全 文 ：第 18 卷 第 3 期
Vol. 18 No. 3
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 5 月
May 2010
杂花苜蓿 SRAPPCR反应体系的正交优化
周良彬1 , 卢欣石1* , 赖黎丽2
( 1. 北京林业大学草业科学系, 北京 100083; 2. 新疆农业大学草业与环境科学学院, 新疆 乌鲁木齐 830052)
摘要: 利用正交设计 L 16( 45 )对杂花苜蓿(Medicag o var ia Mar tin. ) SRAPPCR 反应体系的 5 因素 ( T aq 酶、Mg2+ 、
模板 DNA、dNT P、引物)在 4 个水平上进行优化试验, 旨在建立一套适用于苜蓿属 ( Medicago L . )种质资源的
SRAP标记技术体系。结果表明: 各因素对 PCR 反应结果都有显著影响,由 F值可知, dNT P的量对反应结果影响
最大 ,其次是 T aq 酶的量,模版 DNA 浓度的影响最小,各因素水平的变化对 PCR 反应的影响依次为: dNT P> Taq
酶> Mg2+ > 引物> 模板 DNA;筛选出各反应因素的最佳水平,建立杂花苜蓿 SRAPPCR反应的最佳体系( 25L )
为: dNT P 2 L ( 0. 20 mmol L- 1) , Taq DNA 聚合酶 0. 3L ( 1. 50 U ) , Mg 2+ 3L( 1. 50 mmol L - 1 ) ,上、下游引
物各 1 L ( 0. 40 mol L - 1 ) , 50 ng 模板 DNA1L , 10 PCR buffer 2. 5L (不含 Mg 2+ )。这一优化体系的建立,
为今后利用SRAP标记技术进行苜蓿属植物遗传图谱构建、遗传多样性分析及种质资源鉴定等研究奠定了技术基础。
关键词:杂花苜蓿; SRAP; PCR;正交设计; 优化
中图分类号: Q943 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2010) 03034507
Optimization for SRAPPCR System of Medicago varia
Martin. Based on Orthogonal Design
ZHOU LiangBin1 , LU XinShi1* , LAI Lili2
( 1. Grass lan d Research Inst itute, Beijin g Forest ry U niver sity, Bei jing 100083, Ch ina;
2. Col lege of Pratacultural and Envir onm ental Sciences, Xinjiang Agricul tu ral U nivers ity, Urumchi, Xinjian g Province 830052, Ch ina)
Abstract: Alfalfa is an important fo rage and have been planted for more than 2000 years in China . Carry
ing a lot of g enetic variat ion, alfalfa is an excellent plant fo r genet ic div er sity research, but the breeding
rate and level of r esearch o f alfalfa is behind of other crops. In the research o f the genet ic diversity of alfal
fa g ermplasm by using molecular marker s, a good PCR amplif ication system is essent ial. The o rthogonal
design was used to optim ize SRAPPCR amplif icat ion system on M edicago varia Mart in at four levels of
five factors( Taq DNA polymerase, M g2+ , DNA template, dNTP and pr imer ) respect iv ely . T his optim ized
system for SRAP marker w ould become one of the effect iv e protocols for further research. The different
facto rs have a signif icant impact on the PCR r eact ion. T he quant ity of dNTP w as the most impor tant af
fected facto r of PCR, and the concentrat ion of template DNA had the minimal impact. Various factors and
their changes in the lev el had the impact on PCR react ion, in w hich descending order is dNT P, T aq DNA
po lymerase, M g2+ , primer and DNA template. One of the most suitable 25 L SRAPPCR systems fo r
Medicago varia Mart in. containing dNTP 2 L( 0. 20 mmo l L - 1 ) , T aq DNA polymerase 0. 3 L ( 1. 50
U) , Mg2+ 3 L( 1. 50 mmol L - 1 ) , each primer 1 L ( 0. 40 mol L - 1 ) , 50 ng DNA template 1 L and 10
PCR buf fer 2. 5 L ( exclusion M g2+ ) w as established. This opt imized SRAPPCR sy stem w ould play an
important role in Medicago map construct ion, genetic diversity analysis, germplasm identif ication and so on.
