全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 04-0289-05
多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生
张振霞1, 2 ,储成才3,席嘉宾1,陈　平4
( 1.中山大学生命科学院 ,广州 510275; 2.韩山师范学院生物系, 广东潮州 521041;
3. 中国科学院遗传与发育生物学研究所, 北京 100101; 4.仲恺农业技术学院农学院草学专业,广州 510225)
摘要: 研究并建立了多年生黑麦草胚性愈伤组织诱导及其再生体系。结果表明: 不同品种的愈伤组织诱导率不同, 最适培
养基是 M S,愈伤组织诱导的最适 2, 4-D 浓度是 5 mg / L ; 继代培养时间对愈伤组织的分化率有很大影响; 植物凝胶与国产
琼脂相比固化效果更好; 筛选剂 G418对抗性愈伤的浓度在 50 m g/ L 和 75 mg / L 时的筛选效果分别达 10. 31%和 6. 5%。
关键词: 生物技术;多年生黑麦草; 组织培养;愈伤诱导 ;植株再生
中图分类号: Q943. 1　　　文献标识码: A
Embryogenic Callus Production and Plant Regeneration of
Lolium Perenne Seed Explants for Genetic Manipulation
ZHANG Zhen-x ia
1
, CHU Cheng-cai
2
, XI Jia-bin
1
, Chen Ping
3
( 1. Schoo l o f L ife Science , Sun Yat -sen Univer sity , Guang zhou, Guangdong Prov ince 510275, China;
2. Depart ment of Biolo gy , HanShan No rmal Colleg e, Chao zhou, Guangdong Prov ince, 521041, China;
3. Institute o f Genetics and Developmental Biolog y, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China;
4. Depart ment of Agronomy, Zhongka i Agrot echnical Colleg e, Guang zhou, Guangdong Province, 510225, China )
Abstract: T he study is focused on the init iat ion and regenerat ion o f L olium per enne embroygenic callus. T he
results show that M S medium is the cho ice basic medium fo r init iat ion and subculture o f the callus amongst all
the media tested. 5 mg/ L 2, 4-D is the preferable concentrat ion for plants hormone in induct ion culture and
subculture of the callus. Phytag el is a bet ter co agulant than the home-made agar . 50～75 mg/ L select iv e scope
of screening agent G418 is feasible.
Key words : Bio technolog y; L olium p erenne L ; T issue cul ture; Callus induct ion; P lant r eg eneration
　　多年生黑麦草( L ol ium perenne L. ) (下称黑麦草)
是重要的禾本科牧草和草坪草, 广泛分布于温带地
区[ 1] ,具有建植速度快、分蘖能力强等特性。
目前, 利用基因工程培育和改良植物品种是一种
