- 1 respectively, the SW content w as maximum, ( 6. 71 10- 4 mol L- 1 ) . T hese r esults pro vide tech-
nical support for large-scale SW pr oduct ion using Oxy trop i s kansuensis endophytes FEL3.
Keywords: Locoweed endophytes FEL3; L iquid culture; Response surface analysis; Swainsonine; C/ N ratio
疯草( Locow eed)是豆科棘豆属( Ast ragalus)和
黄芪属( Ox y tr op is )毒草的统称, 其营养丰富, 各种
营养成分近似于优质苜蓿, 是一种潜在的牧草资
源[ 1] , 但含有毒性成分苦马豆素 ( Sw ainsonine,
SW) [ 2, 3] ,动物采食后会中毒, 出现精神沉郁、共济
失调等神经机能障碍为特征的疯草病( Loco ism ) ,
甚至死亡,严重影响草地畜牧业的发展 [ 1]。我国疯
草主要分布在西部草场, 西部草原生态环境日益恶
化,简单的灭除疯草只会加剧草原生态环境的破坏,
把疯草转化为牧草资源或药物资源加以利用, 对保
护草原生态平衡,提高牧草资源利用率,促进草原畜
牧业可持续发展具有十分重要的社会、生态和经济
效益[ 4]。药物开发利用方面的研究表明, SW 具有
免疫调节、抑制肿瘤转移及扩散、抗病毒和保护细胞
等功效, 有十分诱人的医用价值 [ 5~ 7] , 但 SW 化学合
成的成本太高,制约了 SW 在医用方面的进一步研
究。Braun等 [ 8]从疯草中分离到可以产生 SW的内
生真菌可为 SW 提供新来源,在我国,余永涛等 [ 9]利
用薄层色谱法和气相色谱法作为 SW 的检测工具,
成功地从甘肃棘豆( Oxy trop i s kansuensis ) 中分离
出产 SW 的内生真菌 FEL3。本试验利用余永涛
等分离的产SW的内生真菌FEL3, 在单因素试验的
收稿日期: 2010-12-20;修回日期: 2010- 05-06
基金项目:国家自然科学基金项目( 30871901) ;陕西省科技攻关项目( 2008k02-06-2)资助
作者简介:郭伟( 1984- ) ,女,河南灵宝人,硕士,主要从事疯草内生菌方面的研究, E-m ail: a03988662230@ 163. com; * 通讯作者 Author for
cor resp on dence, E-m ail: l iqinfan@ yahoo. com. cn
第 4期 郭 伟等:疯草内生真菌 FEL3生产 SW 培养基的最佳碳氮比优化
基础上,采用响应面分析法, 对内生真菌 FEL3 产
SW液体培养的最佳碳氮比进行研究, 为生物合成
SW奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
甘肃棘豆内生真菌 FEL3, 由西北农林科技大
学临床实验室提供;对硝基苯基--D-甘露糖吡喃糖
苷( Sigma公司) ; 其他试剂均为分析纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 种子液的制备 马铃薯葡萄糖培养基
( PDA)分装于 50 mL 三角瓶, 每瓶装 20 mL, 取斜
面培养保存的菌种, 活化后接种于液体培养基,静置
培养 7 d, 用血球计数板法计数, 稀释培养液至孢子
数为 1. 2 109 个 L- 1作为种子液,用于接种。
1. 2. 2 液体培养方法 将培养基分装于 50 mL 的
三角瓶中,每瓶中装 20 mL,接种种子液 1 mL,置于
摇床中,以 150 r min- 1的转速, 20 培养。
1. 2. 3 培养液中 SW 浓度的测定 取 1 mL 培养
液于 1. 5 mL EP 管中, 5000 r min- 1离心 20 m in,
取上清液, 参照 T ay lor [ 10] 报道的方法检测培养液
中的 SW 浓度。
1. 2. 4 单因素试验 将查氏培养基中的葡萄糖分
别用蔗糖、可溶性淀粉、乳糖、燕麦片(过滤)代替, 配
制成 5种不同碳源的培养基; 将查氏培养基中的硝
酸钠分别用豆粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、氯化铵和
硫酸铵代替,配制成 7 种不同氮源的培养基。将不
同碳源和氮源培养基分装到 50 mL 三角瓶中, 每瓶
20 mL, 试验设 3 个重复, 高压灭菌 ( 120 , 30
