全 文 ：第 15 卷
第 6 期

Vol. 15
No. 6
草
地
学
报
ACTA AGRESTIA SINICA



2007 年
11 月

Nov.

2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 06-0588-05
超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响
李荣辉 , 曹社会*
(西北农林科技大学动物科技学院, 陕西 杨凌
712100)
摘要:对多年生黑麦草( L olium p er enne)及红豆草(Onobry chis v iciaef oli )种子超低温保存前后种子发芽率、发芽指
数、电导率、脱氢酶活性、丙二醛含量和可溶性糖含量进行测定分析,探讨超低温保存对种子质量的影响。结果表
明:多年生黑麦草与红豆草种子在自然含水量状态即可直接投入液氮中保存 ,保存时间的长短对种子质量影响不
显著 ;多年生黑麦草种子超低温保存前后差异不显著, 红豆草种子冻后发生了有益的适应性变化;含水量不是影响
超低温保存效果的重要因素,多年生黑麦草和红豆草种子超低温保存最适含水量范围分别为 9. 2% ~ 11. 8% 与
5. 6% ~ 9. 0%。
关键词:多年生黑麦草; 红豆草;种子质量; 超低温保存
中图分类号: S812



文献标识码: A
Effect of Cryopreservation on Seed quality of Lolium perenne and
Onobrychis viciaef oli
LI Rong-hui, CAO She-hui*
( College of Anim al Sc-i T ech, Northw est A & F University, Yanling, S haanxi Province 712100, China)
Abstract: Effect of cr yopreservat ion on seed quality of per ennial r yegrass ( Lol ium per enne ) and sainfoin
( Onobry chi s v icii f ol ia Scop. ) w as studied in this paper by measuring and analy zing the seed germinat ion
rates, g erminat ion index, elect roconduct ibility, dehydr ogenase act ivity, MDA content , and soluble sugar
content before and after cr yopreservat ion at dif ferent seed moisture contents. T he results show that peren-
nial ry eg rass and sainfoin seeds at natural moisture content could be cryopreserved in liquid nitr ogen.
There w as no signif icant ef fect of cry opr eser vation t ime on the qualit ies of tw o kinds o f seeds. T her e w ere
adapt ive changes detected fo r sainfoin seeds after cryopreservat ion vs. before cry opreservation, w hile no
dif ference for perennial ry eg rass. Seed moisture content w as no t a crit ical factor determining cry opreserva-
t ion ef fects; the appropriate range of moisture content fo r perennial ryegr ass and sainfo in seeds cry opr eser-
vat ion w as 9. 2%~ 11. 8% and 5. 6% ~ 9. 0% , r espect ively.
Key words: Lol ium per enne ; Onobr y chis vicii f ol ia ; Seed quality; Cryopreservat ion


超低温贮藏指将材料放置在低于- 70
的环境
中贮藏, 一般存于液氮( - 196
)中, 利用液氮保存
种子,不需空调设备及其他管理措施,所需费用低于
低温种质库,许多报道认为在- 196
温度下, 保存
种子时间的长短对种子的活力无显著影响[ 1, 2] ,从而
大大地节约了人力和费用 [3] 。因此,许多国家的有关
实验室开展了植物器官、组织和细胞的超低温保存以
及种质库建立的研究,我国在牧草种质超低温保存方
面的研究报道很少,本文以多年生黑麦草( Lolium pe-
renne )和红豆草( Onobry chis viciif ol ia)种子为试验材
料,探讨不同种子含水量对超低温保存效果的影响,
探索其种子超低温保存的处理方法,为牧草种质资源
的超低温保存提供科学依据。
1
材料与方法
1. 1
供试材料

收获一年的多年生黑麦草种子 (特拉华 Dela-
w are)及收获两年的红豆草种子,由杨凌种籽苗木科
技部、博示蔬菜研究所提供。
收稿日期: 2007-01-25;修回日期: 2007- 08-20


作者简介:李荣辉( 1982- ) ,硕士研究生,研究方向为草业技术, E- mai l: l irongl@ tom. com; * 通讯作者 Author for corresponden ce
第 6期 李荣辉等:超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响
1. 2
实验处理
测定种子含水量后, 将一部分在硅胶干燥器中
干燥,其余装入冷冻管中, 并投入液氮保存 60 d, 定
期注入液氮,使种子始终处于液相之中。
置于干燥器中的种子每隔 2 d 取出一部分, 一
半用于测定种子含水量, 电导率,发芽率,发芽指数,
脱氢酶活性,丙二醛及可溶性糖含量,另一半装入冷
冻管中,直接投入液氮, 两天后取出迅速用 37
水
浴解冻并测定同样指标。以未干燥、未冻存种子做
对照。
1. 3
含水量测定[ 4]

