全 文 ：第 巧 卷 第 2期 V ol. 1 5, N o . 2
19 92 年 6 月
八 一 农 学 院 学 报
J o u r n a l o f A u g u s t l s t A g r i
.
C o l l e g e
`
J un
. ,
1992
首蓓与红豆草体细胞杂交的研究及条件
杨茁萌
(草原系 )
杉信贤一
(农林水产省草地试验场育种部生物技术研究室 , 西那须野盯千本松 7 68 , 日本国 )
摘 要 无傲胀病首借品种的育种计划的可能突破 口 , 是利用生物技术把单
宁基 因导入到紫花首藉 ( 3了` id ca 刘 sa ivt a L ) 中去 。 本文首次报道了紫花首着
与红豆草 (口on b yr hc is , t’c i of ial S o o p . ) 原生质体融合的可能性和条件 , 进而将
红豆草的单宁基因导入到首着中去 。 本实验结果证明首着与红豆草的原生质体融
合是可能的 , 通过基 因型选择 , 选择同步分裂的首着和红豆草细胞系 , 从其悬浮
培养细胞系中分离原生质体 , 将两者混合悬浮在 O. l m M c a cl 尹. 6 M 甘露醉溶液
中 ( p H S . 6 ) , 原生质体总 密度为 3 . 6 x 10 5 / m 一 (首藉 占 2 . 3 x 10 5 / m l , 红豆草
占 l . 3 x l o , / m l ) , 在 一0 0一 一2 5 x v / c m 电场强度下 , 脉冲次数 1一 3 次 , 其异
核融合细胞频率可提高到 2石. 7一 40 .夕% , 并且其异核体仍能较好地分裂 , 可以分
裂 2一 了次 , 个别分裂 4 次 , 形成小细胞团 , 但植板率很低 , 未能持续分裂形成
愈伤组织 。 建议为了提高异核体的植板率 , 电场强度应低于 1 . 2 J K V / c m , 甚至
低于 .1 0 K v / c m , 脉冲次数 I 一 2 次为宜 , 以减少电场对 细胞的损害 . 同时提
高原生质体培养密度 、 改 良培养条件和方法 。 如何保证异核体持续分裂和 高的植
板率是今后研究的关键问题 。
关键词 首着 ; 红豆草 ; 原生质体融合 ; 无服胀病首藉育种
0 前 言
紫花首蒋 (刀 e dl’ ca go sa lt’v a L ) 是中国 、 亚洲 、 北美最广泛利用的 、 最重要的豆科
牧草 。 其适应性强 , 产量高 , 饲养价位高 , 单位面积生产的蛋白质比任何其它牧草都高 ,
被誉为 “ 饲草之王 ” 。 尽管首拾具有许多的优点 , 但是 , 反色家畜采食新鲜 、 青嫩的首拾会
引起服胀病而死亡 , 严重地影响着它在放牧方而的进一步利用 .
K en da l ( 19 6 6) 建议不致服胀病的豆科牧草中的单宁能防止撇胀 〔` ) . 这一结论又
再次被 J o n e s , L y t t l e t o n ( 2 9 7 1 ) 〔 ,〕 和 o u t e k 等 ( 1 9 7 4 ) 〔’ 〕 所证实 . 但是 , 首拾叶片中
不含浓缩单宁 . 针对这一问题 , 口前五个国家的六个实验室试图利用生物技术把单宁基因
从其它不致滕胀病的豆科牧草导人到紫花首猪中去 。 由于红豆草 ( o no b yr ch 动 v ic i或fo 加
收稿 日期 : 199 2一 04一 17
八 一 农 学 院 学 报 1 99 2年
Socp
.
) 不致腹胀病 , 在各个生育阶段叶片中均含有浓缩单宁 , 并且红豆草适 口性好 ,
各种家畜均喜食 , 最近被许多实验室用为不致滕胀病首拾育种的最佳育种材料 .
