全 文 ：第21卷 第1期
Vol.21 No.1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2013年 1月
Jan. 2013
中国芒属植物ISSR-PCR扩增反应体系的优化
卢玉飞,蒋建雄,易自力∗
(湖南农业大学生物科学技术学院,湖南 长沙 410128)
摘要:芒属植物(Miscanthus)被认为适合作为新一代能源作物开发利用而成为当前国内外研究热点之一。为给后续
相关研究奠定基础,本研究从中国芒属植物的芒(Miscanthussinensis)、五节芒(M.floridulus)、荻(M.sacchariflo-
rus)、南荻(M.lutarioriparius)、尼泊尔芒(M.nepalensis)、双药芒(M.nudipes)和红山茅(M.paniculatus)等类群中挑
取部分材料,以其基因组DNA为模板,采用同一试验考察多个因素及水平的筛选方式对ISSR-PCR扩增体系中的
Mg2+、dNTP、引物、模板的浓度以及循环数进行优化,建立适用于中国芒属植物的最佳ISSR-PCR反应体系。该体系
为20μL,含 Mg2+2.5mmol·L-1,dNTP0.25mmol·L-1,引物0.5μmol·L-1,DNA2μL及1UTaqPlusDNA聚
合酶和1×PCRbuffer。结果将为进一步开展中国芒属植物的相关遗传分析研究提供技术参考。
关键词:芒属;ISSR;PCR反应体系;优化
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2013)01-0167-07
OptimizationtheISSR-PCRAmplificationReactionSystemofMiscanthusfromChina
LUYu-fei,JIANGJian-xiong,YIZi-li∗
(ColegeofBioscienceandBiotechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,HunanProvince410128,China)
Abstract:Miscanthusandresson(Poaceae)hasrecentlybecomearesearchfocusbecauseithasbeendefined
asasecond-generationnon-foodenergycrop.Inthisstudy,genomicDNAsofMiscanthusspeciesfrom
ChinaincludingMiscanthussinensis,M.floridulus,M.sacchariflorus,M.lutarioriparius,M.ne-
palensis,M.nudipes,andM.paniculatuswerechosenasspecimensamplesforsubsequentassay.The
concentrationofMg2+,dNTP,primer,DNAtemplateandthenumberofamplificationcyclessuitablefor
ISSR-PCRamplificationreactionofMiscanthusspecieswereoptimizedusingthemultifactorandmultilevel
experiments.Finaly,anoptimalISSR-PCRamplificationreactionsystemfortheMiscanthusofChinawas
establishedsuccessfuly.The20μLvolumesofreactionsystemcontained1×PCRbuffer,Mg2+2.5
mmol·L-1,0.25mmol·L-1ofeachdNTP,primer0.5μmol·L-1,2μLDNA,and1unitofplusTaq
DNApolymerase,whichundoubtedlysuppliedthetechnicalreferenceforfurtherrelatedgeneticanalysisof
MiscanthusinChina.
Keywords:Miscanthus;ISSR;PCRreactionsystem;Optimization
芒属(Miscanthus)(禾本科Poaceae)是一类C4
高大禾草。因其生物产量高、碳中和、遗传适应性
强、适应边际土地(marginalland)种植,而作为了新
一代非粮能源植物开发利用[1-3],因此备受关注。按
陈守良和Renvoize[4]的分类体系,该属包含14种;
其中在中国分布有7种,分别为:芒(Miscanthus
sinensis)、五节芒(M.floridulus)、荻(M.sacchar-
iflorus)、南荻(M.lutarioriparius)、尼泊尔芒(M.
nepalensis)、双药芒(M.nudipes)和红山茅(M.
