全 文 ：第 16 卷 第 1 期
Vol. 16 No . 1
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2008 年 1 月
Jan. 2008
苜蓿假盘菌 ISSR反应体系优化及指纹图谱构建
袁庆华, 张君艳
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100094)
摘要: 以北京苜蓿假盘菌( Pseudop ez iz a medicaginis ( L ib. ) Sacc. )菌株为试材, 用 ISSR23引物[序列为( AC) 8T ]
研究 PCR反应体系的主要成分及退火温度对假盘菌 ISSR 扩增的影响, 以期为苜蓿假盘菌的深入研究奠定基础。
结果表明: P rimer、Mg 2+ 、T aq酶和 dNTP 浓度对扩增均有影响, 以 Pr imer 影响最为明显; 优化的反应体系为: 20
L反应体系中含 0. 1 ng 模板 DNA, 2. 0 mmo l/ L MgCl2、0. 5 mol/ L P rimer、1U T aq DNA 聚合酶、0. 2 mmol/ L
dNTP , 2 L 10 PCR Buffer和 2. 5% 去离子甲酰胺; 在此基础上,建立 6 个不同地理来源苜蓿假盘菌菌株的指纹
图谱并分析其亲缘关系;对 44 条 ISSR引物进行筛选, 22 条可产生清晰稳定的多态性条带, 其中 16 条可将 6 个供
试菌株完全分开,建立了苜蓿假盘菌指纹图谱; 经聚类分析, 在 0. 55 遗传相似水平下, 6 个供试菌株分为两个遗传
谱系,菌株的遗传谱系与其地理来源之间不表现相关性。
关键词: 苜蓿假盘菌; ISSR ; 指纹图谱; 亲缘关系
中图分类号: S812; Q943 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2008) 01001706
Optimization of ISSR Reaction System and Construction of Fingerprinting
of Pseudop eziza medicaginis ( Lib. ) Sacc.
YUAN Qinghua, ZHA NG Junyan
( Inst itute of An imal S cien ce, CAAS, Beijin g 100094, China)
Abstract: T he ef fects of PCR react ion components and annealing temper ature on ISSR ( intersimple se
quence repeat ) amplificat ion o f P seudop ez i z a medicagini s ( L ib. ) Sacc. cv . Beijing w er e studied using
primer ISSR23 ( sequence: ( AC) 8T ) . The results show that all o f components, i. e. concentrations of
primer, M g2+ , Taq DNA po lymerases, and dNT P, affected the amplificat ion results, but the ef fect of
primer concentration w as dist inct . The opt imal concentrat ion of ISSRPCR react ion system w as 0. 1 ng
template DNA, 2. 0 mmol/ L M gCl2 , 0. 5 mo l/ L primer, 1U T aq DNA po lymerase, 0. 2 mmo l/ L dN TP,
2 L 10 PCR buffer, and 2. 5% deionized formamide per 20 L react ion volume. The ISSR fingerpr int ing
pro files of 6 P. med icagini s str ains w ith differ ent g eographical originals w ere established w ith 22 primers
screened out fr om 44 ISSR primers. The isolated P . medicagini s st rains w ere clustered into 2 genet ic line
ages at 0. 55 genet ic similarity and the genet ic lineages of 6 st rains show ed no obvious relat ion w ith their
geogr aphical o rig inals.