尽管从红豆草叶肉原生质体培养获得再生植株 闭 , 但至今仍无红豆草原生质体融合
的报道 . 相对而言 , 有关首拾原生质体培养成功的报道较多 〔5〕 一 `” , 在近五年中 , 也有
许多科学家试图通过细胞融合等 D N A 导人技术把育拾属一些野生种抗病 、 抗虫基因导人
到紫花首拾中去 闭 一 ( `0 , . 在首拾服胀病这个世界性课题上 , 加拿大 、 美国 、 日本等国
家都在积极开展首箱与红豆草原生质体融合研究 , 但是 , 迄今无任何融合研究的成功报
道 , 本文首次报道了首洽与红豆草原生质体融合的可能性以及异核体的培养条件 , 为该育
种计划提供了科学依据 .
1 材料与方法
L l 材料 :
首楷细胞系 , K S E 3一 R 具有生长快 , 再生能力强的特性 , 采用悬浮培养 , 悬浮培养
基为 M s 培养基 , 并附加 Zm g / l 的 2 , 4一 D 、 N A A 和 K T , 3% 的 蔗 糖 , p H 值 为 .5 8
〔 ; ,〕 . 摇床转数为 1 1O r / m in , 温度为 25 ℃ , 光照强度为 3 80 L ux , 侮天光照 1 6 h , 细
胞含叶绿体 .
红豆草细胞系 , L 7H A Z B Z 生长快 , 无再生能力 , 悬浮培养基也为 M S 培养基 , 分别
附加 0 . 2 m g / l 的 2 , 4 一 n 和 B A P , 2 . 0 m g / l 的 N A A 和 3 0 户万 的 L 一脯氨酸 , p H 值为
.5 8 ,2I 〕
, 摇床转速为 1 1o r / m in . 黑暗培养 , 温度为 26 ℃ .
以上细胞系均一周进行一次继代培养 , 更换新鲜培养基 .
1 .2 方法 :
1 .2 1 混合酶液 本实验中采用两种酶混合液 , 红豆草细胞系选用 1Y 酶 液 , 首拾为
Y 3
, 其酶种类及浓度如下 :
M
a e e r o z y m e R一 1 0
C e l l u l a sc o n o z u k a R S
P e e t o ly a s e Y一 2 3
P H
Y 1
0
.
5%
1%
0
.
1%
5
.
6
2 %
0
.
2%
5
.
6
以上酶液均用 c P w o . 6M 甘露醇溶液溶解配制 ( 1 3〕 , 用 0 . SN K o H 或 0 . 2 入任I cl 调整
p H 值 , 然后抽滤灭菌 .
L 2 .2 原 生质体分离 取 1 9 左右继代培养第三天的悬浮培养细胞 , 置于盛有 10 m l
酶混合液的 60 x 20 m m 的无苗塑 料培养皿 中 , 然后 在黑 暗条件下 ( 26 ℃ ) , 在摇床
(4 0 r / m i n ) 上酶解 4 一 s h , 然后用 3 2 井m 孔径的尼龙筛过 滤 , 在 8 0 0 r / m i n 下离心
s m i n ( 6 ℃ ) , 吸去酶 液 , 然后轻轻用 C P W O . 6万 甘露醇溶液悬浮 , 在 8 0 0 r / m i n 下离
心 5 m in , 吸去上清液 , 再重复二次 。 提纯后的首楷和红豆草原生质体见图 1 和图 2 。
1
·
2
·
3 I o A ( I o d o a e e t a m id e ) 原生质体膜处理 首拾细胞系 ( K SE 3一 R ) 用于融合
的原生质体在分离清洗 2 次后 , 悬浮在 s m M I O A 的 C PW O . 6 M 甘露醇溶液中 , 原生质
体密度为 10 4一 1 0 5 / m 】, 在 Zo oC 下静置 l o m i n , 离心 ( s o o r p m , s m i n ) , 吸去 上清液 ,
第2 期 杨茁萌等 : 首拾与红豆草体细胞杂交的研究及条件
然后立即用 C P WO .6 M 甘露醇溶液洗三次 .
