全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 03-0199-05
菊苣再生体系建立及转 AFL2基因的研究*
程林梅1 ,曹秋芬1,高洪文2* ,黄　静1 , 孟玉平1
( 1 山西省农业生物技术研究中心 太原 030031; 2 中国农业科学院草业研究中心 北京, 100081)
摘要:以菊苣叶片为外植体, 研究建立高效再生体系和农杆菌介导的稳定转化体系。结果表明: 再生频率从48%提
高至100% ; 单叶盘再生芽数达12个; 试管苗叶片与农杆菌菌株 PIG 121 Hm 共培养3 d, 在附加卡那霉素20 mg/ L
和头孢霉素600 mg / L 再生培养基上选择培养2周后,叶片再生出转化芽, 绿芽率达8. 6% , 转化芽在附加30 mg/ L
卡那霉素培养基中长大并继代增殖,初步鉴定是转化芽。
关键词:生物技术; 菊苣; 再生; AFL2基因; 遗传转化
中图分类号: Q943　　　文献标识码 : A
Study on the Efficient Systems for Regeneration and AFL2 Gene
Transformation of Puna Chicory ( Cichorium Intybus. L)
CHENG Lin-mei
1
, CAO Qiu-fen
1*
, GAO Hong-w en
2*
, HU ANG Jing
1
, M ENG Yu-pin
1
( 1. Shanx i Ag ri-Biot echnolg y Resear ch Center , T aiyuan, Shanx i P ro vince 030031, China;
2. Research and Development Center for G rassland Science , China Academy o f Agr icult ur e Sciences, Beijing , 10081, China)
Abstract: A research w as conducted using leaves o f Puna chicory as explants to establish a highly ef ficient Puna
chico ry r eg eneration system and its stable ag robacter ium mediated t ransformat ion sy stem. The result shows
that the chicory reg enerat ing frequency w as increased from 48% to 100%, while the number of regenerat ing
single leaf buds appearing as many as 12. Af ter three days of culturing the chicory leaf seedlings w ith ag robac-
terium strain FIG 121 Hm, and tw o w eeks in regener ate medium containing 20 mg / L kanmycin and 600 mg / L
cephalosorine, the chicory leaf seedling s regenerated into tr ansgenic buds, w ith the regenerat ing rate reaching
8. 3%. T he buds could develop in a medium of 30 mg/ L kanamycin and repr oduce successively, w hich is tenta-
tiv ely determined to be transgenic buds.
Key words: Bio technolog y; Cichorium inty bus L. cv . Puna; P lant regenerat ion; AFL2 gene; Genet ic t ransfor-
mat ion
　　菊苣( Cichorium inty bus L. )为菊科菊苣属多年生
草本植物,广泛分布于亚洲、欧洲、美洲及大洋洲,在我
国分布于东北、西北及华北地区, 常见于山区、田边及