Key words: M edicago varia Mart in. ; SRA P; PCR; Orthogonal design; Opt im ization
苜蓿(Medicago)是我国历史最悠久,栽培面积
最广的优良牧草[ 1]。杂花苜蓿 ( M edicag o varia
Mart in. ) 又名多变苜蓿 ( M . ver ia) , 属苜蓿属
(Medicago L. )植物,是由紫花苜蓿(M. sativa)、黄
花苜蓿( M. f alcata)及胶质苜蓿( M. glutinosa)之
间杂交产生的复合体,具有紫色绛色蓝色绿色黄
色白色等多种花色[ 2, 3] 。杂花苜蓿自身携带了大量
的遗传变异,一直是遗传多样性研究的优良植物,但
收稿日期: 20100128;修回日期: 20100412
基金项目: 863计划项目( 2008AA10Z149)和国家科技支撑项目( 2008BADB3B) ( 2006BAD01A19)资助
作者简介:周良彬( 1985 ) ,男,汉,四川简阳人,硕士研究生,研究方向为草地资源与生态, Email : zhoulbin@ 163. com; * 通讯作者 Auth or
for correspondence Email : luxin shi304@ 126. com
草 地 学 报 第 18卷
其育种速度和研究水平却落后于其他作物。国外对
苜蓿种质的研究已广泛深入到分子水平 [ 4~ 6] , 而国
内的研究多集中在形态学水平, 技术还不够成熟。
并且国内外研究多集中在紫花苜蓿上, 对杂花苜蓿
的研究还相对较少。
利用分子标记进行遗传学研究是理解遗传传递
的强有力的途径, DN A分子标记所揭示的遗传多态
性直接反映基因组 DNA 间的差异 [ 7]。相关序列扩
增多态性 ( Sequencerelated amplified polymor
phism ,简称 SRAP) , 是由 Li与 Q uiros [ 8] 于 2001
年提出的一种新型的基于 PCR的分子标记方法, 又
名基于序列扩增多态性 ( Sequencebased amplified
po lymor phism, SBAP)。SRAP 的原理是利用独特
的引物设计对 ORFs ( Open r eading frames, 开放阅
读框架)进行扩增,正向引物主要集中对外显子区域
进行特异扩增, 而反向引物主要作用于富含 AT 区
域序列的内含子和启动子区域。因不同物种、不同
基因型的内含子、启动子以及间隔序列长度不等而
产生多态性,属于一种新型的基于 PCR的随机引物
标记系统。近年来, 由于该标记具有简便、稳定、中
等产率、易于分离条带、在基因组中分布均匀等特
点[ 9, 10] ,其广泛应用于 QT L 分析[ 11]、遗传多样性研
究[ 12~ 14]、遗传图谱的构建 [ 15~ 17]、抗病基因的分子标
记等[ 1819] 诸多研究领域。
在利用分子标记进行遗传多样性研究时, 一个
优良的 PCR反应体系是至关重要的,这关系到样本
DNA 所扩增条带的质量好坏, 从而影响多态性条带
的统计和分析[ 20] 。在 SRAPPCR 反应体系中, 扩
增结果受 T aq 酶、Mg 2+ 、模板 DNA 等试验因素的
影响[ 21~ 2 5]。本试验在已有的研究基础上, 选取了对
试验结果影响较大的 Taq 酶、Mg 2+ 、模板 DNA、
dNT P 及引物共 5 种因素, 并将因素水平扩大到 4
个水平。运用 5因素 4 水平的正交试验设计, 对杂
花苜蓿 SRAP 反应体系进行优化, 旨在建立一个较
为完整可靠的杂花苜蓿 SRA P 反应体系,为今后研
究杂花苜蓿的遗传多样性以及优异种质选育等提供
分子水平的参考和帮助。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
供试材料为来源于中国新疆的杂花苜蓿 ( BL
01121) ,于 2008 年 8 月种植于北京林业大学草业
科学学科顺义实验基地, 2009年 4月开展试验。用
于 SRA PPCR反应的 Taq 酶、Mg 2+ 和 dNT P 购自
全式金公司。SRAP 引物由上海生工合成, 初步筛
选出: Me ( 5CGAAT CT TA GCCGGAT A3) 和
Em( 5GACTGCGT ACGAAT TAA C3)引物组合
作为正交实验优化的固定引物。
1. 2 DNA提取