1
.
2 .4 原生质体融合 采用 日本S h im ad z u 体细胞杂交仪 ( s H ~ ) 1进行原生质体
融合 , 选用 3 号融合槽 . 首先将红豆草原生质体与 I O A 处理的首拾原生质体以体积比
v( / v) 1
: 1混合 , 其原生质体总密度为 2一 3 . 6 x lo , / m l, 电场强度和脉冲次数依具体
实验而定 , 脉冲处理后 , 立即关闭电场 电源 , 在倒置显微镜下静置 10 m in , 同时 , 利用
叶绿体嵌合体现象 , 测定各融合处理的异核体百分率 (重复三次 以上 ) . 融合处理后的原
生质体用吸管移置到一个离心管 , 离心后吸 去 上 清 液 , 加人 培养 基 , 调 整 密 度 , 用
于培养 .
1
.
2 3 原生质体培养基和细胞培养基 原生质体培养基 ( B o )P 与 B S基础培养基 的
矿物 质 盐 类 和 维 生 素相 同 , 2% 蔗 糖 , 另外 附加有 .0 6 m g / m l C a cl : · Z H Zo,
63
.
7 m g / m l葡萄糖 , p . 2 5m g / m l 核糖 , 0 . 2 5 m g / m l 山梨醇 , 0 . 5 8 m g / m l L 一谷酞氨 ,
0
.
2 5 m g / m l 水解酪蛋白 , 0 . 2 m g / 1 2 , 4一 D 和 B A P 、 细胞培养基 ( B SC ) 只含 10 9 / l
的葡萄糖 , 其它所有成分与其原生质体培养基 (B S)P 相同 ` 以上两种培养基的 p H 均为
.5 6
, 用 .0 SN K O H 或 0 . 2入几J CI 调整 , 并抽滤灭菌 .
1
.
2 .6 原生质体培养方法 将原生质体以 .2 0一 .4 0 x lo ,式 m l 的密度 , 悬浮在二倍浓
度的 B尹 液体培养基中 (其中葡萄糖和蔗糖的浓度分别为 63 . 7 m g / m l 和 2% ) , 然后与
相 同体积的 2 % 融化的琼脂糖 ( s ig m a t e p y 姐或 s e a p la q u 。 ) (其中分别含有 6 3 . 7 m g / m l
和 2 % 的葡萄糖和蔗糖 ) , 棍合摇匀 , 待冷却凝固后切成六等份 , 分别移人另外 2 ~ 3 个培
养皿中 , 加人适量的液体 B S P , 用石蜡膜带密封 , 编号 , 观察记录每个培养皿中原生质体
的形状和分散情况 , 然后置于暗培养室中的摇床上培养 , 转数为 40 r / m in , 温度为
26 ℃ , 第二天观察细胞壁形成情况 , 每天观察细胞分裂次数 , 培养第 14 天统计植板率 .
2 结果与讨论
2
.
1 不同电场条件下的融合细胞的分裂
细胞分裂的同步性是体细胞杂交成功的重要因素之一 , 影响细胞分裂周期的因素主要
有基因型和培养基等 . 在本实验中选用了首拾细胞系 K SE 3一 R 和生长快的红豆草细胞系
7L H A
Z B : 进行原生质体融合 . 其电场强度共四个处理 :
处理 1 电场强度为, 1 . 75 K V / c m , 脉冲次数为 ;4 处理 2 电场强度为 2 . 0 K v / c m ,
处理 3 电场强度为 1 . 50 K V / c m , 处理 4 的电场强度为 l . 25 K V / c m , 处理 2 、 3 、 4 的
脉冲次数均为 6 次 。
将 K S E 3一 R 和 L 7H A Z B : 的原生质体以 卜 1 体积比混合 , 悬浮在 C P w .o 6 M 甘露
醇 (p H S . 6) 溶液中 , 原生质体总密度为 2 . 0 x l护 / m l , 两种原生质体各占一半 . 原生质体
培养密度为 1 . o x l护 / m l , . 包埋培养在 B SP 原生质体琼脂糖培养基中 , 培养程序为 : 培
养的第 7 天 , 换人 :1 l( v / v) 混合的 B尹和 B S C , 第 14 天换成 几C , 以后每 7 天换一次
B SC
. 在融合处理的同时 , 留出 K S E 3一 R 和 L 7H A Z B : 原生质体各一份作为对照 , 进行
同样的培养 , 以比较电场处理与非处理的原生质体在细胞分裂上的变化 , 结果见表 1 .