荒地, 深秋蓝色的花冠具有一定的观赏价值 [ 1, 2]。菊苣
不仅是高产优质的饲用作物, 而且其根系含有丰富的
菊糖和芳香族物质,可提制代用咖啡,根中提取的苦味
物质可提高消化器官的活动能力。菊苣具有饲用、药
用、食用和观赏等多方面的开发潜力,因而倍受国内外
学者的重视[ 3, 4]。但采用基因工程技术对菊苣进行遗传
改良等方面的研究,目前报道较少[ 5～8]。鉴于组培苗具
有取材方便、生理状态比较均匀、便于保存和携带方便
等诸多优点, 本文以菊苣的叶片为外植体, 筛选出了适
合遗传转化的再生体系,从而建立起一套高效稳定的
离体再生和遗传转化体系, 为进一步利用基因工程技
术对菊苣进行遗传改良打下基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
采用新西兰引进的菊苣品种——普那( Cichorium
inty bus L. cv. Puna)
[ 1. 2]。
1. 2　培养基
　　收稿日期: 2003-09-10;修回日期: 2003-12-25
　　基金项目:国家“863”计划( 2001AA241165) ;山西省留学回国人员资助项目( 20011575)
　　作者简介:程林梅( 1954-) ,女,山西人,副研究员,主要从事作物抗旱生理、生物技术方面的研究; * 通讯作者 Author for corresponden ce
　　致谢:本研究所用农杆菌和质粒由日本国农业技术研究机构果树研究所苹果研究部主任研究员和田雅人赠送,谨此致谢
第12卷　第3期
　Vo l. 12　　No. 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2004年　9月
　Sept. 　2004
1. 2. 1　再生培养基　MS+ BA 1. 5 mg / L+ IBA 0. 3
mg / L
1. 2. 2　继代培养基　MS+ BA 1 mg / L+ IBA 0. 1
mg / L
1. 2. 3　生根培养基　1/ 2 MS+ NAA 0. 1 mg / L
上述再生培养基和继代培养基蔗糖均为3% ,生根
培养基为2% , pH= 5. 8,琼脂0. 6%。
1. 3　培养方法
1. 3. 1　2001年6月以菊苣叶片和茎段为外植体, 先用
洗洁净漂洗3 min 后, 用自来水冲洗3次, 用75%酒精
灭菌2 min, 0. 1% HgCl2灭菌10 min 后,用无菌水冲洗
4～6次。
1. 3. 2　将叶片和茎段切成5～8 mm 小块, 接种到置
于9 cm 培养皿的再生培养基,每个培养皿放20块, 待
分化成植株后,接到继代培养基上以单株方式增殖继
代,在继代10 d的试管苗上取健壮的叶片和茎段作为
再生和转化的外植体。培养期间温度控制在20～26℃,
每天光照12 h,光强度3000 lx。
1. 4　遗传转化
以农杆菌 ( A gr obacterium tumef aciens ) 菌株为
GV1301,携带的质粒为 PIG 121 Hm , 均带有对卡那霉
素和潮霉素有抗性的基因。成花基因 AFL2[ 9]的 cDNA
在CaMV35S 启动子下,以有义( sense)方向插入。
选用 Horsch 等( 1985)建立农杆菌与叶盘共培养
法进行转化[ 10]。
1. 4. 1　挑取农杆菌菌落接种于含卡那霉素50 mg / L
YEB液体培养基中,在28℃下振荡培养,第3 d 把培养
的农杆菌用 YEB培养液洗2次后,用培养植物的液体
培养基在28℃条件下悬浮培养3～5 h, 农杆菌菌液
OD600值应达到0. 5, 浸染事先预培养3 d后的菊苣叶
片,叶片在菌液中浸泡3 m in,立即将菌液吸出。
1. 4. 2　用无菌滤纸吸干叶片上多余的菌液,放在再生
培养基上 MS+ BA 1. 5 mg/ L + IBA 0. 3 mg / L 共培
养3 d后, 转到附加卡那霉素10 mg/ L 与头孢霉素600
mg / L 的再生培养基上培养一周后, 转到头孢霉素不
变,卡那霉素增加到20 mg / L 的培养基上继续培养一
周,筛选出不定芽,在附加卡那霉素30 mg / L 继代
培养基上继续筛选并增殖, 待不定芽长大后取叶片培
养于附加卡那霉素20 mg/ L 再生培养基上观察转化植
株的再生情况,可作为转化芽的早期鉴定。
1. 5　统计分析
1. 5. 1　未经转化的外植体在再生培养基上培养30 d,
调查外植体再生不定芽数, 计算再生频率(再生不定芽