选取 5 株杂花苜蓿材料, 分别提取其嫩叶
DNA, 将其混合作为 PCR反应的 DNA 模板。基因
组 DNA的提取采用稍加改良的 CTA B 法[ 26]。通
过 1%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测
DNA 浓度和纯度, 并调整浓度到 50 ng/ L, 检验合
格后将 DNA 样品于 4 冰箱内保存备用(图 1)。
图 1 杂花苜蓿 DNA检测
F ig. 1 T he elect rophor esis pattern o f genome DNA
fr om Medicago var ia Mart in
注: MDNA 分子量标准 Tr ans2K Plus Marker; 15为模板 DNA
Note: MT rans2K Plus Marker; 15: DNA template
1. 3 PCR反应因素水平的确定与正交表的设计
为了确定 PCR 反应中 5 个因素 ( T aq 酶、
Mg
2+ 、模板 DNA、dNT P、引物)的最佳水平, 选用
25 L 的体系,采用正交设计 L 16 ( 45 )在 4个水平上
进行试验。参加 PCR反应的因素及水平见表 1, L 16
( 4
5
)正交试验设计参考陈万胜等[ 27]的方法(表2)。
1. 4 SRAP反应
将正交设计的 16 个处理重复 3 次。SRAP
PCR反应采用的是复性变温法:循环包括 94 预变
性 5 min; 94 变性 1 min, 35 退火 1 m in, 72 延
伸 1 min, 共 5 个循环; 之后 35 个循环: 94 变性
1 min, 50 退火 1 m in, 72 延伸 1 min,最后 72
346
第 3期 周良彬等:杂花苜蓿 SRAPPCR 反应体系的正交优化
延伸 7 min; 4 保存。反应条件及热循环次数都参
考 Vandemar k 等[ 6] 进行的紫花苜蓿 DNA 样品
SRAP 扩增。所有的 PCR扩增在 Biometra TGra
dient T hermoblock 基因扩增仪上进行。
表 1 PCR 反应的因素和水平
Table 1 Facto rs and levels of PCR reaction
因素 Factor s
水平(体系终浓度)
Levels( f inal concent rat ion)
1 2 3 4
T aq 酶 ( U 25L- 1 )
T aq DNA polymeras e ( U 25 L- 1 ) 0. 50 1. 00 1. 50 2. 00
M g2+ ( m mol L- 1 ) 1. 00 1. 50 2. 00 2. 50
模板 DNA ( n g 25 L - 1)
DNA template ( ng 25 L- 1 ) 25. 00 50. 00 75. 00 100. 00
dNTP ( mmol L- 1 ) 0. 10 0. 15 0. 20 0. 25
引物 (m ol L- 1)
primer ( m ol L- 1 ) 0. 20 0. 30 0. 40 0. 50
产物检测:以 lXT AE 为电泳缓冲液, 以天根公
司的 DL2000Marker为对照,将扩增产物在含有 0. 5
g L - 1溴化乙锭( EB)的 1%琼脂糖凝胶电泳中以
5V cm- 1的电压电泳分离, 然后在 SHANGHAI
SIXING SX300凝胶成像仪上观察照像、记录结果。
2 结果与分析
2. 1 正交试验结果及分析
根据电泳结果(图 2) , 参照郑轶琦等 [ 24]和陈万
胜等[ 27]的方法,对扩增结果进行直观分析。按照条
带数量丰富、清晰度高、背景低的原则,依次给 16个
处理打分,最佳产物记为 16分, 与此相反,最差的记
为 1分。3 次重复分别独立统计, 重复 1的评分结
果见图 2, 重复 2 和重复 3的评分结果分别为: 1,
11, 9, 8, 6, 12, 2, 3, 10, 15, 7, 4, 13, 5, 14, 16; 2, 7, 12,
8, 1, 13, 3, 4, 5, 14, 10, 11, 9, 6, 16, 15。
表 2 PCR反应的因素水平 L16( 45 )正交试验设计
T able 2 L 16 ( 45 ) o rthogonal design fo r the factor s and levels of PCR reaction
编号 No.