Key words: P seud op ez i z a medicagini s ( L ib. ) Sacc. ; ISSR; Fingerpr int ing ; Relat ionship
简单序列重复区间( Inter Simple Sequence Re
peat , ISSR) 标记[ 1] 又叫随机扩增微卫星多态性
( Randomly A mplif ied M icrosatellite Polymor
phism, RAMP)标记, 是一种新的分子标记方法, 其
原理是利用真核生物基因组中广泛存在的 SSR 序
列设计出能与 SSR序列结合的引物, 对两个相距较
近、方向相反的 SSR序列间的 DNA 区段进行扩增,
扩增的指纹图可以同时提供基因组内多个位点的序
列信息。它结合了 RA PD标记简单、快速和RFLP、
SSR标记可靠的优点,近年来得到了广泛应用[ 2]。
收稿日期: 20070607; 修回日期: 20071029
基金项目: 国家自然科学基金( 30471230)资助;国家科技支撑项目( 2006BAD16B041)资助
作者简介: 袁庆华( 1959) ,女,天津人,研究员,研究方向为牧草种质资源及草地保护, Email: yuan qin ghua@ hotm ail . com
草 地 学 报 第 16卷
利用 ISSR等分子标记技术开展植物病原真菌的鉴
定与遗传相关性研究是抗病性研究的基础工作。目
前在植物病原真菌如高卢蜜环菌( A rmil laria gal
l i ca Marx . & Rom. ) [ 3]、以棉花和茄子为寄主的大
丽轮枝菌( Ver ti ci l lium dahl iae Kleb. ) [ 4, 5] 等中已
有这方面的报道,而有关苜蓿假盘菌的研究尚未开
展。苜 蓿 假 盘 菌 ( P seudop ez iz a medicaginis
( L ib. ) Sacc. )属于子囊菌亚门假盘菌属, 异名: 三
叶草假盘菌( P . t ri f ol ii f . sp. medicag inissat ivae
Schmied. ) , 是一种寄生性较强的病原菌。本实验
通过分析不同因素对 ISSRPCR 反应的影响, 旨在
建立适合于苜蓿假盘菌的最佳 ISSR 反应体系, 并
在此基础上构建 6个地区苜蓿假盘菌的指纹图谱并
分析它们之间的遗传相关性,为今后苜蓿假盘菌的
深入研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
从北京、甘肃等 6 个苜蓿褐斑病高发地区的主
栽苜蓿品种上采集褐斑病标本, 分离纯化后得到苜
蓿假盘菌菌株,其菌落特征等见表 1。
表 1 苜蓿假盘菌菌株及其来源
T able 1 Str ain and source of P. med icaginis used in the study
菌株编号
St rain code
菌落特征
C haracters of colony ( later phase)
寄主(种)
H os ts ( s pecies)
来源
S ou rce
P. m c1
生长后期菌落正面呈深褐色至黑色,黑色居少数,背面深褐色,菌落呈土丘状,形
状不规则,分布较密
Puce to black upp er s ide, pu ce back sid e, anomalist ic hillockshap w ith den se dis
t ribut ion
保定苜蓿
( M. sa ti v a L. cv.
Baoding)
北京
Bei jing
P. m c2
生长后期菌落直径最大,正面呈浅褐色,背面浅黄色,呈不规则球形,分布最疏
H ighes t colony diameter, b eige upp er side, buf f back side, anomal ist ic ballshap
w ith spar se dist ribu tion
甘农 3号紫花苜蓿
( M. sa ti v a L. cv.
Gannong No. 3)
甘肃兰州
L anzhou, Gansu
P. m c3
生长后期菌落正面黑色或炭黑色, 背面深褐色,平均直径 1. 50 mm,高为直径的
1/ 2,分布密集
Black or charcoal black u pper side, puce back s ide, 1. 5 mm average diameter,
thick as 1/ 2 diameter, with dense dist rib ut ion
新疆大叶
( M. sa ti v a L. cv.
Xinjiang Daye)
新疆乌鲁木齐
Urumchi, Xinjiang
P. m c4
生长后期菌落直径较大,正面呈黑色,背面浅黑色,呈规则球形,分布较疏
Large diam eter, b lack upper side, li ght black back side, ballsh ap w ith spars e
dist ribut ion
新疆苜蓿
( M. sa ti v a L. cv.
Xin jiang)
新疆阿克苏
Akesu, Xinjiang
P. m c5
生长后期菌落直径较小,正面呈碳黑色,背面浅黑色,呈规则球形,分布较密
Small diameter, charcoal black u pper s ide, ligh t b lack back s ide, ballshap w ith
den se dist ribu tion
山西苜蓿
( M. sa ti v a L. cv.
