全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2003) 03-0219-04
多年生黑麦草组织培养与植株再生研究
张万军, 王　涛*
(中国农业大学农业与生物技术国家重点实验室, 北京 100094)
摘要: 对多年生黑麦草种子为外植体的植株再生过程进行系统研究, 结果表明,在改良的 MS 培养基( MSM ) , 以
MS 无机盐+ 9. 9 mg / L 维生素 B1+ 9. 5 mg/ L 维生素 B6+ 4. 5 mg / L 尼克酸+ 1 mg / L CH+ 30 g / L 蔗糖+ 琼脂 8 g /
L 为基本成分, 附加 5 mg / L 2, 4-D 和 0. 05 mg / L KT 时,适合种子的愈伤组织诱导; 继代培养基附加2 mg / L 2, 4-
D 和 0. 1 mg / L KT ; 分化培养基附加 1 mg / L 2, 4-D 和 1 mg / L KT ; 生根培养基为无激素的 MS 培养基。完成植株
再生约需 12 周, 愈伤组织分化率为 70%。
关键词: 生物技术; 多年生黑麦草; 组织培养; 再生
中图分类号: G943. 1　　文献标识码: A
A Study on the Tissue Culture and Plant Regeneration of Perennial Ryegrass
ZHANG Wan-jun, WANG T ao
( Nat ional Laboratory for Agricu lture and Biotechn ology, Ch ina Agriculture U nivers ity, Beijing, China 100094)
Abstract: A sy stemic study o f plant reg enerat ion of perennial ryegrass has been conducted. T he result
show ed the modif ied M S medium ( M SM) that composed of M S salt + 9. 9 mg / L vitam in B1+ 9. 5 mg/ L vi-
tam in B6+ 4. 5 mg/ L nico tinic acid+ 1 mg/ L hydro lyze casine+ 30 g / L sucrose+ 8 g / L agar as basic medi-
um was suitable for inducing callus format ion fr om ryeg rass seeds w hen 5 mg / L 2, 4-D and 0. 05 mg / L KT
added. T he subculture medium containing 2 mg/ L 2, 4-D and 0. 1 mg/ L KT. T he medium for callus dif fer-
ent iat ion into plant lets containing 1 mg / L 2, 4-D and 1 mg/ L KT . T he medium fo r regenerated plant lets
roo ting w as basic M S medium free of ho rmone. T he whole period of ryegr ass plant regenerat ion takes
about 12 weeks. T he different iation ratio of calli reached 70% .
Key words : Bio technolog y; Perennial r yegrass; T issue cultur e; Plant regener at ion
　　多年生黑麦草( L ol ium perenne L. )是世界范围
内一种重要的冷季型禾草, 它用途广泛,既可以做草
坪草,公路护坡的常用草种 [ 1] , 也是我国长江中下游
及其以南地区重要的禾本科饲草[ 2]。由于高度自交
不育,用传统的方法进行黑麦草育种, 进展一直很
慢[ 1]。生物技术的兴起为黑麦草的育种提供了一条
新路。早在 1975年, Dale[ 3]就对黑麦草的分生组织
进行了组织培养研究。1981年, Dale[ 4]又报道了黑
麦草幼穗和茎节的组织培养。1988年, Dal ton[ 5]报
道了高羊茅和黑麦草的细胞悬浮培养, 至此, 黑麦草
的生物技术育种的研究正式展开。1995年, Spangen-
berg
[ 6]等人首先用基因枪转化法得到黑麦草转基因
植株。但就国内而言,利用生物技术对黑麦草进行遗
传改良方面的研究很少。为此, 有必要对黑麦草的组
织培养进行系统的研究,以便利用生物技术对黑麦草
进行遗传改良,加快我国草业发展的步伐。