min) ,冷却后接种1 mL 种子液,置于摇床中,以150
r min- 1的转速, ( 20 1) 培养 15 d后,测定培养
液中 SW 的浓度。
1. 2. 5 最佳碳氮比优化 以选择的碳源和氮源作
为考察对象,进行中心组合试验设计,建立最佳碳氮
比的拟合模型, 检验回归方程的拟合度,用响应面分
析,获取最佳碳氮比。
1. 3 数据处理
采用 SPA SS 11. 5 软件进行方差分析。
2 结果与分析
2. 1 单因素试验
5种碳源培养基进行筛选,接种后培养 15 d, 测
量培养液中 SW 的浓度。结果表明, 以燕麦片、蔗糖
为碳源时, 培养液中 SW 浓度显著高于其他碳源
( P< 0. 01) ,分别为6. 55 10- 4 mol L- 1和6. 54
10- 4 mol L- 1 (图 1)。由于蔗糖成分单一, 首选为
疯草内生真菌 FEL3液体培养的碳源。
图 1 不同碳源培养后培养液中 SW浓度
Fig. 1 SW concentration pr oduced by endophytes
FEL3 under differ ent carbon sour ces
注: 1, 2, 3, 4, 5 分别代表葡萄糖、蔗糖、乳糖、燕麦片、可溶性淀粉。
数据为 平均值 标准误。不同大写字母表示差异极显著 ( P <
0 01) ,下同
Note: 1, 2, 3, 4, 5 represents glucose, sucrose, lactose, oatmeal, tra-
gantine, respectively. Data are the means SE. Dif ferent capital let ters
represent significant diff erence( P< 0. 01) . T he same as below
7种氮源培养基分别培养疯草内生真菌 FEL3
15 d后,测定培养液中 SW 的浓度。结果表明, 以
豆粉为氮源时, SW 浓度显著高于其他氮源 ( P<
0 01) , 达到 6. 54 10- 4 mol L - 1 ; 以蛋白胨为氮
源时, SW 浓度显著高于以酵母膏、牛肉膏、硝酸钠、
氯化铵和硫酸铵为氮源( P< 0. 01) , 为 6. 52 10- 4
mol L - 1 (图 2)。由于蛋白胨质量更稳定,是疯草
内生真菌 FEL3液体培养产 SW的首选氮源。
图 2 不同氮源培养后培养液中 SW浓度
Fig. 2 SW concentration pr oduced by endophytes
FEL3 under differ ent nitr og en sour ces
注: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7分别代表豆粉、酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、硝
酸钠、氯化铵和硫酸铵
Note: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 represents soya flour, yeast ext ract, beef
ext ract , proteos e peptone, sodium nit rate, ammonium chloride an d
ammonium su lfate, respect ively
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草 地 学 报 第 19卷
2. 2 中心组合试验设计
根据中心组合 Box-Behnkend的中心试验设计
原理,结合单因素试验的结果, 选取疯草内生真菌
FEL3液体发酵培养产 SW 较高的蔗糖和蛋白胨进
行设计,采用 2 因素 5 水平响应面分析方法[ 11] , 试
验因素与水平设计见表 1。中心组合试验设计及试
验结果见表 2。表 2 中 3, 8, 9, 12, 13是中心试验,
用来估计试验误差, 其余为析因试验。
表 1 响应面分析水平与因素
Table 1 Variable and code levels used in RSM
因素 Factor 编码水平 Code levels
1. 414 1 0 - 1 - 1. 414
X1 蔗糖, g L- 1 1. 69 1. 5 1. 05 0. 6 0. 41
X2 蛋白胨, g L - 1 0. 33 0. 3 0. 22 0. 15 0. 12
表 2 中心组合试验设计及试验结果
Table 2 Design and results o f CCD
试验号
No.