S hanx i)
山西沁源
Qinyuan, Shanxi
P. m c6
生长后期菌落正面多呈黑色,背面深褐色至黑色,平均直径为 1. 78 mm, 高为直
径的 1/ 2,分布较疏
Black upper side, puce to black back side, 1. 78 mm average diameter, thick as 1/
2 diameter, w ith spar se dist ribut ion
杂花苜蓿
( M. varia Martyn)
内蒙赤峰
C hifeng, In ner
Mongolia
1. 2 苜蓿假盘菌基因组 DNA的提取
基因组 DNA 提取采用朱衡[ 6] 氯化苄法, 但略
有改动,用氯仿/异戊醇( 24 1)抽提 DNA 时采用 2
次抽提法。最后使用紫外分光光度法和 0. 8%琼脂
糖电泳法检测 DNA 的质量和纯度。
1. 3 PCR扩增条件
ISSRPCR反应初始体系参考 Gao 等[ 6] 进行,
总体积为 20L, 优化后的成分及浓度如下: 10 mM
TrisHCl ( pH8. 3) , 50 mM KCl, 2. 0 mM M gCl2 ,
0. 1ng 基因组 DNA, 0. 5 mM 引物 (上海生工/
Sangong ,中国) , 1U Taq DNA 聚合酶 ( 宝生物/
TaKaRa,日本) , 0. 2 mM dNT P, 2. 5%去离子甲酰
胺。ISSRPCR程序为: 94 预变性 4 min; 94 变
性 30 s, 57 ~ 60 (依引物而定)退火 45 s,每循环
降低 1 , 72 延伸 2 m in, 10 个循环; 94 变性
30 s, 47 ~ 50 (依引物而定)退火 45 s, 72 延伸
2 min, 33 个循环; 72 延伸 5 min; 25 保存备用。
PCR反应在 PTC100T M ( MJ 公司)基因扩增仪上
进行。扩增产物在 1. 5%琼脂糖凝胶上电泳 1. 5 h
(电泳缓冲液为 0. 5 T BE,电压 3V/ cm) , 结束后在
EB溶液中染色( 0. 5 g/ mL) ,最后在紫外透射仪下
观察照相。
1. 4 ISSRPCR反应体系和退火温度的优化设计
PCR 反应的优化包括体系内各成分含量和退
18
第 1期 袁庆华等:苜蓿假盘菌 ISSR 反应体系优化及指纹图谱构建
火温度的优化。反应体系优化时使用的模板 DNA
为北京菌株, 引物为 ISSR23(序列见表 2)。模板
DNA、Taq DNA聚合酶、引物、dNT P和 Mg2+ 等各因
素的用量梯度设置如下(反应体系总体积为 20 L) :
模板 DNA 的浓度梯度设定为 0. 025、0. 05、
0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、3. 2 ng 共 8 个, 1. 5 mM
MgCl2 , 0. 4 M 引物, 1 U T aq DNA 聚合酶, 0. 2
mM dNTP; T aq DNA 聚合酶的浓度梯度设定为
0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、1. 5 U 共 5个, 0. 1 ng 基因组
DNA, 1. 5 mM M gCl2 , 0. 4 M 引物, 0. 2 mM
dNT P;引物的浓度梯度设定为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 7、
0. 9 M 共 5 个, 0. 1 ng 基因组 DNA , 1. 5 mM
MgCl2 , 1 U T aq DNA 聚合酶, 0. 2 mM dNT P;
dNT P 的浓度梯度设为 0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、0. 3
mM 共 5个, 0. 1 ng 基因组 DNA, 1. 5 mM M gCl2 ,
1 U T aq DNA 聚合酶, 0. 5 M 引物; M g2+ 浓度梯
度设为 1. 5、2. 0、2. 5、3. 0 mM 共 4个, 0. 1 ng 基因
组 DNA, 1 U T aq DNA 聚合酶, 0. 5 M 引物; 0. 2
mM dN TP; 退火温度首先在利用公式 Tm= 4( G+
C) + 2( A+ T )计算所得的 T m 值下进行扩增, 根据
扩增结果在 T m 4 的范围内变动以确定各引物
的最佳退火温度,反应体系为 1. 3所述。
1. 5 数据统计与分析
ISSR为显性标记, 按照迁移率相同的带在每个
菌株中的有无记为 1或 0。菌株间的相似系数采用
Dice系数计算: S ij = 2N ij / ( N i+ N j ) , 式中 N i 代表
菌株 i 的条带数目, N j 代表菌株 j 的条带数目, N ij
为菌株 i、j 共有带数目。采用U PGMA法进行聚类
分析。上述计算均采用软件 NYST S 2. 0[ 7]。