便捷和实用的途径。成功的植物基因转化首先依赖于
良好的植物受体系统。这种用于转基因的植物受体系
统必须具有高频、稳定的再生能力,对转化筛选剂有良
好的敏感性。植物组织培养和再生体系的建立和完善
是遗传转化的基础和前提。然而由于禾本科植物的自
身特点,许多牧草和草坪草的组织培养和再生体系不
完善, 使得禾本科草的转基因操作和应用研究较为困
难。鉴于此,本文对多年生黑麦草进行了组织培养和植
株再生的研究,为其转基因操作提供良好的基础。
1　材料与方法
1. 1　实验材料
供试黑麦草 ( L olium p erenne L. ) 品种有: 卓越
( Excellence)、APM (草坪型)、春潮( Springw ave)、百
盛( Birch)、凯蒂沙( Kit ty sia, 草坪型) , 其种子均由
Clover 公司提供。
1. 2　培养基
MS、NB和 CC 基本培养基, pH 5. 8;诱导及继代
收稿日期: 2003-10-30;修回日期: 2004-06-22
基金项目:国家转基因植物研究与产业化专项( JY03-A-10-01)资助
作者简介:张振霞( 1975-) ,女,甘肃兰州人,博士后,专业方向为牧草基因工程, Email : zzx8411@ 163. com
第 12 卷　第 4 期
　Vol. 12　　No . 4
草　地　学　报
ACTA AGREST IA SINICA
　2004 年　12月
　Dec. 　2004
培养基: MS、NB 和 CC 基本培养基+ 2, 4-D;分化培养
基: M S、NB 和 CC 基本培养基+ 3 mg / L BAP; 壮苗
培养基: 1/ 2 M S基本培养基。
1. 3　外植体培养
1. 3. 1　将成熟种子用 20% NaOCl浸泡 60 min, 用无
菌水冲洗 3～4 次,接种在诱导培养基上。待长出愈伤
后, 接到继代培养基上培养。每 3～4 w 继代一次。当愈
伤形成大量结构致密、颗粒状、黄白色的胚性愈伤组织
后,可将胚性愈伤组织转至分化培养基。经1～2个月的
培养, 长出1～2 cm 的幼苗,再将其转移到生根培养基。
待长出根后经 2～3 d的温室炼苗后移植到土中。
1. 3. 2　愈伤组织的诱导和继代培养在黑暗中进行, 愈
伤组织的分化和幼苗生根培养的培养条件为 25～
26℃,每日光照 12 h,光强 2000 lux。
1. 3. 3　愈伤组织诱导和分化频率的计算为:
诱导率= 出愈外植体数/接种外植体数×100%
分化率= 出芽愈伤数/接种愈伤数×100%。
2　结果与分析
　　植物的受体再生系统较为广泛, 对于单子叶植物
来说, 愈伤组织再生系统是最为有效实用的转化受体
系统。
2. 1　基本培养基对黑麦草愈伤组织诱导频率的影响
选用 MS、CC和 N B三种培养基比较黑麦草成熟
胚愈伤组织的诱导效果,结果如图 1所示。不同品种在
图 1　培养基对黑麦草品种出愈率的影响
Fig . 1　Effect of differ ent medium s on the rate o f callusing
of different v ar ieties o f L olium p er enne
不同培养基上的愈伤诱导情况各异。春潮在 MS、CC、
NB 三种基本培养基上的愈伤组织诱导频率较高, 其
中以 MS 最高,为 21. 95% ;百盛和卓越在 CC 培养基
上愈伤组织的诱导频率很低,只有 6. 68%和 8. 94% ;
凯蒂沙和 APM 在三种培养基上的愈伤诱导频率比较
接近。与CC、NB 基本培养基相比,五个黑麦草品种的
愈伤诱导效率在 MS基本培养基上最高。
2. 2　2, 4-D浓度对黑麦草愈伤组织诱导频率的影响
本实验设定 2、5、8、10 mg / L 四个不同 2, 4-D 浓
度,在 MS 基本培养基上对黑麦草春潮品种进行愈伤
组织诱导。结果表明,随着 2, 4-D浓度的升高, 愈伤组
织的诱导率也随之提高,在 8 mg / L 时,愈伤诱导率达
到最高(图 2)。
图 2　2, 4-D浓度和不同外植体对黑麦草出愈率的影响
Fig . 2　Effect of differ ent deg rees o f 2, 4-D concentr ation and
different explants on the r ate o f callusing of L olium p er enne
