全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 03-0257-03
日本结缕草胚性愈伤诱导与植株再生(简报)
齐春辉,梁小红,韩烈保
(北京林业大学草坪研究所, 北京林业大学省部共建森林培育与保护教育部重点实验室, 100083)
Embryogenic Callus Induction and Plant Regeneration of Zoysia Japonica
QI Chun-hui, LIANG Xiao-hong, HAN Lie-bao
( Institut e of T ur fgr ass Science Beijing For estry Univ er sity , T he Key Labo ra tor y fo r Silv icultur e and
Conserv ation of M inist ry of Education, Beijing For estr y Univ ersit y, Beijing 100083, China )
关键词: 日本结缕草;胚性愈伤; 植株再生
Key words: Zoy sia j aponica; Em bryogenic callus; P lant r eg ener ation
中图分类号: Q943　　　文献标识码: A
　　日本结缕草( Zoysia j aponica Steud. )作为低耗水
量、抗性强、管理粗放的暖季型草坪草种越来越受到关
注。但其绿期短、对褐斑病、刺线虫等病虫害抵抗力较
弱。与冷季型草坪草相比,暖季型草坪草更难诱导胚性
愈伤组织并再生植株[ 1]。虽然已有结缕草愈伤诱导植
株再生的报道 [ 2～4] , 但缺乏系统研究。本试验拟探讨多
个可能影响日本结缕草组织培养的因素, 建立其植株
再生体系,为下一步的外源基因转化奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
日本结缕草: Zenith、Qingdao 2个品种, 分别由
TM I( T ur f Merchants, Inc)和北京市种子公司提供。
1. 2　方法
1. 2. 1　材料处理
成熟种子用次氯酸钠溶液 ( > 5%活性氯, 加入
1～2滴吐温 20) , 在磁力搅拌器上消毒 1 h, 无菌水冲
洗 3～5次, 4℃下浸泡若干天。
1. 2. 2　愈伤诱导与继代
种子用无菌滤纸吸干多余水分后接种于不同固体
培养基上, 黑暗状态下 28℃诱导愈伤。每处理设 3个
重复。1个月后统计愈伤诱导率,继代培养基与愈伤诱
导培养基相同, 2个月后统计胚性愈伤率。愈伤每月继
代 1次。各培养基以 MS 基本培养基为基础, 蔗糖
3% ,琼脂 7%, pH 值 5. 8, 121℃高压灭菌 15 m in。
1. 2. 3　愈伤组织的分化与植株再生
挑选淡黄或白色、结构致密、颗粒状的胚性愈伤组
织 ( 0. 5 mm )转入不同再生培养基培养, 光照强度
2000～3000 Lux ,光照周期 12 h,温度 25～28℃, 1 个
月后统计植株再生率。待小植株形成后, 转入 1/ 2M S
培养基上壮苗。根系强壮后,打开瓶盖炼苗 3 d, 再以自
来水小心洗去根部琼脂,移栽入由砂( 0. 25～0. 5 mm )
与草炭土混合物基质中,混合比例为 9∶1。
1. 3　数据统计
愈伤诱导率= 形成愈伤种子数/接种种子数×100%
胚性愈伤率= 胚性愈伤数/接种愈伤数×100%
植株再生率= 再生植株愈伤数/接种愈伤数×100%
2　结果与分析
2. 1　预处理对成熟种子愈伤诱导率的影响
除品种 Qingdao 未去皮种子需浸泡 14 d以上外,
其余种子消毒后在 4℃下浸泡 2～3 d提高愈伤诱导率。
品种 Zenith 去皮种子处理后愈伤诱导率最高达 74.