X1
g L- 1
X 2
g L- 1
SW浓度 10- 4m ol L- 1
SW con cent rat ion
1 0 1. 414 6. 24
2 1. 414 0 6. 43
3 0 0 5. 91
4 - 1 1 5. 21
5 1 1 6. 72
6 - 1 - 1 3. 60
7 0 - 0. 414 4. 53
8 0 0 6. 00
9 0 0 6. 50
10 1 - 1 5. 42
11 - 1. 414 0 3. 96
12 0 0 5. 78
13 0 0 5. 80
2. 4 中心组合试验结果分析
利用 Design-Expert 7. 1. 6 统计软件对表 2 的
试验结果进行响应面方差分析, 结果见表 3。疯草
内生真菌 FEL3产 SW 的液体培养中,蔗糖、蛋白胨
2个反应因素一次相( X 1 , X 2 )二次相( X 1 2 , X 2 2 )的
P 值都小于 0. 01, 说明 2 个反应因素均对产 SW 具
有显著性意义, 而 2 个反应因素之间的交互作用
X 1X 2 的 P 值大于 0. 05, 说明 2个因素之间不存在
交互作用, 回归方程存在极大值。借助软件进行模
拟,得到培养液中 SW 浓度预测模型的回归方程: Y
= - 03389+ 60. 29623X 1 + 2. 32256X2 + 27 407410- 3
X 1X 2 - 0. 12852X 1
2
- 5. 11556X 2
2
, 公式中, Y 代表
培养液中 SW 浓度, X 1 和 X 2 分别表示蔗糖、蛋白
胨浓度。该模型方程的决定系数 R 2= 0 9664, 说明
了试验所选模型显著性高,拟合度好,实际值与预测
值之间有高度的相关性。用回归方程代替试验真实
点对试验结果进行分析是可行的。当 X1= 1. 47 g L- 1 ,
X 2 = 0. 29 g L- 1时, SW 浓度达到最大值 6. 71
10- 4 mol L- 1。
表 3 SW浓度的 ANOVA分析结果
Table 3 ANOVA results o f SW production
来源
Source
离差平方和
Sum of square
自由度
df
均方
M ean square
F 值 P值
模型 Model 11. 09 5 2. 22 40. 26 < 0. 0001
X1 5. 82 1 5. 82 105. 66 < 0. 0001
X2 3. 55 1 3. 55 64. 43 < 0. 0001
X1X2 0. 024 1 0. 024 0. 44 0. 5301
X1 2 1. 20 1 1. 20 21. 71 0. 0023
X2 2 0. 71 1 0. 71 12. 90 0. 0088
残差 Residual 0. 39 7 0. 055
失拟项 Lack o f Fit 0. 039 3 0. 013 0. 15 0. 9243
纯试验误差 Pure Error 0. 35 4 0. 087
总体 T ot al 11. 47 12
2. 5 响应面分析
三维响应面分析图和等高线图是回归方程的直
观描述,通过立体图可以很直观、高效地找到最佳参
数、各参数之间的交互作用和最大响应值。根据回
归方程得到不同浓度碳源、氮源的响应面三维立体
图和等高线图,见图 3。由图可以看出 X 1 和 X 2 二
者之间的交互作用不显著, 随着二者浓度的增大,响
应值也随之增大, 曲面存在最高点。
2. 7 试验验证
为了检验模型的准确性, 按照模型预测的 3个
试验点分别对疯草内生真菌 FEL3进行培养, 每个试
验点重复 3次, 试验结果菌液中 SW 浓度为 6. 69
10
- 4
mol L- 1 ,与模型预测值相比误差非常小。