2. 3　外植体来源对黑麦草愈伤组织诱导频率的影响
在黑麦草成熟胚诱导愈伤的过程中, 将的幼苗从
成熟胚上取下,接种到相应的培养基上。经过一段培养
时间,幼苗切口处会长出愈伤, 其出愈率要高于成熟
胚。经过 2～3次继代,形成大量结构致密、颗粒状、黄
白色的胚性愈伤组织(图 2,表 1)。
2. 4　培养基固化剂对黑麦草愈伤组织诱导频率的影响
选用国产普通琼脂和 Sigma 公司的植物凝胶
( phy tag el )作为固化剂进行黑麦草组织培养。结果表
明 phytagel植物凝胶培养基上的愈伤质量和数量均
好于前者。不同种类和不同质量的培养基固化剂对植
物材料的组织培养和再生过程均有一定影响(表 1)。
2. 5　培养基对黑麦草品种愈伤组织分化频率的影响
比较 MS、CC、NB三种基本培养基对不同黑麦草
愈伤组织分化频率的影响, 发现不同基本培养基对黑
麦草愈伤组织诱导的效率不同,对愈伤分化和再生的
影响也不相同(见表 2)。
290 草　地　学　报 第 12卷
表 1　琼脂对黑麦草愈伤组织诱导频率的影响
T able 1　Effect of differ ent agar s on the callus formation frequency o f L olium perenne
培养基
Medium
琼脂
Agar
愈伤来源 Cause of callu s
成熟胚 Mature embryo 苗 Seedl ing
接种数
No. of
cu lt lvated mature embr yo
出愈数
No. of
formed cal lus
出愈率( % )
Rate of cal lus
format ion( % )
接种数
No. of
cul t ivated s eedling
出愈数
No. of
formed callus
出愈率( % )
Rate of cal lus
format ion ( % )
MS Phytagel 120 12. 99 10. 83±0. 54 120 18. 46 15. 38±1. 07
琼脂 Agar 120 9. 01 7. 51±0. 83 120 10. 12 8. 46±0. 96
CC Phytagel 120 12. 00 10. 00±0. 69 120 10. 99 9. 16±0. 66
琼脂 Agar 120 7. 48 6. 23±0. 45 120 9. 00 7. 50±0. 71
NB Phytagel 120 6. 10 5. 08±0. 50 120 9. 96 8. 33±0. 73
琼脂 Agar 120 3. 03 2. 53±0. 97 120 6. 67 5. 55±0. 48
　　注:以上实验均设三个重复值
Note: Th e experiment is performed w ith 3 replicated values
表 2　培养基对黑麦草品种愈伤组织分化频率的影响
Talbe 2　Effect of differ ent medium s on the callus
differentiat ion fr equency of L olium p er enne
品种
Variet ies
培养基
Medium
愈伤数
No. of
callu s
分化数
No. of callus
dif feren tiated
分化率( % )
Rate of
dif f erent iat ion( % )
春潮 MS 43 11 25. 58±0. 81
Springw ave CC 17 3 17. 64±0. 47
NB 21 3 14. 28±1. 58
百盛 MS 36 6 16. 67±1. 34
Birch NB 13 3 20. 33±0. 44
卓越
Excel len ce
MS 16 3 18. 75±0. 76
凯蒂沙 MS 15 5 33. 33±1. 81
Kit tysia C C 20 6 30. 00±1. 25
草坪型
APM
MS 36 14 38. 89±3. 47
　　注:以上实验均设三个重复值
Note: Th e experiment is performed w ith 3 replicated values