外植体数/调查外植体数×100% )
1. 5. 2　经转化的外植体在附加卡那霉素和头孢霉素
再生培养基上培养30 d 后, 调查转化芽再生不定芽
数,计算转化芽再生频率(再生转化芽外植体数/调查
外植体数×100% [ 11]。) (也就是绿芽转化率)
1. 6　PCR 检测
取抗卡那霉素植株的叶片0. 1 g 用 CTAB-based
方法[ 12. 13]提取 DNA, 并以此DNA 为模板,用 AFL2的
的特异性引物上游 AFLF( 5-GTGGAAATA TGG-
AT CCAT GCC-3 )和下游引物 AFL2R( 5-T CAAAC-
TCT CTCT GCAGAACTGGC-3 )进行 PCR 扩增。反
应条件为95℃ 10 min 变性, 94℃ 1 min, 56. 5℃ 1
min, 72℃ 2 m in 循环30次; 反应所用的 T aq DNA 聚
合酶和 dNTP 购自上海生工生物工程技术服务有限
公司。
2　结果与分析
2. 1　外植体对愈伤组织的影响
在叶片、茎段、花蕾和花瓣的愈伤组织诱导中, 由
MS+ BA 1. 5 mg / L + IBA 0. 5 mg / L , M S + BA 2. 5
mg / L+ IBA 0. 3 mg / L 和 MS+ BA 1. 5 mg / L+ IBA
0. 1 mg/ L ; 三种培养基激素浓度的配比都可以诱导出
愈伤组织,诱导率为100%。在接种7 d 后, 叶片和茎段
伤口边缘开始出现淡黄色的愈伤组织,呈球状、绿豆大
小,非常致密;花蕾愈伤组织形成较慢, 12 d以后才开
始出现;花瓣最慢, 15 d 以后才逐渐形成。四种外植体
在 MS+ BA 1. 5 mg/ L + IBA 0. 1～0. 5 mg / L 范围内
都可以诱导出愈伤组织,但诱导率各异(表1)。叶片、茎
段和花蕾诱导愈伤组织形成时间早、诱导率高, 而花瓣
则较差。
表1　不同外植体对芽再生频率的影响
Table 1　Effect of explants on r egener ation rat e o f chicor y
外植体(块)
E xplant
接种数(块)
Number of
inocu lated explants
愈伤组织数(块)
No. of
callus es
出愈率( % )
Rate of cal lus
formation
不定芽数(个)
No. of
advent it ious bud
再生频率( % )
Reg enerat ion
percentage
叶片 Leaf 80 80 100 960 100
茎段 Stem 80 80 100 482 100
花蕾 Flow er bud 80 80 100 68 20
花瓣 Petal 80 22 27. 5 0 0
200 草　地　学　报 第12卷
2. 2　外植体对再生芽的影响
四种外植体在三种激素浓度的培养基上都可以诱
导出愈伤组织, 但愈伤组织分化芽的能力差异较大。
其中叶片、茎段和花蕾在 MS+ BA 1. 5 mg / L + IBA
0. 3 mg / L培养基上诱导形成的愈伤组织分化不定芽
的能力较强(图1) , 叶片在愈伤组织形成7 d后分化出
不定芽,不定芽像针尖一样, 密密麻麻, 每块愈伤有5～6
个芽, 最多的可达12个芽,平均成芽数可达10个;花蕾次
之, 只有个别愈伤组织长芽; 花瓣则不能分化, 20 d后逐
渐死亡。叶片、茎段在 MS+ BA 1. 5 mg/ L + IBA 0. 3
mg / L 再生培养基上可以稳定, 高频率地再生植株(表
1) ,再生植株在1/ 2 MS + NAA 0. 1 mg / L 生根培养基
上1周后长根, 3周后即可以移栽(图2)。
图1　叶片高频率植株再生(不含卡那霉素的再生培养基)
F ig 1　High frequency regener ation of chico ry leaves
in a medium w ithout kanamycin
2. 3　卡那霉素与头孢霉素对叶片再生的影响
卡那霉素和头孢霉素对植株再生有很大的抑制作
用[ 14 . 15] , 而适量者则是获得抗性芽的关键一步, 如卡
那霉素浓度过高, 对转化细胞造成强烈毒害作用,致使
大量的外植体在选择培养基上很快死亡,而浓度过低,
对抗性芽不能进行严格的筛选,将产生假抗性芽及大
量的嵌合体; 同样头孢霉素过高或过低,均不能恰当控
制农杆菌生长,不能有效得到抗性芽。当再生培养基不