T aq 酶 ( U 25 L- 1)
T aq DNA
polymerase ( U 25 L- 1)
M g2+
( mm ol L- 1 )
模板DNA ( ng 25 L- 1)
DNA
tem plate ( ng 25 L- 1)
dNTP
( mmol L- 1 )
引物 (mol L- 1 )
Primer
( mol L- 1 )
1 0. 5 1 25 0. 1 0. 2
2 0. 5 1. 5 50 0. 15 0. 3
3 0. 5 2 75 0. 2 0. 4
4 0. 5 2. 5 100 0. 25 0. 5
5 1 1 50 0. 2 0. 5
6 1 1. 5 25 0. 25 0. 4
7 1 2 100 0. 1 0. 3
8 1 2. 5 75 0. 15 0. 2
9 1. 5 1 75 0. 25 0. 3
10 1. 5 1. 5 100 0. 2 0. 2
11 1. 5 2 25 0. 15 0. 5
12 1. 5 2. 5 50 0. 1 0. 4
13 2 1 100 0. 15 0. 4
14 2 1. 5 75 0. 1 0. 5
15 2 2 50 0. 25 0. 2
16 2 2. 5 25 0. 2 0. 3
2. 2 各因素对 PCR反应影响的差异分析
将上述处理和评分结果用统计软件 SPSS 16. 0
进行方差分析, 结果见表 3。由 F 值可知, dNTP 的
量对反应结果影响最大, 其次是 Taq 酶的量, 模版
DNA 浓度的影响最小, 各因素水平的变化对 PCR
反应的影响从大到小的顺序依次为: dNT P、T aq
酶、Mg2+ 、引物、模板 DNA。由于各因素间的差异
均达到极显著水平,可进一步进行因素内多重比较
分析。
2. 3 因素内各水平对 PCR结果的影响
为了进一步确定各因素的最佳反应水平,在方
差分析后, 继续对每个因素各个水平做多重比较。
各因素的水平变化时, 试验效果的变化情况可通过
因素指标图来反映, 并进一步考虑各因素对反应结
果的综合影响来确定因素的最优水平。对每个因
素,以试验评分结果的平均值为纵坐标,因素的水平
为横坐标作因素指标图。评价结果如下:
2. 3. 1 dNT P 浓度对 PCR结果的影响 dN TP 是
347
草 地 学 报 第 18卷
图 2 正交设计 SRAPPCR产物电泳结果
F ig. 2 Elect rophor esis r esults of SRAPPCR products by o rthogonal design
注: M标准分子量 DL2000;顶部 116处理编号同表 2,底部为 116级评分
Note: MM ark er DL2000; Top 116 t reatment as show ed in table 2, th e bottom of the rat ings for the 116 grade
表 3 各 PCR反应因素间方差分析表
Table 3 Var iance analysis for the facto rs of PCR reaction
方差来源
Sou rce
方差
Type Sum of
Squares
自由度
DF
均方
M ean
Squ are
F 值
F
Ta q 酶
Taq DNA polymerase
228. 333 3 76. 111 18. 832**
Mg2+ 134. 667 3 44. 889 11. 107**
模版 DNA
DNA template
74. 667 3 24. 889 6. 158**
dNTP 328. 667 3 109. 556 27. 107**
引物 prim er 124. 333 3 41. 444 10. 254**
误差 E rror 129. 333 32 4. 042
总计 T otal 4488. 000 48
修正后总计
Corrected Total
1020. 000 47
PCR扩增反应的原料,必须满足一定浓度才能完成
扩增,当浓度低时, 扩增受限, 浓度过高时则会导致
聚合酶错误的掺入, 进而影响扩增,所以要严格控制
体系中 dNTP 的浓度。dNT P 浓度对 PCR 反应结
果的影响如图 3 所示, 在 0. 10 mmol L - 1至 0. 20
mmo l L- 1水平上对结果的影响呈现上升趋势。
0. 20 mmol L- 1和 0. 25 mmol L- 1水平上效果差
异不大,但趋势有所下降。因此确定 dNT P 的最佳
水平为 0. 20 mmo l L - 1。
2. 3. 2 Taq酶浓度对 PCR结果的影响 由关系曲