paniculatus)。
简单重复序列区间(intersimplesequencere-
peat,ISSR)标记技术由Zietkiewicz等人于1994所
建立[5],使用加锚的单一引物扩增两侧具有反向排
列 的 简 单 序 列 重 复 (simplesequencerepeats,
SSRs)之间的区域,能产生丰富的多态性位点来揭
示种间及种内的遗传差异[5-6],操作简单、快速、重复
性好,属显性标记,适合于系统学[5,7]、遗传多样
性[8-9]、图谱构建[10-11]等研究。芒属植物作为野生
收稿日期:2012-08-31;修回日期:2012-11-06
基金项目:国家自然科学基金项目(30971832);国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA10020903)资助
作者简介:卢玉飞(1976-),男,广西贵港人,讲师,博士研究生,研究方向为植物遗传学,E-mail:lyff1002@126.com;∗通信作者 Author
forcorrespondence,E-mail:yizili889@163.com
草 地 学 报 第21卷
群体,相关研究尚处于起步阶段。采用ISSR标记
开展相关研究,可以克服因对其基因组背景缺乏了
解所带来的不利影响。至今采用ISSR标记对芒属
植物开展研究的报道很少。Hodkinson等[12]采用
ISSR标记对部分芒属种质资源进行遗传评价,结果
揭示芒存在很明显的种内分化。金琳等[13]则对五
节芒的ISSR-PCR 反应体系进行了优化。刁英
等[14]采用包含ISSR在内的2种标记手段对五节芒
遗传多样性进行研究,结果都表明其遗传多样性水
平较高。虽然金琳等[13]曾采用单因子试验方法对
五节芒的ISSR-PCR反应体系进行了优化,但由于
该体系只使用了单个类群材料来优化,因此对芒属
其他类群材料的适用性并未完全可知。因此在对中
国芒属植物全部类群开展ISSR分析前有必要对
ISSR-PCR扩增反应体系再另行优化。本研究从
中国芒属植物的部分类群中挑取材料,以其基因组
DNA为模板,在已有相关经验的基础上,针对IS-
SR-PCR反应体系中的主要影响因子进行优化;进
而以中国芒属植物的全部7个类群为供试材料,对
该体系进行验证,从而建立适用于中国芒属植物的
稳定高效的ISSR-PCR反应体系,为后续开展有关
中国芒属植物的系统发育、遗传资源评价等相关遗
传研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
试验材料的分类群名称依照陈守良和 Ren-
voize[4]的分类体系。野外采集地下根状茎种质保
存于湖南农业大学芒属种质资源圃内。80份芒属
种质材料以及4份近缘属甘蔗属(Saccharum)种质
材料的详细信息如表1所示。
表1 供试材料
Table1 Plantmaterials
类群 Taxon 材料序号 No.ofaccession 采集号Serialnumber 采集地Samplinglocation
芒Miscanthussinensis 1 4111 海南屯昌 Tunchang,Hainan
2 2068 广西凭祥Pingxiang,Guangxi
3 6030 广西梧州 Wuzhou,Guangxi
4 6059 云南富宁Funing,Yunnan
5 6087 云南文山 Wenshan,Yunnan
6 4098 云南勐海 Menghai,Yunnan
7 3023 福建霞浦 Xiapu,Fujian
8 3120 广东梅县 Meixian,Guangdong
9 2209 贵州玉屏 Yuping,Guizhou
10 0057 四川自贡Zigong,Sichuan
11 4362 浙江洞头 Dongtou,Zhejiang
12 4372 浙江舟山Zhoushan,Zhejiang
13 4333 江西广昌 Guangchang,Jiangxi
14 0038 湖北秭归Zigui,Hubei
15 4085 重庆渝北 Yubei,Chongqing
16 4305 河南洛宁Luoning,Henan
17 4445 河南林州Linzhou,Henan