1　材料和方法
1. 1　材料
　　本试验以多年生黑麦草的成熟种子为外植体。
收稿日期: 2002-12-10;修回日期: 2003-04-25
作者简介: 张万军( 1976-) ,男,内蒙古凉城县人,硕士; * 王涛,研究员,为本文通讯作者,主要从事植物基因工程研究, Email : cauw an gtao
@ vip. s ina, com
第 11卷　第 3期
　Vo l. 11　　No. 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2003 年　9月
　Sept. 　2003
1. 2　方法
选取多年生黑麦草成熟饱满的种子, 用 70%的
酒精消毒3 m in 后, 用0. 1%( w / v )的氯化汞消毒10
min,无菌水冲洗 4次。在无菌的条件下, 将种子接
种到含有不同激素组成的 MSM 培养基上,置于黑
暗处, 在 25℃环境下培养。每一处理接种 50粒,设
置 3 个重复。待愈伤组织长到米粒大小时, 将其剥
离,转到继代培养基上培养。30 d后,统计愈伤诱导
率并记录愈伤生长状态。愈伤组织长到半粒黄豆大
小时,进行分化培养,每一处理接种 50块愈伤组织,
设置 3个重复。30 d后统计有芽分化的愈伤组织比
率。各阶段所用培养基 pH 值均为 5. 8。愈伤继代时
开始光照, 培养物表面光照强度约 3000 Lux, 光照
周期为 14 h/ d。
1. 3　数据处理
愈伤诱导率= 愈伤形成的种子数/接种种子总
数×100%
愈伤分化率= 有芽形成的愈伤组织数/接种的
总愈伤组织数×100%
2　结果与分析
2. 1　愈伤组织的诱导与保持
本试验以 MSM 培养基为基本成分, 在不同的
2, 4-D 和 KT 配比下研究激素配比对多年生黑麦草
种子愈伤组织形成的影响。见表 1。
表 1　2, 4-D 和 KT不同浓度对种子愈伤组织诱导的影响
T able 1　Effect of differ ent concentr ations combining w it h 2, 4-D and KT on callus induce of seeds
处理
T reatment
激素组成
C omponen ts of hormone
出愈率( % )
C allus ratio
愈伤状态
State of callus
1 2 m g/ L 2, 4-D+ 0. 05 m g/ L KT 27e 乳白色,团状 Milk wh ite, clump, about 2mm c)
2 3 m g/ L 2, 4-D+ 0. 05 m g/ L KT 56d 乳白色,团状 Milk wh ite, clump, about 3mm bc
3 4 m g/ L 2, 4-D+ 0. 05 m g/ L KT 72c 乳白色,团状 Milk wh ite, clump, about 4mm ab
4 5 m g/ L 2, 4-D+ 0. 05 m g/ L KT 96a 乳白色,团状 Milk wh ite, clump, about 5mm a
5 6 m g/ L 2, 4-D+ 0. 2 m g/ L KT 78b 乳白色,团状 Milk wh ite, clump, about 2mm c
6 8 m g/ L 2, 4-D+ 0. 2 m g/ L KT 79b 乳白色,团状 Milk wh ite, clump, about 2mm c
7 10 m g/ L 2, 4-D+ 0. 2 m g/ L KT 68c 乳白色,团状 Milk wh ite, clump , ab ou t 3mm bc
8 6 m g/ L 2, 4-D+ 0. 5 m g/ L KT 12f 乳白色,颗粒状 Milk wh ite, grainy, ab out 2mm c
　　注: ( 1)表中数据是三个重复的平均值,方差分析用的是 LSR 法,显著性水平P= 0. 05
Each value in the table is th e average of th ree repl icat ions, the meth od used in variance analys is is leas t signif icant range, the s ignif i-
can ce level P= 0. 05
( 2)各数据为愈伤组织在愈伤诱导培养基上生长 30 d 的直径平均大小
Each value in th e table is the average siz e of call i on the callus inducing medium
　　表 1的结果说明, 在供试处理中种子诱导愈伤
组织以附加 5 mg / L 2, 4-D和 0. 05 mg/ L KT 为宜。
处理 4与其它处理在愈伤诱导频率之间差异显著,
另外,愈伤生长量也最大(图 1a)。在 KT 浓度为 0.