从表 l 可以看出 , 在对照组中 , 这两个细胞系的细胞分裂周期相同 , 同步分裂 , 每天
分裂一次 , 首怡和红豆草第 14 天的植板率分别为 42 . 3% 和 16 .7 % , 红豆草和苔拾原生质
体培养获得肉眼可见的小愈伤组织天数分别为第九天和第 12 天 〔见 图版 3 , 4 〕 , 3一 4 周
4 八 一 农 学 院 学 报 192 9年
后就可 以获得直径为 1一 1. 5 m m大小的愈伤组织 , 而用 I O A 处理的 K SE 3一 R 无一正常
分裂 .
表 1 不同电场强度对融合细胞分裂的影响
细胞系 重 复 细 胞 分 裂
笙 天 笙 天 望 天 籍 平 细 天 会 天
次 次 次 率 均 胞 伤分 数 分 数 分 数 。 , % , 数 组 数硬 d 硬 d 发 J , O 仁 J l 翻 ,二砂叱 不叱 年义 夸飞
K 3E 3一 R I + 2 + 3 + 4 40 + 5 + 12
(C K ) l + 2 + 3 + 4 30
,
4 42
.
3 + 5 + 12
I + 2 + 3 + 4 5 6
.
5 + 6 + 12
L 7 H A Z B Z I + 2 + 3 + 4 7
.
4 + 6 + 9
(C K ) 且 + 2 + 3 + 4 18 二1 16 . 7 + 6 + 9
lI + 2 + 3 + 4 24
,
6 + 5 + 9
处 理 l I + 2 + 3 + 5 5 一 7 一
l 5
.
2
+ 2 + 3 一 4 . 6 一
处 理 2 I + 2 + 8 一 2 . 4 一
l 2
.
3
十 . 2 一 2 2 一
处 理 3 I + 2 + 3 + 5 6 . 8 一
l 7
.
8
+ 2 + 3 + 6 8
.
7 一
处 理 今 I + 2 + 3 + 4 1 1 . 7 一
n 11
.
9
+ 2 + 3 + 4 12
.
1 + 8 一
K SE 3一R I 一 0 一
( I O A ) I 0一 0 一
+: 细胞分裂 一 : 停止分裂
在所有融合处理中均看到了异核体的细胞分裂 , 随着电场强度的增加 , 细胞受害越
重 , 原生质体形状越差 , 细胞分裂慢而少 . 如处理 2 ( .2 0 K V / c m ) 细胞只分裂 1一 2
次就停止了分裂 , 植板率只有 .2 3% ; 处理 3 和处理 4 表现较好 , 异核体分裂 3一 4 次 , 特
别是处理 4 中的 第二重复 , 在 培养第 8 天 见 到 了小细 胞 团 〔图版 6〕 , 处理 4
( 1 25 K v / c m 的植板率平均为 1 . 9% . 因此 , 在用 C PW 溶液作原生质休悬浮液时 , 电
场强度以 1 . 2 5一 1 . 50 K v / c m 为宜 , 但异核休频率较低 .