2. 6　继代培养时间对愈伤组织分化能力的影响
比较黑麦草愈伤组织在 MS 和 CC 培养基上不同
继代培养时间的分化能力。结果表明(图3) :随着继代
培养时间的延长,在 MS 和 CC 继代培养基上黑麦草
愈伤组织的分化能力都有不同程度的下降。成熟胚愈
伤组织在 MS 培养基上继代培养 80d时的再生率最
高,达 30. 5% , CC培养基上继代培养 80d时的再生率
也为最高, 有 21%; 总体来说 MS 培养基对愈伤组织
的继代效果要好于 CC 培养基的。
2. 7　黑麦草愈伤组织筛选剂浓度的选择
　　选用新霉素磷酸转移酶基因( NPTII 基因, 具有
Kan 和 G418 的抗性)作为黑麦草愈伤转化体的抗生
素选择标记基因,将春潮和 APM 两个品种, 分别在
MS、CC 两种基本培养基上, 设置 G418 浓度梯度, 就
NPT II 基因测定了黑麦草对 G418 筛选剂的敏感性,
结果如图 4、表 3所示。其中图 4显示了 MS(左图)和
CC(右图)基本培养基上不同浓度的 G418在 40 d 后
对多年生黑麦草春潮和 APM 品种的影响。在 MS 培
养基上, 50 mg/ L G418对春潮愈伤的抑制效果明显,
而 APM 对 125 mg/ L 的 G418才有明显的敏感性; CC
基本培养基上,低浓度的G418对春潮和 APM 愈伤的
抑制作用很不明显, 125 mg/ L 时才有了抑制作用。不
同筛选时间对筛选效果也有影响, 20 d时间的筛选效
果较低, 40 d和 60 d的筛选效果较接近。
图 3　不同时期愈伤组织分化能力的比较
F ig . 3　Comparison of L olium per enne callus
differ ent iation With different cult ur ing day s
3　讨　论
影响植物愈伤组织诱导和再生的因素很多。植物
材料的基因型及其内源激素含量是最根本的因素, 其
它外部因素都是通过对内因的调整而起作用的。
3. 1　受体材料和外植体来源对黑麦草愈伤组织再生
的影响
植物细胞的全能性理论早在 20世纪 50年代就已
确立。但在实践中,细胞全能性的表达在各种植物之间
甚至不同属种之间都有很大差别,植物的再生性由它
291第 4期 张振霞等:多年生黑麦草种子愈伤组织诱导和植株再生
们的基因型决定[ 2, 3]。在同样的培养条件下,不同黑麦
草品种在愈伤组织诱导和芽苗形成方面差异十分显
著,不同组织或器官来源的外植体再生能力也有很大
差别, 可能是因为它们对激素等外源信号的感应程度
不同。
外植体的选择是建立愈伤组织再生体系的第一
步。禾本科植物材料的幼穗、幼胚、成熟胚、叶片盾片和
幼苗 [ 4～9]都可作为外植体诱导出良好的胚性愈伤组
织。Bai等人[ 5]认为成熟胚是较好的外植体,操作简单,
易于获取,不受季节、植株发育时期等因素限制。
图 4　筛选剂浓度在MS(左)、CC(右)培养基上对黑麦草愈伤组织的影响
F ig . 4　Effect o f different degr ees of MS ( lef t) and CC( r ig ht) concentr ation on callus of L olium per enne
表 3　不同筛选浓度对多年生黑麦草愈伤组织的抑制作用
Table 3　Inhibit ing effect o f different degr ees of medium concent ration on callus of L olium p er enne
品种
Variet ies
筛选天数
Days of
sereening
G418 ( mg/ L)
25 50 75 125 25 50 75 125
M S培养基 MS medium CC培养基 CC m edium
春潮 20 75. 61 30. 12 18. 22 10. 45 88. 14 51. 26 40. 55 14. 58
Springw ave 40 36. 38 10. 31 6. 50 2. 12 81. 25 47. 74 31. 45 10. 56
60 29. 10 8. 89 5. 31 0. 56 71. 01 42. 13 29. 11 5. 35
20 89. 22 70. 44 41. 23 14. 01 90. 45 56. 14 47. 01 34. 41