18 4031 陕西凤县Fengxian,Shaanxi
19 4025 陕西周至Zhouzhi,Shaanxi
20 4040 陕西城固Chenggu,Shaanxi
21 4147 山东青岛 Qingdao,Shandong
22 2387 辽宁宽甸 Kuandian,Liaoning
23 2351 吉林蛟河Jiaohe,Jilin
24 0035 湖北神农架Shennongjia,Hubei
25 4142 山东日照 Rizhao,Shandong
26 2442 辽宁丹东 Dandong,Liaoning
27 2415 辽宁鞍山 Anshan,Liaoning
28 2382 吉林吉安Ji′an,Jilin
五节芒M.floridulus 29 6047 广西玉林 Yulin,Guangxi
30 2005 广西龙胜Longsheng,Guangxi
861
第1期 卢玉飞等:中国芒属植物ISSR-PCR扩增反应体系的优化
续表1
类群 Taxon 材料序号 No.ofaccession 采集号Serialnumber 采集地Samplinglocation
31 3024 福建霞浦 Xiapu,Fujian
32 2091 广东鼎湖 Dinghu,Guangdong
33 2203 贵州雷山Leishan,Guizhou
34 0020 江西梅岭 Meiling,Jiangxi
35 4022 湖南浏阳Liuyang,Hunan
36 4154 湖南岳阳 Yueyang,Hunan
37 4163 湖北江厦Jiangxia,Hubei
38 4136 江苏连云港Lianyungang,Jiangsu
39 4409 安徽金寨Jinzhai,Anhui
40 4036 陕西勉县 Mianxian,Shaanxi
荻M.sacchariflorus 41 4464 湖北红安 Hong′an,Hubei
42 4443 河南林州Linzhou,Henan
43 4037 陕西城固Chenggu,Shaanxi
44 4030 陕西凤县Fengxian,Shaanxi
45 2487 甘肃泾川Jingchuan,Gansu
46 4023 宁夏永宁 Yongning,Ningxia
47 4218 山西安泽 Anze,Shanxi
48 4220 山西霍州 Huozhou,Shanxi
49 4208 山西昔阳 Xiyang,Shanxi
50 4451 河北阜平Fuping,Hebei
51 4452 北京密云 Miyun,Beijing
52 4146 山东青岛 Qingdao,Shandong
53 4138 山东日照 Rizhao,Shandong
54 4139 山东日照 Rizhao,Shandong
55 4457 山东东营 Dongying,Shandong
56 2463 辽宁康平 Kangping,Liaoning
57 2427 辽宁盖州 Gaizhou,Liaoning
58 2465 辽宁阜新Fuxin,Liaoning
59 2354 吉林安图 Antu,Jilin
60 2228 黑龙江伊春 Yichun,Heilongjiang
61 4049 黑龙江佳木斯Jiamusi,Heilongjiang
南荻M.lutarioriparius 62 0001 湖南长沙Changsha,Hunan
63 0003 湖南长沙Changsha,Hunan
64 4081 湖南长沙Changsha,Hunan
65 2109 湖南华容 Huarong,Hunan
66 4169 湖南岳阳 Yueyang,Hunan
67 0032 湖北神农架Shennongjia,Hubei
68 6009 重庆北碚Beibei,Chongqing
69 4129 江苏姜堰Jiangyan,Jiangsu
70 4122 江苏南京 Nanjing,Jiangsu
71 5033 安徽黄山 Huangshan,Anhui
72 4300 河南淅川 Xichuan,Henan
73 4460 河南光山 Guangshan,Henan
74 4125 江苏泰州 Taizhou,Jiangsu
75 4396 山东微山 Weishan,Shandong
76 5005 江西修水 Xiushui,Jiangxi