在融合处理中 , 异核体细胞分裂周期与对照相近 , 异核体可 以分裂 2一 4 次 。 因此 ,
通过基因型选择可以获得细胞分裂周期相同 , 每天分裂一次的适于融合的首洽和红豆草细
胞系 , 异核体是可以分裂的 。
2
.
2 不同电场条件对异核融合率的影响
通 过评 价 比 较 了 几 种 浓度 的 C a CI : 溶 液 后 ( C P w 溶 液 为 对 照 ) , 选 用 了
0
.
1 m M ca cl .oz 6 M 甘露 醇溶 液 ( p H .S 6 ) 为融合时原 生质休悬浮 液 , 因为结果证 明
第 2期 杨茁萌等 :首拾与红豆草体细胞杂交的研究及条件 5
0
.
1 mMc
a
c I
Z o
.
6M甘露醉溶液的融合效果比 CPw o . 6M甘露醇明显好 , 而且所需的电场
强度和脉冲次数都显著低于 C PW 溶液 . 此次 , 电场融合条件设计如下 :
处理 1 处理 2 处理 3
频率 ( M H z ) 1 1 1
交变 电压 ( V ) 4 0 4 0 4 0
PW (m i
e r o s e c ) 3 0 3 0 3 0
直流 一U电压 (V ) 2 50 2 0 0 2 0 0
电场强度 (K V / e m ) 1 . 2 5 1 . 0 0 1 . 0 0
脉冲次数 ( P u l s e ) 3 3 2
融合处理中 , 原生质体总密度为 .3 6 x l护 / m l , 其中 K SE 3一 R 占 .2 3 ` 1护 / rn1 ,
7L H A
Z B Z为 1 . 3 x lo , / m l , 原生质体培养密度为 1 . 8 x lo , / m l , 融合效果见表 2 .
表 2 不同电场条件对异核体频率和异核体细胞分裂的影响
细 胞 系 重 复 异核体频率% 细 胞 分 裂
平 均
第 第一 天 二 天次 次分 数 分 数
裂 裂
处 理 l I 2 7 . 1 + 5
lI 34 + 5
4 0
.
9
处 理 2 I 2 8 . 6 + 一 十 5
l 27
.
7 + 5
26
.
7
处 理 3 I 2 9一 7 + 5
I 29
.
7 + 一 + 5
K S E 3一 R I + 一 + 5
(对 照 ) l + 一 + 5
班 + 一 + 5
表 2 结果表明 , 融合处理 1异核体频率平均为 34 % , 高则达 40 . 9% ; 处理 2 和处理 3
无显著区别 , 融合率也都在 26 .7 % 以上 , 但脉冲次数二次 , 有利于提高两两原生质体融
合频率 .
以上结果证明 : 首洽与红豆草原生质体融合是可能的 , 在 1 . 0 一 1 . 25 K v / c m 电场强
度下 , 异核体频率可达 26 一 40 % 〔图版 5〕 , 并且异核休形状 良好 , 能进行分裂 , 在保证
适量异核体的前提下 , 应进一步降低电场弧度 , 至少应低于 1 . 25 K V / c m , 以减少电场
对原生质体的伤害 , 保证原生质体的持续分裂 , 提高植板率 .
高的原生质体融合密度 , 如 4 一 6 x 105 / m l , 对提高融合率有益 . 另外 , 由于首拾原
生质体进行了 I O A 膜处理 , 细胞有一定程度的损害 , 故在混合两种原生质体时 , 应加大
首抬原生质体的比例 , 以保证有等量的正常原生质体 。
通过多次实验 , 我们认为由于融合细胞受到电场的伤害 , 能分裂的细胞数量较少 , 在
原生质体培养时 , 应提高其培养密度 , 如 4一 6 .0 x 10 5 / m l 为宜 . 如何改善培养条件和
6八 一 农 学 院 学 报 199 2年
方法 , 保证异核体持续分裂 , 提高植板率将是今后获得杂交体细胞愈伤组织的重要问题 .