05 mg/ L 的各处理中, 2, 4-D 浓度在低于 5 mg / L
的范围内,种子愈伤组织的诱导率和愈伤组织的生
长量随着 2, 4-D浓度的增加而呈升高趋势, 并且处
理间差异显著。在 KT 浓度为 0. 2 mg/ L 下的各处
理中, 愈伤组织的诱导率和生长量均于 0. 05 mg / L
KT 下各处理间差异显著。处理 5的 6 mg/ L 2, 4-D
浓度下和处理6的8 mg/ L 2, 4-D浓度下相比, 虽有
2, 4-D 浓度的升高,但处理 5 与处理 6之间种子愈
伤组织的诱导率差异不显著, 而它们均与 10 mg/ L
2, 4-D 浓度下的处理 7间和差异显著。KT 浓度为
0. 5 mg/ L 的处理 8与其它各处理间的差异显著, 愈
伤生长量与其它各处理间差异显著。
2. 2　植株的分化
选择色泽鲜亮、块状的愈伤组织置于不同浓度
2, 4-D、KT 和蔗糖组合的培养基上,研究不同组合
下对黑麦草愈伤组织分化的影响。结果见表 2。
220 草　地　学　报 第 11卷
表 2　不同浓度 2, 4-D、KT、蔗糖组合对愈伤分化的影响
T able 2　Comparison of per ennial r yeg rass callus differ etiation under different concentr ations
o f 2, 4-D, KT combining w ith sucro se
处理
T reatment
愈伤分化率( % )
T he dif ferent iation of cal lus ( % )
再生植株状况
T he state of the regen erated shoots
1 MSO+ 0. 5 mg/ L 2, 4-D+ 1 mg/ L KT + 3% sucrose 15d 苗丛生,正常 Clu ster of s hoots per callus, normal
2 MSO+ 1 mg/ L 2, 4-D+ 1 mg/ L KT + 2% sucros e 43b 苗少,白化 Few sh oot per callus, albin o
3 MSO+ 1 mg/ L 2, 4-D+ 1 mg/ L KT + 3% sucros e 70a 苗丛生,正常 Clus ter of s hoots per callus, n or mal
4 MSO+ 3% su crose 28c 苗少,白化 Few sh oot per callus, normal
5 MSO+ 2 mg/ L KT + 2% su crose 0e
6 MSO+ 0. 5 mg/ L 2, 4-D+ 3% su crose 0e
　　注:表中数据是三个重复的平均值,方差分析用的是 LSR 法,显著性水平 P= 0. 05
Each value in the table is th e averag e of three replicat ions, the method used in var iance analysis is least signif icant range, the s ignif i-
cance level P= 0. 05
　　表 2的结果表明, 所试处理组合中,处理 2较适
宜于黑麦草的愈伤组织分化, 愈伤分化率与其它处
理间差异显著。从表中可以看出,蔗糖在黑麦草植株
分化中起了重要的调节作用。处理 2和 3相比, 处理
3的蔗糖浓度高, 相应的处理 3上愈伤组织的分化
率显著高于在处理 2上的分化率, 且再生芽的生长
状态正常,没有白化苗形成。在诱导黑麦草愈伤分化
中 2, 4-D 和 KT 呈协同效应, 所试的培养基组合 5
和 6中,单独使用 2, 4-D 和 KT 都未能诱导黑麦草
愈伤组织的分化。并且,愈伤组织在处理 5和处理6
上很快褐化死亡, 而在处理 4 中, 愈伤组织色泽鲜
亮,分化形成的苗都比较健壮, 同时还有根的发生
(图 1b)。
2. 3　再生植株的生根和移栽
在不含激素的 MS 培养基上,黑麦草再生植株