2 结果与分析
2. 1 ISSR反应体系的优化
2. 1. 1 模板 DNA 和 Taq DNA 聚合酶浓度对 IS
SR扩增的影响 模板 DNA和 Taq DNA 聚合酶
不同浓度的扩增结果如图 1所示。从图 1(右边)可
看出,当 DNA 用量在 0. 025 ng 至 0. 4 ng 时,扩增
条带较多,但 0. 025 ng 和 0. 4 ng 时较为模糊, 0. 05
ng、0. 1 ng 和 0. 2 ng 均能产生清晰的带型;而在0. 8
ng 或 0. 8 ng 以上条带明显减少。由于模板 DNA
浓度越小, T aq DNA 聚合酶抑制因子的含量越少,
对 T aq DNA聚合酶活性的影响也越小, 因此,本试
验 DNA 模板的用量为 0. 1 ng 较合适。从图 1(左
边)可看出, Taq DNA 聚合酶用量为 0. 5和 1. 5 U
时几乎没有扩增, 0. 75和 1. 25 U 时产物较少, 扩增
效果较差, 而 1. 0 U 时条带丰富且清晰整齐。因
此, Taq DNA 聚合酶最佳用量为 1. 0 U。
图 1 Taq DNA聚合酶浓度 (泳道 15)和 DNA模板浓度(泳道 613)对 ISSRPCR的影响
Fig . 1 Effect o f contractions o f Taq DNA polymerase ( lane 15) and DNA template ( lane 613) on ISSRPCR
注: 15泳道的 Taq DNA 聚合酶用量(单位U )依次为 0. 5、0. 75、1. 0、1. 25、1. 5; 613泳道的DNA 模板浓度(单位 ng/ 20L)依次为 0. 025、
0. 05、0. 1、0. 2、0. 4、0. 8、1. 6、3. 2; M 为 DNA 分子量标准,从上到下依次为 2000、1500, 1000、700、400、200 bp
Note: Lane 15 r epresen ts T aq DNA polym erase concent rat ion at 0. 5, 0. 75, 1. 0, 1. 25, and 1. 5U , respect ively; lane 613 represents
DNA template concent rat ion at 0. 025, 0. 05, 0. 1, 0. 2, 0. 4, 0. 8, 1. 6, and 3. 2 ng/ 20L , respectively; M represents marker w ith DNA m o
l ecular standard ( f rom top to b ot tom) of 2000, 1500, 1000, 700, 400, and 200 bp
2. 1. 2 Mg2+ 、dNT P 和引物浓度对 ISSR扩增的影
响 Mg2 + 、dN TP 和引物不同浓度的扩增结果如图
2所示。从图 2(左边)可看出, M g2+ 在设定的范围
内均能扩增出条带, 说明该反应体系对 MgCl2 的敏
感性较低。当 Mg2+ 浓度为 3. 0 mM 时, 扩增强度
减弱。从图 2(中间)可看出,当 dNT P 浓度小于 0. 2
mM 时,扩增产物清晰、带浓, 但出现严重的条带缺
失现象,而为 0. 3 mM 时, 扩增条带减少, 并出现弥
散背景增强的趋势。从图 2(右边)可看出, 当引物
浓度为 0. 1和 0. 9 M 时扩增条带较少; 0. 3 和 0. 7
19
草 地 学 报 第 16卷
M 时扩增条带虽多但不清晰; 0. 5 M 时扩增条带
多,分布均匀, 易于辨识。综合考虑, M g2+ 、dNT P
和引物最佳浓度分别为 2. 0、0. 2和 0. 5 M。
图 2 Mg2+ (泳道 14)、dNTP(泳道 59)和引物浓度(泳道 1014)对 ISSRPCR 的影响
Fig. 2 Effects of different concentr ations of Mg 2+ ( lane 14) , dNTP ( lane 59) , and primer ( lane 1014) on ISSRPCR
注: 1~ 4泳道的 Mg2+ 浓度(单位 mM)依次为 1. 5、2. 0、2. 5、3. 0; 5~ 9泳道的 dNT P浓度 (单位 mM )依次为 0. 1、0. 15、0. 2、0. 25、0. 3; 10
~ 14泳道的引物浓度(单位M)依次为 0. 1、0. 3、0. 5、0. 7、0. 9; M 为 DNA 分子量标准,从上到下依次为 2000、1500、1000、700、400、200 bp
Note: Lane 14 rep resents M g2+ concent rat ion at 1. 5, 2. 0, 2. 5, and 3. 0mM, respect ively; lane 59 represen ts dNT P concent ration at 0.