77 4133 江苏大丰 Dafeng,Jiangsu
尼泊尔芒M.nepalensis 78 3177 云南昆明 Kunming,Yunnan
双药芒M.nudipes 79 3178 云南昆明 Kunming,Yunnan
红山茅M.paniculatus 80 3181 云南昭通Zhaotong,Yunnan
河八王S.narenga 81 4106 海南琼海 Qionghai,Hainan
82 4076 湖南桂东 Guidong,Hunan
甜根子草S.spontaneum 83 6064 云南富宁Funing,Yunnan
84 0046 四川峨眉Emei,Sichuan
961
草 地 学 报 第21卷
1.2 ISSR引物
ISSR引物采用由加拿大哥伦比亚大学(Uni-
versityofBritishColumbia,UBC)公布的ISSR通
用引物,从中选择95条,由北京奥科生物技术公司
合成。
1.3 方法
基因组DNA提取:每份材料从一个单株里选
取生长状况良好的新鲜健康嫩叶约0.5g。总DNA
提取方法参照CTAB法[15]并稍加改良。得到的总
DNA干燥后加50~100μLTE缓冲液(10mmol·L-1
Tris-HCl,1mmol·L-1EDTA,pH8.0)溶解。由
于DNA未进一步纯化,所以没有按常规测量其浓
度,而是根据0.8%琼脂糖电泳检测结果中DNA条
带的亮度与粗细程度,将各材料的DNA稀释至大
致同一个浓度(估测约25ng·μL-1,图1)后直接用
于后续的PCR扩增。该浓度已在预备试验中证明
有效。DNA母液于-70℃保存。
图1 用于ISSR-PCR扩增的全部84份供试材料的DNA浓度
Fig.1 TemplateDNAconcentrationofal84accessionsusedforISSR-PCRanalysis
ISSR-PCR体系优化:采用将各种处理组合高
度集成的方式,重点针对 Mg2+、dNTP、引物、DNA
模板的浓度这4个因素来优化,并同时对比不同引
物、材料或循环数的扩增效果。依据经验和预备试
验的结果,每个因素选取3个浓度梯度进行对比(表
2)。每个试验重点考察其中1~2个因素,每个因素
重复考察2~3次,以反复验证。最后考察 Taq
DNA 聚合酶与 TaqPlusDNA 聚合酶对ISSR-
PCR扩增的影响效果。
表2 ISSR-PCR反应体系优化中的因素及水平
Table2 FactorsandlevelsofoptimalISSR-PCRreaction
水平
Levels
因素Factors
Mg2+
/mmol·L-1
dNTP
/mmol·L-1
引物Primer
/μmol·L-1
DNA
/μL
1 2.0 0.20 0.4 1.0
2 2.5 0.25 0.5 1.5
3 3.0 0.30 0.6 2.0
反应总体积为20μL,除上述5个组分之外,另
包含1×PCRbuffer,并用超纯水补平体系。扩增
反应在 BiometraPCR 仪上完成。反应程序为:
94℃预变性5min;94℃变性1min,54~58℃退火1
min,72℃延伸1.5min,循环数35;72℃延伸7min。
扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离,溴化乙锭
(EB)染色,在FR-200A凝胶成像系统上观察照相。
2 结果与分析
2.1 ISSR-PCR反应体系优化
Mg2+浓度对ISSR-PCR反应的影响:Mg2+直
接影响TaqDNA 聚合酶的活性、引物与模板的结
合效率和产物特异性,在反应液中能与多种带负电
荷的基团结合[16]。因此,需要筛选确定ISSR-PCR
反应中 Mg2+ 的最适浓度。本试验对比了3个
Mg2+浓度(2.0,2.5和3.0mmol·L-1)的扩增效
果,结果表明 Mg2+浓度选取2.5mmol·L-1时的
扩增条带最清晰,所以2.5mmol·L-1是 Mg2+的
最适浓度(图2)。结果同时初步表明dNTP浓度为
0.25mmol·L-1时的扩增效果最好。
dNTP浓度对ISSR-PCR反应的影响:dNTP是
ISSR-PCR反应的原料,其浓度过高会导致PCR错配
而降低准确率[13,17];浓度过低又会导致扩增产物少,