此研究工作是在 日本农林水产省草地试验场进行的 . 首先感谢衫信贤一博士的邀请和
日本饲料作物种子协会的资助以及草场试验场所提供的工作条件 . 同时 , 感谢松前国际友
好财 团的招骋 , 为我提供了访 日的机会 .
参 考 文 献
1 K e n d a ll
,
W
.
A
. ,
F a e t o r s a cf e t in g fo a m s w i ht fo r a g e 1e g u m e s
.
C r o P S e ie n e e
.
196 6
,
6 : 4 8 7一 48 9
2 J o n e凡 W
,
T
.
a n d J
.
W
,
L y t tl e t o n
.
B lo a t in e a t t 1e X X X IV
.
A s u vr e y o f l e g u m e fo r a g e s th a t d o a n d d o
n o t p r o d u e e b lo a t
.
N
.
Z
.
J
.
A g r i
.
R e s
.
19 7 1
,
14 : 10 1~ 10 7
3 G u te k
,
L
.
H
. ,
B
.
P
.
G o P le n
,
R
.
E
.
H o w a r ht a n d J
.
M
.
M e
a r ht u r
.
V a ir a t io n o f s o lu b le P r o te i n s i n
a laf l af
, s a in fo i n a n d b i r d s fo o t t cr fo il
.
C r o P S e ie n e e
.
19 74
,
14 :4 9 5~ 4 99
4 A h u孙, P . S . , L u , D . Y . , C o e k in g , E . C . a n d D a v e y , M . R 、 A n a s cs s s m e n t o f th e e u l tu r a 1 e a p a b i li t ie s
o f rT 汤 il u胡 r e详n s L . ( w h it e e l o v o r ) a n d O n o b yr c h臼 v i c ii力枷 S e o P . ( s a i n fo in ) m e s o p h y ll
P r o t o P la s ts
.
P la n t C e l l R e P o r st
.
198 3
,
2 : 26 9 ~ 2 72
5 K a o K
.
N
,
a n d M
.
R
.
M ie h a y lu k
.
P 1a n t r e g e n e r a t i o n fr o m m e s o P h y 1I P r o t o P 1a s t s o f A l几 laf .
Z
.
P fl a nz e n p h y s io l
.
B d
,
9 6
.
5
.
19 80 : 13 5~ 14 1
6 L i S u N a m a n d H e sz k y L
.
E
.
S e cr e n in g fo r p l a n t r e g e n e r a ti o n i n e a l l u s a n d p r o t o p ]a s t e u 】t u r e s o f
a lfa lfa ( M e id c a g o 扣 ri v a L . ) g e r m P l a s m s . A e t a B o t a n ie a H u n g a r ie a . 19 87 : 33 (3一 ) : 38 7一 39 3
7 G il m o u r D
.
M
. ,
M
.
R
.
D a v e y a n d E
,
C
.
C o e k i n g P ]a n t r e g e n e r a ti o n fr o m e o t y le d o n p r o t o p 1a s t s o f
w i ld M e d i e a g o s P e e i e s
.
P la n t S e ie n e e
,
19 87
,
4 8 : 10 7~ 1 12
8 G ilm o u r D
.
M
. ,
M
.
R
.
D a v e y a n d E
.
C
.
C o e k i n g
.
I s o 1a t i o n a n d e u l t u r e o f h e t e r o k a yr
o n s fo l l o w i n g
fu s io n o f Por to P l a s t s fr o m s e x u a l ly e o m P a ti b ]e a n d cs x u a l ]y i n e o m p a t i b l e M e d ic a g o s p e e i e s P l a n t
S e ie n e e
,
1987
,
53 : 26 3~ 27 0
9 D a m i a n i F
, ,
M
,
P e z o t t i a n d S
.
A r e i o n i
,
E 1e e t r i e if e 1d m e d i a te d fu s i o n o f p
r o t o p 1a
s t s o f M
e
d j
e a g o
as l i v a L
,
a n d M e dl’c a 只0 a r b o r e a L . J . P l a n t P h y s i o l 19 88 , 13 2 : 4 74 ~ 4 7 9
10 T h o m a s M
.