草坪型 40 76. 81 50. 10 39. 22 8. 11 87. 51 42. 23 38. 44 29. 10
APM 60 71. 21 42. 22 33. 14 7. 48 79. 11 40. 24 34. 17 26. 36
　　注:以上数值为愈伤组织相对增重量( % )
Note: Values l isted above convey the relat ive augm ented w eight of calli ( % )
3. 2　培养基对黑麦草出愈的影响
转化受体的培养基成分也是影响其生长状况的一
个重要因素。不同培养基有着不同的营养成分、激素、
添加物,对不同植物材料的作用也不完全相同。本实验
结果显示MS 培养基对黑麦草愈伤诱导和分化再生的
促进作用更为明显。William 等人[ 1]、Mcdonnel l 等
人[ 6]、Zhong 等人 [ 10]、佘建明等人 [ 11]、Bai 等人[ 5]采用
改良 MS 培养基,对大麦、多年生黑麦草、早熟禾等材
料进行愈伤诱导和再生,取得了很好的效果。
3. 3　激素对黑麦草愈伤组织诱导的影响
在禾本科植物愈伤组织诱导中, 2, 4-D 通常是起
决定作用的植物生长调节物质 [ 9, 12]。施加外源 2, 4-D
可以促进植物细胞生长素含量提高, 从而诱导胚性细
胞的发生。本文实验结果中显示, 8 mg/ L 的 2, 4-D 浓
度对愈伤组织的诱导率较高。Linacero 等人[ 4]指出, 过
高或过低的 2, 4-D 浓度都不利于胚性愈伤组织的形
成和分化再生。本文采用 5 mg/ L 2, 4-D为黑麦草愈
伤诱导剂的适宜浓度。
3. 4　继代培养时间对黑麦草愈伤组织分化能力的影
响
继代培养时间对愈伤组织的分化能力有极大的影
响。刚诱导的愈伤组织由于刚经历去分化状态, 细胞的
内源激素尚处于调整阶段, 细胞生长还不是很旺盛, 需
继代培养[ 8, 10]。但过长时期的继代培养对愈伤组织的
分化也不利, 分化能力随着继代时间过长而降低[ 13]。
在黑麦草继代过程中, 刚诱导出的愈伤组织松软,粘液
状;继代 2～3个月时愈伤为淡黄色、半透明、较坚硬、
颗粒状,生长分裂旺盛;而继代 6个月以上的愈伤呈白
色、较为松散,生长分裂能力差。因此,本实验选择继代
2～3个月的愈伤组织,可获得较高的分化能力。
3. 5　其他因素对黑麦草愈伤组织诱导和再生的影响
除了以上因素外,培养基的物理因素对器官建成
也有一定影响。不同的固体培养剂对愈伤诱导和分化
的影响不同。实验结果显示了植物凝胶剂( phy tag el )
292 草　地　学　报 第 12卷
对愈伤组织的诱导明显比国产琼脂的要好。van Ark
等人[ 14] 在早熟禾成熟胚愈伤诱导的研究中指出,
Gelr ite 琼脂的愈伤诱导效果是普通琼脂的两倍。
3. 6　黑麦草愈伤组织筛选剂浓度的选择
过高的筛选剂浓度虽然能更有效地得到转化细
胞,但同时也严重影响转化细胞生长和再生能力。筛选
压力过高,会引起非转化细胞的死亡,死细胞的某种物
质扩散到其它细胞中而干扰后者的生长代谢[ 15]。另
外,筛选压力的确定还与受体细胞的生理状态有关, 当
转化后受伤程度比较大或本身生长状态比较弱时, 愈
伤在筛选培养基上很难存活。此时应先作一段时间的
恢复培养后再进行筛选,并逐渐提高选择压。
4　结　论
　　本文研究了多年生黑麦草( L . p erenne)的组织培
养和植株再生,建立了它的胚性愈伤组织诱导和再生
体系, 对多年生黑麦草品种进行了组织诱导和再生体
系的研究。研究结果表明:不同品种的愈伤组织诱导率
不同,其中春潮的愈伤诱导率最好; 与 NB、CC基本培
养基相比, 最适宜的是 MS 培养基, 愈伤诱导最适宜
2, 4-D浓度为 5 mg/ L ; 不同时期的愈伤组织分化率有
差异, 继代 2～3 m 的胚性愈伤组织是较好的转化受
体;植物凝胶( phy tag el)与国产琼脂相比是更好的固
化剂。筛选剂 G418在 50 mg / L 和 75 mg / L 时对多年
生黑麦草愈伤组织的筛选效果分别达 10. 31%和
6. 5%, 筛选时间 40～60 d为宜。
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