67%,未去皮的则为66. 5% ; Qingdao 4℃浸泡3 d愈伤
诱导率达45. 5% ,未去皮的浸泡 14 d后为30. 50%。未
去皮与去皮的愈伤诱导率有差异;而浸泡时间过长也
收稿日期: 2004-09-07; 修回日期: 2004-11-24
基金项目:国家高技术发展计划( 863计划)项目( 2001AA244082)
作者简介:齐春辉( 1977-) ,女,博士研究生,主要从事草坪生物技术研究; * 通讯作者 Author for cor resp on dence, E-m ail : han lb@ 163. net
第 13卷　第 3期
　Vo l. 13　　No. 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　2005年　 9 月
　Sept. 　　2005

会降低种子活力, 从而影响愈伤诱导率(图 1)。
图 1　4℃浸泡处理对成熟种子愈伤诱导率的影呼
Fig . 1　Effect of 4℃ imbibing on seed callus indnclion r ate
2. 2　基因型对愈伤诱导的影响
　　Qingdao 和 Zenith 的种子经同样处理后接种于
MS+ 2, 4-D 5 mg/ L 培养基中。在愈伤诱导率与胚性
愈伤率方面, Zenith都明显好于 Qingdao (表 1)。
2. 3　2, 4-D对愈伤诱导的影响
2, 4-D 在 2 mg/ L 浓度下愈伤诱导率最高,
‘Zenith’为 76. 60% ,‘Qingdao’为 45. 97% ,并随着 2,
4-D 浓度的升高,愈伤诱导率下降。2, 4-D也影响愈伤
的状态,在 2 mg / L 浓度下愈伤易长出无成苗能力根状
物, 在8 mg / L 浓度下愈伤则趋向于水渍状, 在5 mg / L
浓度下 2 个品种胚性愈伤率达到最高, 分别为 2. 68%
和1. 12% (表 2)。一旦愈伤形成,即第1次继代时将 2,
4-D浓度降至 2 mg/ L 将有利于胚性愈伤的形成, 而继
续维持在5 mg / L 浓度时常出现愈伤含水量过大现象。
表 1　基因型对愈伤诱导的影响
Table 1　Effect of g enotype on callus induct ion
品种
Cult ivars
接种种子数
No. of s eeds
愈伤数
No. of cal lus
愈伤诱导率( % )
Cal lus ind uct ion rate
胚性愈伤数
No. of embryogen ic callu s
胚性愈伤率( % )
Em bryogen ic callus in duct ion rate
Zenith 150 112 74. 67 3 2. 68
Qingdao 199 89 44. 68 1 1. 12
表 2　2, 4-D对愈伤诱导的影响
T able 2　Effect o f 2, 4-D on callus induction
‘Zenith’
2, 4-D 浓度( mg/ L) 2, 4-D concent rat ion
2 5 8
‘Qingdao’
2, 4-D浓度( mg/ L ) 2, 4-D concent ration
2 5 8
接种种子数 No. of seeds 201 150 160 200 199 198
愈伤数 No. of callus 154 112 113 92 89 86
愈伤诱导率( % ) Callus in duct ion rate ( %) 76. 60 74. 67 70. 63 45. 97 44. 68 43. 51
胚性愈伤数 No. of embr yog enic cal lus 4 3 2 1 1 0
胚性愈伤率( % ) Embryogenic callus induct ion rate ( % ) 2. 60 2. 68 1. 77 1. 09 1. 12 0
表 3　KT和 6BA 对愈伤诱导的影响
Table 3　Effect o f KT and 6BA on callus induction
品种
Cul t ivar
KT 浓度( mg/ ml )
Concent rat ion
接种数
No. of seed s
愈伤数
No. of callu s
愈伤诱导率( % )
Cal lus indu ct ion r ate
胚性愈伤数
No. of emb ryogenic cal lus
胚性愈伤率(% )
Em bryogenic cal lus in duct ion rate
KT
Zenith 0 150 112 74. 67 3 2. 68
0. 01 200 145 72. 50 2 1. 38
0. 05 200 151 75. 50 9 5. 96
0. 1 160 110 68. 75 5 4. 55
0. 2 200 140 70. 00 12 8. 57
0. 5 199 133 66. 50 5 3. 75
0 89 44. 68 1 1. 12
Qing-
dao
0. 01 200 107 53. 50 1 0. 93
0. 05 194 103 51. 90 3 2. 91
0. 1 200 114 57. 00 3 2. 63
0. 2 200 89 44. 50 3 3. 37
0. 5 200 99 49. 50 1 1. 01
6BA
Zenith 0 150 112 74. 67 3 2. 68
0. 01 200 143 71. 50 4 2. 73
0. 05 200 134 67. 00 13 9. 7
0. 1 200 125 62. 50 7 5. 6
0. 2 200 121 60. 50 3 2. 45
0. 5 200 121 60. 50 2 1. 65