条带模糊[13],甚至会因为dNTP过早消耗而使产物
单链化[17]。本试验以1份随机挑选的荻为例(材料
采集号为2487),对比了3个dNTP浓度(0.2,0.25
和0.3mmol·L-1)对ISSR-PCR反应体系的影响。
结果表明dNTP浓度为0.25mmol·L-1时,扩增条
带最为清晰稳定,所以0.25mmol·L-1是dNTP的
最适浓度(图3)。结果同时初步表明循环数应采用
35次,DNA模板应选用2μL。
引物浓度对ISSR-PCR反应的影响:引物浓度
对ISSR-PCR扩增反应有较大的影响:浓度过低时
扩增效率低;浓度太高则会导致错配、非特异性扩增
和引物二聚体的出现几率增加[16]。本试验以
“UBC823”引物为例,对比了3个引物浓度(0.4,
0.5和0.6μmol·L-1)的扩增结果。结果表明:当
引物浓度为0.5μmol·L-1时,条带边缘最清晰且
稳定,所以认为0.5μmol·L-1是引物最适反应浓
度(图4)。本试验同时最终确认了扩增应采用35
个循环,并再次表明总体上DNA选用2μL时扩增
效果最好。
071
第1期 卢玉飞等:中国芒属植物ISSR-PCR扩增反应体系的优化
图2 不同 Mg2+浓度对ISSR-PCR扩增反应的影响
Fig.2 EffectsofMg2+concentrationonISSR-PCRamplification
注:反应体系中模板DNA加1μL,引物浓度为0.5μmol·L-1,TaqDNA聚合酶加1U,35个循环,退火温度为58℃
Note:ISSR-PCRreactionwasconductedwith1μLtemplateDNA,0.5μmol·L-1primers,1UTaqDNApolymerase,
35PCRcyclesandannealingtemperatureof58℃
图3 不同dNTP浓度对ISSR-PCR反应的影响
Fig.3 EffectsofdNTPconcentrationonISSR-PCRreaction
注:反应体系中 Mg2+和引物浓度分别为2.5mmol·L-1和0.5μmol·L-1,TaqDNA聚合酶加1U,退火温度为56℃
Note:ISSR-PCRreactionwasconductedwith2.5mmol·L-1Mg2+,0.5μmol·L-1primers,
1UTaqDNApolymeraseandannealingtemperatureof56℃
图4 不同引物浓度对ISSR-PCR反应的影响
Fig.4 EffectsofprimerconcentrationonISSR-PCRreaction
注:反应体系中 Mg2+和dNTP浓度分别为2.5mmol·L-1和0.25mmol·L-1,TaqDNA聚合酶加1U,退火温度为58℃
Note:ISSR-PCRreactionwasconductedwith2.5mmol·L-1Mg2+,0.25mmol·L-1dNTP,
1UTaqDNApolymeraseandannealingtemperatureof58℃
171
草 地 学 报 第21卷
DNA模板浓度对ISSR-PCR反应的影响:适宜
的模板量是确保获得特异性扩增的要素之一[17]。
模板浓度过低,扩增条带将很弱甚至没有;过高则扩
增条带的主带通常又太粗,而且条带边缘将出现弥
散现象,背景的非特异性条带也会增多,这些都将影
响条带判读。前2次对比试验(图3与图4)已初步
表明DNA模板使用2μL(约50ng)效果最理想。
本研究再以1份随机挑选的芒为例(材料的采集号
为3120),专门对DNA模板的3个常用量(1,1.5
和2μL)进行对比。结果最终确认了使用不同材料
与引物时,2μL往往都是DNA模板的最佳适用量,
此时扩增条带最为清晰,且背景干净(图5)。
图5 不同DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响
Fig.5 EffectsofDNAconcentrationonISSR-PCRreaction
注:反应体系中的 Mg2+和ISSR引物、dNTP浓度分别为2.5mmol·L-1,0.5μmol·L-1和0.25mmol·L-1,