线波动幅度可知(图 3) , T aq 酶在 2 U 水平的扩增
效果较好。酶浓度过高时, 会产生大量的杂带, 并且
背景较深,不利于遗传多样性的分析;酶的用量偏低
会使新链合成效率下降,导致扩增产物的减少, 因此
酶的用量很重要。从图 3可看出, 1. 5 U 水平也能
产生相对较好的结果, 经试验证明 1. 5 U 水平也能
达到良好的扩增效果, 且比较经济。因此, 应选择
1. 5 U 水平做为最佳反应水平。
2. 3. 3 Mg 2+ 浓度对 PCR结果的影响 Mg2+ 浓度
不仅影响酶的活性和真实性,而且影响引物退火和
解链温度,从而影响产物的特异性和扩增产物的产
率。浓度过高, 反应特异性降低,出现非特异扩增,
浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性, 使反应
产物减少。由关系曲线波动幅度可知 (图 4) , 1. 50
mmol L- 1水平能产生最佳的结果, 随着浓度的增
加,反应效果呈下降趋势。因此,确定 1. 50 mmol/ L
水平为反应的最佳水平。
图 3 dNTP 浓度(左)、Taq 酶量(右)与结果均值的关系图
Fig. 3 Relationship betw een quantity of dNTP concentrat ion( left)、Taq DNA po lymerase( r ight) and mean o f result
348
第 3期 周良彬等:杂花苜蓿 SRAPPCR 反应体系的正交优化
2. 3. 4 引物浓度对 PCR结果的影响 关系曲线波
动幅度显示(图 4) , 0. 4 mol L - 1水平下, 扩增能
达到最好的效果。引物浓度变化对 PCR 产物电泳
信号强弱的影响有关,浓度增加信号增强,同时浓度
过大导致条带背景的加深,影响了多态性的鉴别分
析。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体,
过低则降低产量。因此应选择峰值 0. 4 mo l L- 1
为反应的最佳水平。
图 4 Mg2+ 浓度(左)、引物浓度(右)与结果均值的关系图
Figure4 Relat ionship betw een quantity of Mg 2+ ( left)、pr imer ( r ight) and mean o f result
2. 3. 5 模板 DNA 浓度对 PCR结果的影响 关系
曲线波动幅度显示(图 5) , 25 ng 水平下得到的扩增
结果最好。有研究结果表明, 模板 DNA 浓度在
25. 00~ 120. 00 ng 范围内均可, 本试验在综合参考
众多文献的基础上, 最终确定, 50 ng 为最优模板
DNA 浓度。
图 5 模板 DNA浓度与结果均值的关系图
F ig . 5 Relationship between quant ity o f DNA
t emplate concentration and mean o f result
3 讨论
3. 1 影响杂花苜蓿 SRAPPCR扩增的因素分析
SRAPPCR扩增反应主要受到 DNA 提取质
量、PCR 扩增体系和扩增程序等因素的影响, 而
PCR体系中 T aq 酶、DNA、Mg2+ 及引物等因素对
扩增结果的影响较大。本试验主要针对 SRAP
PCR扩增反应体系进行优化,在前期 DNA 提取中,
采用了稍加改良的 CTAB 法[ 26] , 确保获得高质量的
DNA。在进行杂花苜蓿 SRAP 扩增反应体系的优
化实验时发现, dNT P 的量对反应结果影响最大, 其
次是 T aq 酶的量,模版 DNA 浓度的影响最小,各因
素水平的变化对 PCR反应的影响从大到小依次为:
dNT P、T aq 酶、Mg 2+ 、引物、模板 DNA。dNT Ps 浓
度对杂花苜蓿 SRAP 扩增结果影响明显, 这与郭大
龙等[ 28]和付立忠等 [ 29]的研究结果相同。T aq DNA
聚合酶用量对杂花苜蓿 SRA P 扩增结果的影响也
较大,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合
成产物量减少。Mg2+ 浓度和引物浓度对扩增结果
的影响相对较弱, 添加 1. 50 mmo l L - 1 Mg2+ 和
0. 40 mol L- 1的引物浓度,反应体系的扩增效果
最好, 该结果与郑轶琦 [ 24]、袁菊红 [ 30]的研究结果相
符。研究发现, 较低浓度的模板 DNA 就能满足杂
花苜蓿 SRA P扩增的需要,这与 SRAP 的高扩增效
率有一定关系。虽然 SRAP 对模板 DNA 浓度没有