1, 0. 15, 0. 2, 0. 25, and 0. 3 mM, respect ively; lane 1014 rep resents primer concent rat ion at 0. 1, 0. 3 , 0. 5, 0. 7, and 0. 9M, r espect ively;
M represen ts mark er wi th DNA m olecu lar standard ( f rom top to b ot tom) of 2000, 1500, 1000, 700, 400, and 200 bp
2. 2 退火温度对 ISSR扩增的影响
退火温度是决定 PCR反应特异性和重复性的
关键因素之一,本实验对 44个 ISSR引物在不同退
火温度进行扩增, 结果发现 22个能产生条带清晰且
多态性丰富的图谱(表 2)。
表 2 22 条 ISSR 多态性引物
Table 2 Tw entytw o polymorphic pr imers of ISSR
编号
Code
序列
Sequ ence
退火温度( )
T m ( )
带数目
Number of ban ds
多态性带数目
Number of polymorphic bands
ISSR1 ( AC) 8AG 48 22 21
ISSR2 ( AC) 8 TG 48 27 23
ISSR23 ( AC) 8 T 48 37 31
ISSR5 ( GAA) 6 48 17 10
ISSR9 ( AG) 8AA 48 16 12
ISSR10 ( AG) 8T A 48 33 21
ISSR24 ( AG) 8YT 48 34 23
ISSR29 ( AG) 8T 48 33 20
ISSR30 ( GA) 8T 48 32 25
ISSR31 ( GA) 8A 48 10 8
ISSR33 ( CA) 8A 48 38 34
ISSR18 ( AG) 8GG 50 36 30
ISSR25 ( CA) 8RG 50 38 28
ISSR35 ( AC) 8C 50 24 22
ISSR44 DBD( AC) 7 50 14 11
ISSR6 ( AC) 8 TC 50 32 25
ISSR7 ( AC) 8CA 50 23 17
ISSR17 ( AG) 8GC 50 39 34
ISSR4 ( CT C) 6 49 8 4
ISSR8 ( AG) 8AC 49 16 5
ISSR3 ( AT G) 6 47 16 9
ISSR27 VDV( C T) 7 47 37 33
注: R= ( A, G) ;Y= ( C, T ) ; B= ( C, G, T) ; D= ( A , G, T) ; V= ( A , C , G)
Note: R= ( A, G) ; Y= ( C, T) ; B= ( C, G, T) ; D= ( A , G, T ) ; V= ( A , C , G)
20
第 1期 袁庆华等:苜蓿假盘菌 ISSR 反应体系优化及指纹图谱构建
2. 3 苜蓿假盘菌 ISSR指纹图谱的构建
使用已建立的 ISSR反应体系和 22条 ISSR 引
物对 6个苜蓿假盘菌菌株的 DNA 进行分析(图 3) ,
结果所有菌株都具有不同的指纹图谱, 其中 16个引
物可将 6个菌株完全区分开,利用它们可以方便地
鉴定所有的菌株。22条 ISSR引物在 6个苜蓿假盘
菌菌株中共产生 582 条 DNA 带,其中 443条为多
态性带,占 76. 12% ;平均每引物条带数和多态性条
带数分别为 26和 20。
图 3 引物 ISSR6(左)、ISSR7(中)和 ISSR17(右)对 6 个菌株 ISSR指纹图谱
Fig. 3 ISSR fingerprinting of 6 P. medicag inis str ains w it h pr imers ISSR6 ( left) , 7 ( middle) , and17 ( right)
注: 16、712、1318依次为北京、甘肃、北疆、南疆、山西和内蒙菌株
Note: Lan e 16 represents the st rain s f rom Beijing, Gan su, Beijian g, Nan jiang, Shanxi, and Neimeng, respect ively; s am e as lane 712 and