Qing-
dao
0 199 89 44. 68 1 1. 12
0. 01 200 102 51. 00 1 0. 98
0. 05 194 86 44. 33 1 1. 16
0. 1 200 90 45. 00 2 2. 22
0. 2 200 85 42. 50 2 2. 35
0. 5 200 92 46. 00 1 1. 08
258 草　地　学　报 第 13卷
2. 4　细胞分裂素对愈伤诱导的影响
低浓度的细胞分裂素可提高胚性愈伤率(表 3)。
Zenith 在附加 0. 2 mg / L KT 或 0. 05 mg / L 6-BA 时
胚性愈伤率最高,分别为 8. 57%和 9. 7% ; Qingdao 在
0. 2 mg / LKT 或 0. 2 mg / L6-BA 时胚性愈伤率最高,
分别为 3. 37%和 2. 35%。但实验中也发现, 随着 KT
或 6-BA 浓度的提高,胚性愈伤率反而下降, 而浓度过
高( 0. 5 mg / L )会导致愈伤褐化甚至死亡, 6-BA 在这
方面的负作用比同等浓度 KT 明显。
2. 5　CuSO4·5H2O对愈伤诱导的影响
CuSO 4·5H2O 可提高结缕草愈伤诱导率和胚性
愈伤率(表 4) , ‘Zenith’和‘Qingdao’在浓度为 1. 25
mg / L 时愈伤诱导率和胚性愈伤率最高, ‘Zenith’分别
为 79. 25%和 3. 85% , ‘Qingdao’分别为 56. 28%和
3. 57%。但当浓度达到 5 mg / L 时易出现白色坚硬的
愈伤组织,有时甚至有黑色斑块出现,影响愈伤质量。
2. 6　不同培养基对植株再生的影响
选择胚性愈伤组织转接入不同再生培养基中, 7 d
后愈伤出现绿色芽点, 并逐渐分化为小植株。各培养基
中成苗率差异不大(表 5) , 说明植株的再生是由愈伤
状态决定。植株炼苗后移栽土壤中,成活率达87. 5%。
表 4　Cu2+ 浓度对愈伤诱导的影响
Table 4　Effect of Cu2+ concentr ation on ca llus induct ion
‘Zenith’
C u2+ 浓度( mg/ L) Cu 2+ concent ration (m g/ L)
0. 025 1. 25 2. 5 5
‘Qingdao’
C u2+ 浓度( mg/ L) Cu 2+ concent ration (m g/ L)
0. 025 1. 25 2. 5 5
接种种子数 No. of seeds 201 164 121 160 200 199 197 160
愈伤数 No. of callus 154 130 85 117 92 112 102 70
愈伤诱导率( % ) Callus in duct ion rate 76. 60 79. 25 70. 25 73. 13 45. 97 56. 28 51. 78 43. 75
胚性愈伤数 No. of E. C. 4 5 2 2 1 4 3 1
胚性愈伤率( % ) Rate of E. C. 2. 60 3. 85 2. 35 1. 71 1. 09 3. 57 2. 94 1. 42
表 5　不同培养基对植株再生的影响
Table 5　Effect o f culture medium on plant reg ener ation
培养基
M edium
‘Zenith’
接种愈伤数
No . of callus
成苗愈伤
No . o f reg enerat ing callus
再生率( %)
Regenerat ion rate( % )
Qingdao
接种愈伤数
No . o f callus
成苗愈伤
No. of regenerating callus
再生率(% )
Regeneration rat e(% )
M S 120 49 40. 83 120 37 30. 83
1/ 2MS+ KT0. 2 mg / L 120 54 45. 00 120 40 33. 33
M S+ BA0. 2 mg / L 120 52 43. 33 120 35 29. 17
M S+ BA0. 1 mg / L +
NA A0. 05 mg/ L
120 46 38. 33 120 33 27. 5
3　讨　论
3. 1　日本结缕草组培中首先遇到的是除去种子外皮
障碍问题。研究中采用 4℃浸泡方法,经重复实验证明
是可行的。水分浸泡使种子外壳软化,不再阻碍发芽,
从而提高愈伤诱导率。而经长时间浸泡,种子处于无氧
呼吸状态,则影响种子活力,导致愈伤诱导率下降。
3. 2　日本结缕草品种间组培离体培养反应能力存在
差异。在所有实验中, Zenith 均好于 Qingdao ,说明基
因型是一个决定因素, 在遗传转化试验中, 可通过选择
表现好的基因型来提高转化效率。
3. 3　激素的协同作用有利于草地早熟禾、多年生黑麦
草愈伤组织质量的提高 [ 5, 6] , 日本结缕草组培也需要生
长素与细胞分裂素的协同作用。铜离子有助于结缕草
愈伤诱导率与胚性愈伤率的提高,但浓度高于 5 mg / L
则会产生不良影响。
3. 4　胚性愈伤组织的挑选与继代是重要环节。每次继
代时, 仔细选择白色或黄色、颗粒状、结构致密而相互
间松散的胚性愈伤组织继代, 并注意去除含水量大的
非胚性愈伤组织。试验观察到胚性愈伤组织的再生多
为体细胞胚发生途径, 与胚性愈伤的挑选有紧密联系。
而再生培养基中 1/ 2M S+ KT 0. 2 mg / L 的选择符合
体细胞胚的生长规律, 有利于芽和根的同时发育。
参考文献
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259第 3期 齐春辉等:日本结缕草胚性愈伤诱导与植株再生