采用高恒温烘箱测定法: 烘箱温度为 130 ~
133
,红豆草 60 min,多年生黑麦草 120 min, 取出
后放置于硅胶干燥器中冷却 30~ 45 min后称重, 计
算含水量。
1. 4
发芽率与发芽指数测定

按
中华人民共和国牧草种子检验规程
方法。
在25
光照培养箱中测定,每重复 100粒, 3次重复。
发芽率( % ) = 规定发芽期内正常发芽的种子
数/供试种子总数)
100%
发芽指数 [ 5] : GI=
G t / D t
其中: D t : 发芽日
数, G t : 在 t日内的发芽数
1. 5
电导率测定

数取黑麦草种子 100 粒, 红豆草种子 30粒, 2
次重复。种子放入干净的 250 mL 三角瓶中, 加入
去离子水 250 mL, 于 20
浸种 24 h,测出多年生黑
麦草 ( us/ cm
100 粒- 1 ) 与红豆草 ( us/ cm
30
粒- 1 )电导率。
1. 6
脱氢酶活性测定[ 6]

采用 T TC 定量法, 染色后经丙酮提取, 用紫外
分光光度仪测定光密度值, 计算脱氢酶活性 (
g
TT C
100粒- 1 )。
1. 7
丙二醛、可溶性糖含量测定[ 7]

采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛及可溶性糖含量。
取 100 粒种子, 3 次重复, 加 5% 三氯乙酸 8
mL,放入石英砂少量, 研磨后所得匀浆在 3000 r/
min下离心 10 min, 取上清液 3 mL, 加 0. 5%硫代
巴比妥酸溶液 3 mL,混合后在 100
水浴中煮沸 10
min, 冷却后再 3000 r/ min下离心 10 m in,分别测定
上清液在 450、532和600 nm 处的吸光值,并按下列
公式计算:
M DA( mmol
100 粒- 1 ) = [ 6. 452
( D 532 -
D 600) - 0. 559
D 450 ]
V T / V 1
可溶性糖含量( mmol/ L) = 11. 71D 450
( D 532 , D 600 , D 450 :分别是 652, 600及 450 nm 处
的吸光值)
1. 8
数据处理

用 SPSS11. 5 拟合各指标相对于含水量的曲
线,使拟合度 R2 最大的拟合模型是二次多项式模
型 Y= b0 + b1 t+ b2 t2 , 在 Excel 2003 中用二次多项
式模型作出趋势线图。
2
结果与分析
2. 1
保存时间对自然含水量种子超低温保存的影响