严格要求,但由于不同样品提取的 DNA 得率不完
全相同, DNA 样品浓度存在较大差异, 所以在 PCR
反应之前应检测并调整各样品的 DNA 浓度, 使之
达到基本一致,这样既能保证扩增的成功率,也有利
于获得可比性和重复性强的结果。
此外, 扩增程序对 PCR 扩增效果的影响也较
大,但由于 SRAP 引物使用的是通用型随机引物,
有部分引物组合在不同种属植物间可以通用,因此,
扩增程序对 SRAPPCR扩增结果的影响相对较小。
目前, SRAPPCR反应体系中使用的扩增程序与 Li
和 Q uiro s[ 8] 的程序基本相同或稍加改良, 为了让
上、下游引物与 DNA 模板能部分配对,最初 5个循
环的退火温度较低,一般设置在 33 ~ 36 ;同时,
为了提高引物扩增的特异性,后 35个循环反应的退
火温度升高至 47 ~ 55 。在杂花苜蓿 SRAP
PCR反应体系中, 前 5个循环采用 35 的退火温
度,后 35个循环采用 50 的退火温度,获得了较理
想的扩增结果。在 PCR扩增过程中,大多数研究者
设置 25~ 45 个循环[ 31, 32] , 理论上在能检测到清晰
扩增条带的情况下,循环次数越少越好,过多的循环
349
草 地 学 报 第 18卷
次数将导致一些非特异性产物的干扰, 错配比例上
升,且效率降低。本试验采用 35 个循环,获得的扩
增条带清晰、多态性丰富、结果重复性较强, 能满足
PCR扩增的要求。综上可知,为了获得良好的 PCR
扩增结果,除了对 T aq 酶、DNA、Mg 2+ 、引物及模版
DNA 等因素进行优化外, 必要时也应该同时对循环
次数及退火温度进行摸索。
利用正交试验设计对杂花苜蓿 SRAPPCR 反
应体系进行优化,得到的最佳反应体系( 25 L)为:
dNT P2 L( 0. 20 mmol L- 1 ) , T aq DNA 聚合酶
0. 3 L ( 1. 50 U) , M g2+ 3 L( 1. 50 mmo l L- 1 ) ,
上、下游引物各 1 L ( 0. 40 mol L- 1 ) , 50 ng 模
板 DNA1 L, 10 PCR buf fer2. 5 L ( 不含
Mg 2+ )。该试验体系与 Vandemar k 等[ 6] 的试验体
系有部分差异, 这可能是由于不同种及试验条件差
异造成的。Vandemark 等 [ 6] 的研究结果显示了
SRAP 标记在紫花苜蓿种质的遗传多样性分析等研
究中能起到极大的作用。虽然国内对苜蓿属种质的
SRAP 标记研究还相对较少,但在其他牧草上,其可
行性已经得到广泛验证。例如曾兵[ 34] 通过 SRAP
标记对鸭茅 ( Dacty l is glomerata L. ) 种质进行研
究,每对引物组合的多态性带数为 17. 29条, 多态性
条带比率( PPB)为 82. 08%。
3. 2 不同分析方法比较
利用正交试验设计进行 PCR 体系优化的方法
可以综合考察 PCR反应体系中各因素及其交互作
用,与以往的单因素 PCR优化设计相比, 利用正交
实验直观分析的方法, 能够快速获得满意的试验结
果,减少试验的工作量,降低试验成本[ 24, 33]。
在对正交试验结果进行分析的时候,通常采用
极差分析法和方差分析法。前者直观、简单, 但过于
粗糙;后者能得到更详细的有关结论, 但计算量稍
大。对于 SRAPPCR扩增体系的优化结果,笔者建
议最好是采用方差分析法。因为极差分析法没有把
因素水平的改变所引起的试验结果的波动与由试验
误差引起的试验结果的波动进行比较, 也没有提供
一个标准来判断因素的作用是否显著, 而方差分析
法能够有效地克服这些不足。
4 结论
综上所述, SRAP 标记用于苜蓿属种质遗传多
样性研究是切实可行的, 该试验体系可进一步推广
应用到苜蓿属种质的 SRAP 标记研究中。利用正
交试验设计对杂花苜蓿 SRAPPCR反应体系进行
优化,得到的最佳反应体系( 25 L)为: dNTP 2 L
( 0. 20 mmol L - 1 ) , Taq DNA 聚合酶 0. 3 L
( 1. 50 U) , M g2+ 3 L( 1. 50 mmol L- 1 ) ,上、下游
引物各1 L ( 0. 40 mol L - 1 ) , 50 ng 模板 DNA
1 L, 10 PCR buf fer 2. 5 L (不含 Mg2+ )。
参考文献
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(责任编辑 才 杰 李 扬)
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