含卡那霉素时, 再生频率达100% ,附加卡那霉素为10
mg / L 时,抗性再生芽的频率减低到50%以下;当附加
20 mg/ L 时, 叶片再生能力受到一定的抑制,但叶片仍
在一定时间内保持绿色并澎大,且部分叶片能形成愈
伤组织,有个别长芽,但芽不能长大, 逐渐出现白化而
死亡(表2) ; 在附加30 mg / L 时,叶片再生能力受到相
当的抑制,几乎不能形成愈伤组织及芽,三周内变白;
在附加40 mg/ L 的卡那霉素导致叶色迅速变白而死
亡,结果表明,选择30 mg/ L 卡那霉素可作为筛选转化
细胞的极限浓度。
图2　再生植株健壮生长(生根培养基)
F ig 2　Vigor ous g rowt h o f r egenerat ed plant let
in a r oo t-inducing medium
图3　叶片出现白化苗(含20 mg / L 卡那霉素
与600 mg / L 头孢霉素的培养基)
F ig 3　Albino plantlets appear ing in a medium containing
20 mg / L kanam ycin and 600 mg/ L cephalosor ine
　　选择培养基中附加600 mg/ L 头孢霉素时对再生
芽影响较小,低于600 mg/ L, 不能控制农杆菌的生长,
而浓度再增加则会降低再生频率(表2)。同时附加30
mg / L 卡那霉素和600 mg / L 头孢霉素,对菊苣转化体
的筛选是有效的,据此, 笔者选用600 mg/ L 头孢霉素
作为抑制细菌生长的浓度。
2. 4　转化植株的筛选
叶片和茎段在 MS+ BA 1. 5 mg / L+ IBA 0. 3
201第2期 程林梅等:菊苣再生体系建立及转 AFL2基因的研究
mg / L 再生培养基预培养3 d后,与农杆菌感染3 min,
接种到上述培养基上培养3 d,此时茎段已全部长菌并
开始死亡,无法进行转化;叶片转到附加10 mg / L 卡那
霉素和600 mg / L 头孢霉素培养7 d,剪口处出现淡绿
色的抗性愈伤组织, 频率为65% , 12 d 后从愈伤组织
分化出芽,频率为20%, 此时转到头孢霉素不变, 卡那
霉素为20 mg / L 的相同培养基上,再生芽一部分成为
白化苗, 说明有假性抗性芽。白化苗长到2 cm 高时停
止生长, 到30 d 后逐渐死亡。另一部分正常不定芽能
正常生长(图3、4) ,绿芽率达8. 6%。正常的转化芽转到
附加30 mg / L 卡那霉素的 MS+ BA 1 mg / L+ IBA 0.
1 mg / L 继代培养基上继续筛选获得3株转化植株。取
转化植株的叶片培养于附加卡那霉素20 mg / L 再生培
养基上,仍可以高频率地再生,说明转化植株的再生芽
具有卡那霉素的抗性, 初步鉴定为转化植株。
2. 5　PCR 检测
对卡那霉素抗性筛选植株进行 PCR检测结果如
图2所示, 未转化的植株为阴性对照,携带有 AFL2基
因的PIG 121 Hm 质粒为阳性对照,在检测的3株疑
似转基因植株中有2株呈阳性, 1株为阴性, 证明目的基
因 AFL2已经整合到菊苣的基因组中。
图4　转 AFL2基因叶片转化苗与白化苗生长情况
(含20 mg / L 卡那霉素与600 mg/ L 头孢霉素的再生培养基)
F ig 4　T he gr ow th of AFL2 tr ansfo rmed leaves and
contro l a lbino leaves in a medium cont aining 20 mg / L
kanamycin and 600 mg / L cepha lo so rine
表2　卡那霉素和头孢霉素对叶片再生频率的影响
Table 2　Effect o f different concentrat ions of kanamycin and cephalo so rine on transfo rmation fr equency
卡那霉素( mg/ L)
Kanam ycin
出愈率( % )
Rate of callus
format ion
再生频率( % )
Plant
regeneration f req.
头孢霉素= (m g/ L)
Ceph alosorine
出愈率( % )
Rate of callu s
form at ion
再生频率( % )
Plant
regenerat ion f req.