循环数为35次,TaqDNA聚合酶用量为1U
Note:ISSR-PCRreactionwasconductedwith2.5mmol·L-1Mg2+,0.5μmol·L-1primers,0.25mmol·L-1dNTP,
1UTaqDNApolymeraseand35PCRcycles
循环数对ISSR-PCR反应的影响:循环次数对
扩增的影响很大[13]。循环数不足会导致扩增不完
全,扩增条带弱;循环数过多时,错配几率增加,非特
异性扩增条带增多,而且条带边缘易弥散[16]。本文
对比了35和40这2种循环数的扩增效果,如上述
图3与图4所示,2次对比结果总体上看都表明采
用40个循环时,扩增条带拖尾较明显。特别是从图
4看出对2份不同材料,采用35个循环所得到的扩
增条带远比采用40个循环所得到的清晰。因此最
终认为采用35个扩增循环数是最佳的。
Taq酶对ISSR-PCR反应的影响:PCR扩增效果
与Taq酶的种类有关。本研究使用相同材料、引物和
退火温度,对比了TaqDNA聚合酶和TaqPlusDNA
聚合酶的扩增效果,用量都是1U。结果表明,总体
上TaqPlusDNA聚合酶的扩增效果优于TaqDNA
聚合酶的(图6)。同时考虑到前者的扩增错配率远
较后者的低,所以决定在ISSR-PCR的反应体系里使
用TaqPlusDNA聚合酶。至于酶的浓度,根据已有
经验和预试验结果,认为在20μL体系中使用1U的
量是稳妥可行的,因此不再另行优化。
图6 TaqDNA聚合酶与TaqPlusDNA聚合酶在ISSR-PCR中的扩增效果对比
Fig.6 EffectsofdifferentTaqDNApolymerasesonISSR-PCRreaction
注:ISSR引物为UBC834,退火温度为56℃。A.TaqDNA聚合酶的扩增结果,B.TaqPlusDNA聚合酶的扩增结果
Note:ISSRprimer:UBC834andannealingtemperature:56℃.A.TaqDNApolymerase;B.TaqplusDNApolymerase
271
第1期 卢玉飞等:中国芒属植物ISSR-PCR扩增反应体系的优化
2.2 最佳ISSR-PCR反应体系的验证
为验证本研究体系的扩增效果,选择了编号为
“UBC823”的引物,将此体系应用于扩增本研究的
全部84份供试材料,结果表明扩增条带清晰且稳定
(图7),证实了本研究体系对中国芒属植物的适
用性。
图7 应用优化后的ISSR-PCR反应体系和引物UBC823对全部84份材料的扩增效果图
Fig.7 PCRamplificationproductsofal84accessionswithUBC823ISSRprimerusing
optimizedISSR-PCRamplificationreactionsystem
3 讨论
ISSR-PCR的扩增效果受到多种因素的影响。
本研究在已有经验和预试验结果的基础上,进一步
对每个主要组分的浓度设置3个最有可能是最优的
水平来进行比较,基本上每个试验都将可同时反映
多个因素及其不同水平的处理组合高度整合到一
起,综合考察这些因素及其不同水平的扩增结果,并
重视引入随机挑选的不同材料和引物来对比。与通
常进行ISSR-PCR体系优化时所采用的正交设计方
案一样[16,18],都是进行多因素多水平筛选;不同之
处在于本研究将多个处理组合高度整合到一个试验
中,并特别注重同时在不同供试材料和引物中进行
效果对比,多次求证最优参数。
4 结论
本研究对 Mg2+、dNTP、引物、DNA模板的浓
度以及循环数这5个ISSR-PCR反应中的主要影响
因素进行了优化,建立了适用于中国芒属植物的最
佳ISSR-PCR反应体系。该体系为20μL,含 Mg2+
2.5mmol·L-1、dNTP0.25mmol·L-1、引物0.5
μmol·L-1、DNA2μL、1UTaqPlusDNA聚合酶
和1×PCRbuffer。该体系的建立无疑将为后续的
相关研究提供技术参考。
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(责任编辑 刘云霞)
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