自然含水量的多年生黑麦草种子超低温保存
2 d、60 d的发芽率、电导率、丙二醛及可溶性糖含量
较冷冻前有所提高, 发芽指数及脱氢酶活性有所降
低,方差分析表明,其差异不显著,这说明试验方法及
保存时间对自然含水量种子的活力影响较小(表1)。
红豆草种子经冻存后,各指标值的含量均有所
提高, 且丙二醛及可溶性糖含量变化显著 ( P <
0. 05) , 冻存 60 d 可溶性糖变化与冻前差异极显著
( P< 0. 01) , 可溶性糖含量变化是对超低温保存适
应性变化的结果, 而丙二醛含量的增加,表明种子细
胞膜损伤加重。各指标值有所提高的原因可能与超
低温保存解除了部分红豆草种子的休眠有关。保存
2 d与 60 d差异不显著, 表明超低温保存时间对种
子质量影响不大(表 1)。
2. 2
种子含水量对超低温保存效果的影响
2. 2. 1
多年生黑麦草种子
多年生黑麦草种子含
水量分为 5个梯度, 分别为 11. 8% (自然含水量) ,
10. 9% , 8. 8%, 7. 9%和 7. 3%, 随着含水量的降低,
各指标值发生下列变化(表 2、图 1~ 3) :发芽率先增
大后减小, 为 91% ~ 95%, 最大值较最小值高 4.
4%。由于含水量 7. 3% ~ 11. 8%发芽率变化不大,
所以此范围内都比较适合。发芽指数先增大后减小,
为 24. 944~ 28. 675,最大值较最小值高 15. 0,适合的
含水量范围为 9. 0% ~ 11. 8%。电导率为 0. 032~
0. 058 us/ cm
100 粒- 1 , 表现为先减小后增大, 由
于变化甚小, 因此适合的含水量范围为 7. 3% ~
11. 8%。脱氢酶活性( 22. 139~ 34. 351
gTT C
100
粒- 1 ) , 先增大后减小, 最大与最小值对应含水量分
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别为 10. 5%与7. 3%, 脱氢酶活性的增大可能由于
冻存提高了种子的活力或对种子造成了损伤, 因此
仅根据脱氢酶活性的变化不能确定适合冻存的含水
量范围。丙二醛含量 ( 0. 568~ 0. 665 mmo l
100
粒- 1 )增加, 表示膜的损伤程度逐渐增大,可溶性糖
含量减小( 3. 411~ 3. 504 mmol
100粒- 1 ) ,变化不
大(表 2,图 1~ 3)。
综合种子质量各方面, 含水量在 9. 2% ~
11. 8%时种子发芽率、发芽指数、电导率与脱氢酶活
性在合适的范围之内, 较适合种子超低温冻存。多
年生黑麦草种子冻存效果较适合的含水量范围为
9. 2% ~ 11. 8%。经常规干燥的种子也可用于冻存。
2. 2. 2
红豆草种子
红豆草种子含水量分为五个
梯度,分别为 9. 0% (自然含水量 ) , 8. 1%, 6. 3% ,
5. 5% , 4. 7% ,随着含水量的降低, 种子各生理指标
发生下列变化(表 2,图 4~ 6) :发芽率先增大后减小
( 13% ~ 24%) , 最大值与最小值对应含水量分别为
7. 2%与 4. 7% ,含水量在 5. 4%以下的种子发芽率
低于含水量 9. 0%时的值, 因此,适合的含水量范围
为 5. 4%~ 9. 0%。发芽指数先增大后减小( 2. 418~
2. 915) ,最大值与最小值对应含水量分别为 7. 1%
与 4. 7% ,含水量低于 5. 2%时, 发芽指数低于含水
量 9. 0%的值, 适合的含水量范围为 5. 2% ~ 9. 0%。
电导率先增大后减小( 2. 258 ~ 2. 840 us/ cm
30
粒- 1 ) ,最大值与最小值对应含水量分别为7. 2%与
4. 7%, 由于发芽率变化较大,电导率大小与种子活
力呈负相关 [ 8] , 含水量 4. 7% 种子的活力最高, 因
此,适合的含水量范围为 4. 7% ~ 9. 0%。脱氢酶活性
不断减小( 303. 095~ 381. 928
gTTC
30粒- 1 )。丙
二醛含量先减小后增大,最小值与最大值对应含水量
分别为 7. 3%与 4. 7%,含水量低于5. 6%后丙二醛含
量高于含水量9. 0%时的值,因此,适合的含水量范围
为 5. 6% ~ 9. 0%。可溶性糖含量先减小后增大
( 37. 610~ 42. 247 mmol
30粒- 1 ) ,对应含水量分别
为 6. 8%~ 9. 0%(表 3,图 4~ 6)。
结果表明,适合红豆草种子超低温保存的含水
量范围为 5. 6% ~ 9. 0% ,经常规干燥的种子也可用
于冻存。
表 1
自然含水量种子超低温保存 2 d、60 d 前后生理指标变化
T able 1
Changes of seed physio log ic index before and after 2-day and 60-day cryopreservat ion
草种
Variety
保存时间( d)
Preservat ion
t ime
发芽率( % )
Germinat ion
rate
发芽指数
Germination
index
电导率
( us/ cm
100粒- 1,
us/ cm
30粒- 1)
Elect roconductib ilit y
脱氢酶
( ugT TC
100粒- 1 ,
ugT TC
30粒- 1 )
Dehydrogenase
丙二醛
( mm ol
100粒- 1,
mm ol
30粒- 1)
M DA
可溶性糖
( mmol
100粒- 1 ,
mmol
30粒- 1)
Solub le sugar
多年生黑麦草 0( CK) 92 26. 62 0. 037 26. 692 0. 517 3. 266
Peren nial ryegrass 2 95 26. 15 0. 038 25. 050 0. 558 3. 479
60 93 26. 39 0. 038 25. 983 0. 548 3. 285
红豆草 0( CK) 14 2. 25 2. 433 323. 485 1. 866 29. 643
Sainfoin 2 15 2. 42 2. 452 408. 458 2. 526a 35. 286a
60 17 2. 47 2. 505 420. 268 2. 500a 39. 252A