R
. ,
L
.
B
.
J o hn s o n a n d F
.
F
.
w h it e
,
S e le e t i o n o f i n t e r s P e e i if e s o m a t ie h y b r id s o f
M e d ie a g o by u s in g A g ro b a e t e r iu m 一 t ar n s fo r m e d t is u e s . P la n t S e ie n e e , 199 0 , 69 : 189一 19 8
1 1 K e n 一ie h i S u g i n o b u , T a d a s h i T a k a m iz o , H id e y u k i H a y a s h i a n d S a to r u A b e . E cf e t s o f g e n o t y pe
a n d e u l t u r e e o n d i t i o n s o n t h e fo r m a t io n o f e a l lu s a n d s o m a t ie e m b yr o s i n a l af l af ( M e id
c a又。
s a r i v a L
.
)
.
J o u nr a l o f j a P a n e s e S o ic e t y o f G r a s s la n d s e i e n e e
.
199 I
,
36 (4 ) : 3 90 ~ 40 3
12 H i r o s h云N a k a s h i m a a n d Z h u o m e n g Y a n g . E cf e t s o f P la n t g r o w th r e g u l a t o r s o n e a ll u s in d u e t i o n
a n d r e g e n o r a t i o n r o m e a】lu s i n s a in fo i n ( O n o占r y动。 , i e i ifo ial s e o p
.
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13 李向辉等 ,植物遗传操作技术 , 北京 : 科学出版社 , 198 8 : 153~ 154
第 2期 杨茁萌等 :首拾与红豆草体细胞杂交的研究及条件
分离的 K SE了一 R细胞 系的原生质体 , ,
分离的 L 7 H A Z B Z 细胞系的原生质体 ,’
L 7 I I月 2 B 2 原生质体培养第 14 天的植板率及小愈伤组织 ,’
KS
E J一 R 原生质体培养第 14 天的植板率及小愈伤组织 .’
在电场作用下首着 x 红豆草原生质体融合频率及融合细胞形状 (含叶绿体
的为 KS E 3一 R ) ;
首蔺 x 红豆草异核体分裂形成的小细胞团 。
1二2345图
图 6
8八 一 农 学 院 学 报 9 19 2年
St ud y on Pr ot oP l a st F u s in o ofA lf alf a(M
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K n e ie hiSUG IN OB U
(B` o` c中“ ol o gy Lab or a` or y, N a “ o n a , G r a ` S ,a n d R c s c a r c h ` n s“ ` u ` c , 7 8 “
S e n b o n m a t s u
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A b s t r a e t T h e P o s s i h le b r e a k t h r o u g h fo r d e v e l o P i n g b l o a t一 fr e e a l几 l几 fM e d i e a 月。
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cr P o r t e d t h e P o s s ib i l i t y a n d e o n d i t i o n s o f P r o t o P l a s t fu s i o n b e t w e e n a l ar l几 a n d s a i n of i n
f o n o b r夕e h is v i e i或of li a S e o p . ) , t h e n w o h o P e t o t r a n s fe r t h e t a n n i n g e n e fr o m s a i n fo i n i n t o
a l伍 lfa . T h e r e s u l t s p r o v e d t h a t i t w a s P o s s ib l c t o fu s e t h o s e l w o P r o t o P l a s t s . T h r o u g h 一h e
g e n o t y P i e s e le e t i o n
,
t h e e e l l l in e s w h ic h h a d s im i l a r e e ll c y c ]C w e r e s c l e c t c d a n d c m P l o y e d t o
i s o l a t e t h e P r o t o P l a s t s fr o m t h o 邪 s u s P e n s i o n e e l ls . B o t h P r o t o P l a s t s o f a l fa l fa a n d s a in fo in
w e cr s u s P e n d e d i n 0
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d e n s i t y o r 3
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