0 100 100 0 100 100
10 78. 2 40. 5 200 100 100
20 16 2. 4 400 100 100
30 1. 2 0 600 96 94. 5
40 0 0 800 89 87. 4
图5　PCR 分析结果
F ig . 5　The result of PCR analy sis
( 1, 2, 3,转基因植株; 4,阴性对照; 5,阳性对照; M ,分子量标记)
( 1, 2, 3, T ran sgenic plant ; 4, Negat ive cont rol ; 5, cont rol; M ,
Marker DNA)
3　讨论
3. 1　本试验成功地进行了菊苣叶片再生芽及遗传转
化系统,使菊苣叶片的再生率达100%。而且叶片从接
种到再生芽只需2周,即使在含有抗生素的再生培养基
中,最多3周就可以分化出再生芽。再生芽在继代培养
基中2周后长大, 转入生根培养基7 d 后生根, 至第3周
可以进行移栽。从叶片到再生植株50～60 d 就可以进
入大田,大大缩短了培养周期,为菊苣的转基因研究奠
定了良好的基础。
3. 2　如何提高转化率,对农杆菌感染外植体的培养条
件做了初步的研究。认为菊苣叶片作为外植体转化效
率主要受几个因素影响:
3. 2. 1　转化受体材料的选择。选择适宜的受体材料及
其状态和感染条件对转化率有较大影响 [ 17]。试验中发
现,尽管菊苣叶片、茎段在再生培养基中可以高频率再
生,但经农杆菌浸染后,茎段几乎在其培养期间就因长
菌而死亡; 而叶片则较好, 可能是因为茎段较叶片细
弱,经不起农杆菌的浸染,在短期内因长菌而死亡,而
202 草　地　学　报 第12卷
无法达到转化目的.改用经生根培养基长大的叶片, 转
化频率大大提高,所以健壮的外植体生理状态对农杆
菌浸染起着至关重要的作用 [ 18]。
3. 2. 2　抗生素浓度　菊苣外植体的卡那霉素极限浓
度为30 mg / L , 但初期不能直接加入30 mg / L 卡那霉
素,如果初期外植体用高浓度卡那霉素筛选,外植体不
但不能产生愈伤组织及不定芽, 而且会很快变白死亡。
笔者采取逐步提高卡那霉素的选择压, 由10 mg / L 提
高到30 mg / L ,有利于严格淘汰一些非转化芽的生长,
又能达到选择的目的。
3. 2. 3　菌液浓度及浸泡时间　农杆菌感染外植体时,
菌液浓度[ 19]和浸泡时间对菊苣转化有一定的影响。菊
苣外植体菌液适宜的浓度为 OD 6000. 5, 浸泡时间3～5
min, 产生愈伤组织及不定芽效率高, 当延长时间至8
min 时,转化效率下降, 说明长时间菌液浸泡对弱小的
外植体产生一定的伤害作用,不利于转化。
3. 2. 4　预培养和共培养的时间　在不进行预培养, 直
接用农杆菌感染叶片, 其再生频率极低,绝大部分叶片
在5 d后腐烂褐化,而在农杆菌浸染之前预培养1 d, 再
生频率明显提高,随着预培养时间的增加再生频率逐
步提高,预培养4 d,再生频率达36% ,结果表明预培养
对外植体的分化是有益的。据报道不同的共培养方式
也会影响转化频率 [ 20]。试验结果表明, 转化频率随着
培养时间的延长而下降,考虑到被感染的组织受伤后
的生理反应, 影响细胞生长分化的内源激素水平等综
合因素。据此笔者认为选用菊苣叶片为外植体, 农杆菌
菌液的浓度为 OD 600= 0. 5, 浸泡时间3～5 min,培养和
预培养时间均为2 d,有利于转化。
参考文献
[ 1]　高洪文. 高产优质饲用植物—菊苣 [ J] . 山西农业科学(增刊) ,
1993, 1～3
[ 2]　高洪文,马明荣, 杨清娥 .菊苣开花及种子形成规律[ J ] . 山西农
业科学(增刊) , 1993, 17～20
[ 3 ]　刘建宁,贺东昌. 北方干旱地区牧草栽培与利用[ M ] . 金盾出版
社, 145～148
[ 4]　王绍明,张霞,刘彤. 菊苣花瓣的组织培养[ J ] . 植物生理学通讯,
2001, 37( 3) : 230
[ 5]　Nenz E, Varottos , lucchin M , Parrin ip. An eff icient and rapid
procedure for plan tlet regenerat ion f rom chicory mesophyl l p rato-
plast s[ J] . Plant Cell T issue and Organ Cul ture, 2000, 62( 1) : 85
～88
[ 6]　Var ot t s , lu cch in M , Parrinip. Immatu re em bryos cul tu re in Ital-