lan e 1318
2. 4 6个苜蓿假盘菌菌株间的 ISSR聚类分析
聚类分析的结果(图 4)将 6个不同地理来源的
菌株分为 2个遗传谱系:谱系 包括采自北京( c1)
的 1个菌株,谱系 包括采自甘肃( c2)、山西( c5)、
北疆( c3)、南疆( c4)和内蒙( c6)的 5个菌株。谱系
又可进一步分为 2 个亚系, 第一亚系包括采自甘
肃和山西的 2个菌株,另一亚系包括采自北疆、南疆
和内蒙的菌株。这与表 1中各菌株菌落特征间的相
似性非常接近。聚类分析与相似系数值的大小显
示:山西与甘肃比山西与北京更为相似,而南疆与内
蒙比南疆与北疆更为接近, 表明菌株间的亲缘关系
与地理来源之间没有相关性。
图 4 6 个菌株基于 Nei s遗传距离的聚类树状图
Fig . 4 Dendrog ram of U PGM A cluster analysis based on
Nei s genetic dist ances among 6 P. medicag inis str ains
注: c1c6分别代表:北京、甘肃、北疆、南疆、山西和内蒙菌株
c1c6 represents the st rain f rom Beijing, Gansu, Beijiang, Nan
jiang, Shanxi, and Neimeng, respect ively
3 讨 论
对 ISSRPCR 扩增体系优化的过程发现,
M g2+ 、dNT P、T aq DNA聚合酶、引物、DNA浓度等
对扩增结果都有影响。其中尤以引物浓度的影响最
大。乔玉山等[ 8] 用 ISSR研究李种质资源, Cekic C
等[ 9 ]用 ISSR研究四季花遗传关系,刘威生等[ 10] 利
用 ISSR标记技术构建杏指纹图谱的研究均表明,
引物浓度不同扩增片段的大小就会有很大差异, 引
物浓度越高扩增片段越小, 弥散增多,普遍认为是由
于当引物浓度较高时, 引物与模板 DNA 的结合位
点增多而导致片段变短。本研究也得到相同的结
论。同样,退火温度也是影响扩增的重要因素, 不同
引物之间退火温度存在很大差异, 退火温度过高或
者过低均会导致扩增结果出现背景弥散或者条带缺
失的现象,这和 Huang J C[ 11] 研究结果一致。
利用 ISSR 技术构建苜蓿假盘菌分子指纹图
谱,并分析其亲缘关系的研究目前未见报道,但 IS
SR标记在棉花黄萎病[ 7] 、茄子黄萎病[ 8]指纹图谱的
研究表明不同菌株间亲缘关系的远近均与其地理来
源没有相关性。此外, 林华峰等[ 1 2]利用 RAPD技术
对白僵菌不同菌株扩增图谱与地理来源的分析也表
明菌株多态性与采集地之间不存在相关性。但是,
杨水英等[ 13]利用 repPCR对重庆稻瘟病菌不同菌
株间指纹图谱的研究表明菌株的遗传谱系与其采集
地点间有明显的相关性。本研究认为利用 ISSR对
苜蓿假盘菌的指纹分析与地理来源之间也同样未表
21
草 地 学 报 第 16卷
现出相关性。这可能与所研究的菌株及标记技术本
身的差异有关。
4 结 论
4. 1 确定苜蓿假盘菌 ISSRPCR反应体系
优化的反应体系为: 20 L 体系中含 0. 1 ng 模
板 DNA, 2. 0 mmo l/ L M gCl2、0. 5 mo l/ L Primer、
1U Taq DNA 聚合酶、0. 2 mmol/ L dNTP, 2 L 10
PCR Buffer ( 100 mmo l/ L Tr isHCl ( pH8. 3) ,
500 mmol/ L KCl)和 2. 5%去离子甲酰胺。
4. 2 建立 6个假盘菌菌株指纹图谱并确定其亲缘
关系
利用 ISSR 分子标记技术, 从 44条 ISSR 引物
中筛选出 22条能够产生清晰稳定的扩增条带,其中
16条能够完全把 6个不同地理来源的假盘菌菌株
区分开,建立了苜蓿假盘菌的指纹图谱,以后可利用
ISSR标记对该 6个菌株进行快速鉴定。同时,聚类
分析结果表明, 在 0. 55的遗传相似水平下, 可将 6
个菌株分为两个谱系, 且菌株的遗传谱系与其地理
来源之间不表现相关性。
参考文献
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(责任编辑 梁艳萍)
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