注: a: 5%显著水平, A : 1%显著水平
Note: Sm al l let ter
a
indicates signif icant dif feren ces at 0. 05 level; capital let ter
A
indicates signif icant dif f erences at 0. 01 level
图 1
多年生黑麦草种子超低温保存前后发芽率与发芽指数趋势线
Fig. 1
Germination r ate and germination index t rendline o f per ennial ry egr ass seed befor e and after cr yopr eser vation
590
第 6期 李荣辉等:超低温保存对多年生黑麦草与红豆草种子质量的影响
图 2
多年生黑麦草种子超低温保存后电导率与脱氢酶活性趋势
F ig. 2
Elect roconductibilit y and dehydragenase act ivit y tr endline o f per ennial ry eg rass seed befor e and after cr yopreserv ation
图 3
多年生黑麦草种子超低温保存后丙二醛与可溶性糖含量趋势
F ig . 3
MDA and soluble suga r content t rendline of perennial r yeg rass seed befo re and after cr yopr eser vation
表 2
多年生黑麦草与红豆草种子超低温保存前后适合的含水量范围
Table 2
Suitable moistur e content of perennial ryeg rass and sainfoin seeds befor e and after cry opreserv ation
草种名称
Variet y
冷冻处理(% )
Cryopreser
v ation
treatment
发芽率(% )
Germ inat ion
rate
发芽指数
Germination
index
电导率
( us/ cm
100粒- 1,
us/ cm
30粒- 1 )
Electrocond
uct ibilit y
脱氢酶
( ugT TC
100粒- 1,
ugT TC
30粒- 1)
Dehydrogena se
丙二醛
( mmo l
100粒- 1 ,
mmo l
30粒- 1)
MDA
可溶性糖
( mmo l
100 粒- 1,
mmo l
30粒- 1 )
Soluble sugar
适合含水量
( % )
Suitable
mo ist ure
content
多年生黑麦草 超低温保存前 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8
Perennial ryeg rass 超低温保存后 7. 3~ 11. 8 9. 0~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 9. 2~ 11. 8 7. 3~ 11. 8 9. 2~ 11. 8
红豆草 超低温保存前 4. 7~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 4. 8~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 4. 8~ 9. 0
Sainfo in 超低温保存后 5. 4~ 0 5. 2~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 5. 6~ 9. 0 4. 7~ 9. 0 5. 6~ 9. 0
3
讨论
3. 1
多年生黑麦草与红豆草种子超低温保存 2 d
与 60 d,种子存活。多年生黑麦草种子超低温保存
2 d与 60 d相比活力基本无变化;较保存 2 d相比,
红豆草种子保存 60 d 发生了有益的适应性变化。
这与 Stanw ood( 1985)
在液氮保存过程中, 在种子
冷却到- 196
后再升温的过程中能存活的种子, 延
长其在液氮中贮存的时间也不会对种子有害
的结
果一致。因此,本实验在液氮中短期保存的种子,基
本上反映了其在超低温保存的特性。
3. 2
刘燕等在研究园林花卉种子超低温保存时认为
含水量对于不同种子超低温贮藏效果不同[ 9]。有报
道指出禾本科在 7. 2%~ 9. 3%之间较为适宜[ 10]。本
实验作出多年生黑麦草含水量在9. 2%~ 11. 8%时液
氮保存效果较好,而红豆草种子含水量 5. 6%~ 9. 0%
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超低温保存效果较好,这可能与试验种子不同有关。
3. 3
植物器官在逆境条件或衰老时,往往发生膜脂
过氧化作用,丙二醛是其产物之一, 对细胞有毒性,
能够引起细胞膜功能紊乱, 且对许多功能分子有破
坏作用, 是反映膜损伤程度的重要生化指标之一
[ 11]
,丙二醛含量变化与种子活力成反比,其变化趋
势能很好的表明种子活力的变化趋势。
3. 4
在试验过程中,可溶性糖含量在反映种子活力
变化水平上稳定性较差, 因此单项活力指标不能全
面的反映种子活力, 要从多方面,采用多种方法对种
子活力进行综合评定 [ 12]。
3. 5
根据种子的贮藏特性,分为正常性种子和顽拗
性种子两大类。顽拗性种子在经成熟干燥期以后以
较高含水量从母树上脱落,既不耐干燥又不耐低温,
红豆草种子即属于此种类型, 硅胶干燥较缓和,对细
胞伤害小,因此适合红豆草种子等顽拗型种子的干
燥。由于顽拗性种子对脱水低温的敏感性给长期贮
藏带来极大困难,目前认为,其贮藏的最佳手段是进
行超低温保存, 因为在超低温状态时,顽拗性种子在
适度的水分状态下, 不仅能维持种子活力,而且能保
持组织和细胞形态上和种质遗传的稳定性和完整
性[ 13] , 研究以红豆草种子为例研究顽拗型种子的超
低温保存具有重要意义。
4
结论
4. 1
多年生黑麦草与红豆草种子在自然含水量状
态即可直接投入液氮中保存, 保存时间的长短对种
子影响不显著; 多年生黑麦草种子超低温保存前后
差异不显著,红豆草种子冻后发生了有益的适应性
变化。
4. 2
含水量水平不是影响超低温保存效果的重要
因素,多年生黑麦草种子和红豆草种子超低温保存
最适含水量范围分别为 9. 2% ~ 11. 8%与 5. 6% ~
9. 0%。
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(责任编辑
张蕴薇)
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