3 讨论
碳源和氮源是微生物生长所需的主要营养成
分,但碳源过多,容易形成较低的 pH ; 若碳源不足,
容易引起菌体的衰老和自溶。氮源过多, 会使菌体
生长过于旺盛, pH 偏高, 不利于代谢产物的积累;
氮源不足,则菌体繁殖量少,从而影响产量。另外,
碳氮比不当会引起菌体按比例吸收营养物质,从而
直接影响菌体的生长和产物的合成 [ 12]。因此,为提
高甘肃棘豆内生真菌 FEL3产 SW 的能力, 必须进
行液体培养中最佳碳氮比的优化。本试验采用响应
面分析法对最佳碳氮比进行优化, 此方法是目前培
养基优化研究方面最好的方法, 可以对多个变量影
响的响应问题进行数学建模与统计学分析, 并可以
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第 4期 郭 伟等:疯草内生真菌 FEL3生产 SW 培养基的最佳碳氮比优化
图 3 不同浓度蔗糖和蛋白胨对 SW浓度的等高线分析和响应面
Fig . 3 Differ ent concentrations o f sucr ose and peptone on SW response sur face and cont our analy sis
将该响应进行优化, 已广泛的应用在物理学、食品
学、农学、化学等领域 [ 13]。
疯草毒素 SW 作为药物开发利用的重点是其抗
癌作用,目前的研究表明 SW 能抑制肿瘤的生长和
转移, 增强 NK 细胞和 LA K 细胞对肿瘤细胞的杀
伤力, 刺激宿主的免疫系统对肿瘤的杀伤活性。它
还可刺激骨髓细胞增殖, 抑制细胞毒抗肿瘤药对机
体的副作用,作为一种化疗的辅助药物 [ 14, 15]。在国
外, SW 已经用于治疗肿瘤的临床试验研究,将是一
种潜在抗肿瘤药物。
疯草内生菌的研究结果表明, 未感染内生真菌
的植株不产生 SW,疯草中 SW 是由内生真菌产生,
如何除去疯草中内生真菌将成为今后疯草开发利用
方面新的研究方向。同时, SW 具有诱人的医用价
值,疯草内生菌作为 SW 的新来源日益受到人们的
重视, Br aun等[ 8] 研究发现疯草内生菌中 SW 的含
量在 471 g g- 1至 18000 g g - 1 ,余永涛等[ 9] 测
得疯草内生真菌 FEL3 菌丝中 SW 含量为 400. 52
g g - 1 ,同时发现培养液中含有 SW, 但目前缺乏
内生疯草真菌生产 SW 的系统研究, 本试验采用
CCD的试验设计方法,对疯草内生菌 FEL3液体培
养基的碳氮比例进行研究, 结果显示, 当蔗糖是
1 47 g L - 1 ,蛋白胨 0. 29 g L- 1时, SW 浓度达到
最大值 6. 71 10- 4 mol L - 1 , 为利用疯草内生真
菌生产 SW 提供依据, 以促进 SW 在临床医学上的
普遍使用。
4 结论
本试验采用响应面分析法, 对疯草内生真菌
FEL3产 SW液体培养的最佳碳氮比进行了优化,首
先利用单因素试验确定蔗糖和蛋白胨是液体培养基
的最佳碳源和氮源, 最后采用 Box-Behnken 设计和
Desige-Expert软件分析确定蔗糖和蛋白胨的最佳加
入量,通过对二次多项式数学模型求极值可知, 当蔗
糖是 1. 47 g L- 1 , 蛋白胨 0. 29 g L- 1时, 能获得
SW在菌液中的最大产量, 在最佳培养基条件下培
养, SW浓度达到最大值 6. 71 10- 4 mol L- 1。
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(责任编辑 李美娟)
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