ian r ed ch icory[ J ] . Plan t Cell T is sue and Organ Cul tu re, 2000,
62( 1) : 75～79
[ 7] 　Frulleux F, Weyens G, Jacobs m . Agrobacter ium tum efacien s
med iated t ran sformat ion of shoot buds of chicory [ J] . Plant Cel l
Tis sue and Organ C ulture, 1997, 50( 2) : 107～112
[ 8]　李颖章,韩碧文. 薄层培养的菊苣不定根分化中内源 IAA 和细胞
分裂的动态变化[ J ] . 植物生物学通讯, 1995, 31( 2) : 97～99
[ 9]　Masato Wata, Qiu-fen Cao, Nobuhiro Kotoda, et al. Apple has
two or th ologues of FLORICAU LA/ LEAFY involved in f low ering
[ J] . Plan t Molecu lar Biology, 2002, 49( 6) : 567～577
[ 10 ]　Horsch R B, Fry J E , Hof fmann N L, Eichhol tz D, Rog ers S
G, Fraley R T . A s imple and gener al m ethod for tr ans form ing
genes into plant [ J] . Science, 1985, 227: 1229～1231
[ 11]　张志宏,吴禄平. 草莓主栽品种 TudIa 遗传转化体系的建立[ J] .
农业生物技术学报, 1998, 6( 2) : 200～204
[ 12]　Bousquet T , Simon L, Lalonde M . DNA ampl ificat ion f rom veg-
etative and sexal tis sues of t rees usin g polymerase chain r eact ion
[ J] . Can. J. For. Res , 1990, 20: 254～257
[ 13]　Murray G C, T hompson W F. Rapid isolat ion of high m olecular
w eigh t DNA[ J] . N ucl. Acid Res, 1980, 8: 4321～4325
[ 14]　周冀明,卫志明,许智宏,等. 根癌农杆菌介导转化诸葛菜子叶获
得转基因植株[ J] . 生物工程学报, 1996, 12( 1) : 34～39
[ 15]　Joersbo M , Okk els F T . An ovel principle for select ion of t ran s-
genic plant cell s. Pos itive s elect ion. plant ceu rep , 1996, 16: 219
～221
[ 16]　Neh ra N S, Chibbar R N, Karth a K K, Dat la R S S, C rosby W
L, Stushnof f C. Genet ic t ransformat ion of s t raw berry by a-
grobacterium tumefaciens us ing a leaf di sk regen erat ion system
[ J] . Plant Cell Report s, 1990, 9: 293～298
[ 17]　蓝海燕,陈正华. 农杆菌介导的芸苔属植物遗传转化技术的研究
进展[ J] . 生物技术通报, 1999, ( 3) , 15～18
[ 18]　叶兴国, Shirley Sato, 徐惠君,杜丽璞,等. 小麦农杆菌介导转基
因植株的稳定获得和检测[ J] . 中国农业科学, 2001, 34( 5) : 469
～474
[19] 　黄璐, 卫志明. 农杆菌介导的遗传转化 [ J ] . 实验生物学报,
1999, 5( 32) : 381～387
[ 20]　李洪清,李美茹. 影响农杆菌介导植物基因转化的因素问题[ J] .
植物生理学通讯, 1994, 35: 145～151
203第2期 程林梅等:菊苣再生体系建立及转 AFL2基因的研究