2周左右就可以形成长约 5cm 的根。这时即可进行
移栽。首先,去掉封口膜,在培养间炼苗 5～7 d。然
后,在自来水下冲洗干净再生植株根部所带的培养
基,移栽到灭菌的泥土和蛭石( 1∶1)的花盆中。在相
对湿度 60%的环境下,黑麦草的移栽成活率可以保
持在 95%以上(图 1c)。
3　讨论
3. 1激素的协同效应
在黑麦草的组织培养过程中, 激素的作用表现
出明显的协同效应。在愈伤组织诱导中, KT 浓度
在 0. 05～0. 2 mg / L、2, 4-D 浓度为 5 mg / L ,可以促
进黑麦草愈伤组织的形成并使愈伤组织保持团状、
乳白色的状态; 而 KT 浓度高于 0. 2 mg / L 时愈伤
组织就会呈松散的颗粒状,不利于愈伤组织的分化,
分化形成的再生苗白化现象也比较严重。并且,随着
2, 4-D 浓度的升高,黑麦草种子愈伤诱导率和愈伤
形成速度也呈一定程度的正相关。但是, 2, 4-D浓度
高于 5 mg / L 的处理中, 诱导形成的愈伤组织表面
会很快形成一些毛状根, 且随着 2, 4-D 浓度的增加
而毛状根出现的速度和毛状根的发生量相应也加
快,而最终失去愈伤组织的形态。即使在愈伤诱导率较
高,愈伤组织生长形态好的处理 4的培养基上,培养时
间超过30 d 后, 愈伤组织表面也开始形成毛状根。可
见, 2, 4-D浓度高是黑麦草愈伤组织表面形成毛状根
的主要原因。设计继代培养基,降低培养基中2, 4-D浓
度到2 mg/ L , 同时增加 KT 浓度到0. 1 mg / L KT 继
代愈伤组织后, 发现愈伤诱导培养基上形成的愈伤组
织生长旺盛, 色泽鲜亮,同时还有丛生芽的形成。在愈
伤组织分化试验中, 单独使用 2, 4-D 和KT 的处理中
愈伤组织未能分化成芽,而没有激素的培养基上却有
芽的形成, 可见合理地调节生长素和细胞分裂素的浓
度和比例是黑麦草愈伤组织分化、成苗的关键。
3. 2　蔗糖的作用
蔗糖在植物的组织培养中的一般功能是作为碳
源和调节培养基的渗透压。在本实验研究中发现蔗
糖在黑麦草的分化中起着重要的调节作用, 低于
3%的蔗糖不利于黑麦草的分化, 但其机理还不清
楚,这有待于进一步的研究。
3. 3　体细胞胚诱导
体细胞胚发生途径是组织培养中较为理想的分
221第 3期 张万军等:多年生黑麦草组织培养与植株再生研究
化途径。因为,这样形成的植株多为单细胞起源,在
遗传上较为均一。黑麦草的愈伤组织分化途径既有
器官发生型也有体细胞胚发生型。器官发生型是先
长芽,再在生根培养基上生根,而后完成植株再生过
程;而体细胞胚发生型表现为根和芽的同时生长,这
样可以省去生根培养的步骤, 节约时间。本研究发
现,在愈伤继代中适当调高细胞分裂素的比例,以及
干燥处理等方法可以使体细胞胚发生比例增加, 进
而提高植株再生频率。
图 1　多年生黑麦草植株再生过程
F ig . 1　Pictur es showing perennial ry egr ass during the cour se o f plant r egener ation
a: 在继代培养基上愈伤组织的生长状态
T he state of callus of perenn ial ryegras s on th e subculture medium
b: 在分化培养基上愈伤组织分化形成丛生芽,同时有根形成
Clus ter of sh oots have formed f rom perennial ryegrass cal lus on the dif ferent iat ion medium and h ad roots d eveloped, at the s ame t ime
c: 再生苗移栽到花盆中的生长状态
Th e state of perennial ryeg ras s regener at ion plants af ter being tr ansplanted to a f low erpot
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222 草　地　学　报 第 11卷