全 文 ：第 18 卷 第 4 期
Vol. 18 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 7 月
Jul. 2010
多年生黑麦草高频丛生芽增殖培养体系的研究
刘 珍1 , 袁庆华1, 2* , 王 瑜2, 王锁民1
( 1. 兰州大学草地农业科技学院, 甘肃 兰州 730000; 2. 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100194)
摘要: 选取多年生黑麦草( L olium Per enne L . )的3 个优良品种: 里加( Regal)、贝尔勒( Belle)、马拉松( Marathon)作
为植物材料,以无菌苗的茎尖为外植体, 对多年生黑麦草丛生芽的诱导、增殖进行研究,以其建立多年生黑麦草丛
生芽高频增殖体系,并在此基础上确定丛生芽离体培养的最适筛选剂及其浓度。结果表明:当 2, 4D 和 6BA 浓度
分别为 0. 5 mg L- 1和 2. 0 mg L- 1时有利于茎尖诱导产生丛生芽; 丛生芽增殖的最适 6BA 浓度为 2. 0 mg
L- 1 ; 继代培养时间过长对丛生芽块的生长不利; 基因型对丛生芽的诱导和增殖有很大影响; 适宜的生根培养基为
1/ 2 MS+ NAA 0. 1 mg L - 1。此外,还确定了丛生芽的最适筛选剂为 G418 和 H yg ,其浓度分别为 150 mg L - 1
和 75 mg L - 1。从而,建立了一种诱导率和增殖率较高并且实验周期短的丛生芽高频增殖培养体系, 并进一步探
讨了建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的必要条件。
关键词:多年生黑麦草; 茎尖;丛生芽; 增殖;筛选剂; 继代培养
中图分类号: S336 文献标识码: A 文章编号: 10070435( 2010) 04057608
Highly Efficient regeneration System for Multiple Shoots in
Perennial Ryegrass
LIU Zhen
1
, YUAN Qinghua1, 2* , WANG Yu2 , WANG Suomin1
( 1. College of Grassland Science and T echnology, L anzhou U niver sity, Lanzh ou , Gan su Provin ce 730000, C hina;
2. Ins titute of An imal S cien ces , CAAS , Beijng 100094 , China)
Abstract: In or der to establish a highly ef f icient reg eneration sy stem of mult iple shoo ts in perennial
Ryegr ass, shoot apices o f sterile seedlings w er e used as explants. The induct ion and proliferat ion of mult i
ple shoots from three cult ivars ( Regal, Bel le and Marathon) o f perennial ryegr ass w ere studied to under
stand essent ial requirements of establishing a t ransformat ion receptor sy stem. Results show ed that:
0. 5 mg L - 1 2, 4D and 2. 0 mg L - 1 6BA were suitable hormone combinat ions to induce multiple shoots
from shoot apices. The best hormone fo r propagat ing mult iple shoots w as 2. 0 mg L- 1 6BA. How ever,
grow th o f mult iple shoots w as inhibited by increasing subculture t imes. Genotypes also have impact on the
induction and pr oliferat ion of shoo t clumps. The best ro ot ing medium is 1/ 2MS + NAA 0. 1 mg L - 1 .
Both G418 ( 15 mg L- 1 ) and Hyg ( 75 mg L - 1 ) w ere demonst rated as select ion agents fo r t ransforma
t ion system in Ryeg rass. Data prov ide general guidelines for the development of a t ransformat ion recepto r
system in ry eg rass w ith high f requency induct ion and a rapid, short pro liferation period.
Key words: L ol ium P er enne L. ; Shoot apices; M ult iple Shoots; Propagat ion; Scr eening agent ; Subculture
多年生黑麦草( L ol ium Per enne L. )是一种丛
生型多年生禾草,有较强的发芽力和幼苗生长势, 耐
荫性强;是我国南北方广泛应用且适应性较强的草
坪草种[ 1] ,因其具有建植速度快, 分蘖力强, 抗病虫
害能力强, 常伴一些生长较慢的品种快速成坪[ 2] , 在
城市绿化和运动场建设中具有重要作用。但是黑麦
草对干旱、高热和严寒的耐受力较弱,而且对土壤盐
碱性耐受能力中等, 因而限制了栽培和利用 [ 3]。并
且黑麦草为异花风媒传粉, 高度自交不亲和,这使其
遗传改良困难而复杂[ 4] 。从 20世纪 80年代起, 采
用生物技术改良黑麦草的研究在国内外已引起重
视, 已有较多工作[ 5, 6] 。黑麦草幼叶、幼胚、成熟胚
和茎节分生组织培养都可产生愈伤组织, 但黑麦草
愈伤组织诱导率低, 在继代培养过程中胚性容易丧
失,再生植株易发生体细胞无性系变异 [ 7] ,黑麦草遗
传转化的受体通常为具有再生能力的愈伤组织或悬
收稿日期: 20090907;修回日期: 20100113
基金项目: 863计划项目( 2006AA10Z126)、国家 十一五科技支撑计划课题( 2008BADB3B01)资助
作者简介:刘珍( 1984 ) ,女,陕西汉中市人,硕士研究生,研究方向为牧草种植资源, Email: liuzhen 07@ lzu. cn; * 通讯作者 Author for
corr espondence, Email: yuanqinghua@ hotmail. com
第 4期 刘珍等:多年生黑麦草高频丛生芽增殖培养体系的研究
浮培养细胞。成功的植物基因转化首先依赖于良好
的遗传转化受体系统, 由于黑麦草再生体系建立较
为困难[ 8] ,并且转化成苗所需的时间较长。姜素云
等[ 9]在对一年生黑麦草海湾( Gulf)和多年生黑麦草
泰垂莱特( Tet relite)的研究中进行了丛生芽组织培
养的初步研究。因此, 本研究试图从丛生芽的角度
建立多年生黑麦草的高效再生体系,选取多年生黑
麦草的 3个优良品种对丛生芽高频增殖体系进行研
究,从而为多年生黑麦草的转基因育种提供良好的
基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
选取多年生黑麦草品种里加 ( Regal )、贝尔勒
( Belle)、马拉松( M ar athon)。种子由中国农业科学
院北京畜牧兽医研究所提供。
1. 2 供试方法
1. 2. 1 材料消毒处理 多年生黑麦草 3 个品种的
成熟种子各取 120个,分别放入 40 mL 烧杯中, 加
入 1 50的混合液(洗涤剂: 水)浸泡 1 h, 之后将瓶
口用纱布罩上, 并用橡皮筋扎住纱布, 流水冲洗
12 h;再用 70%的酒精浸泡 30 s, 无菌水冲洗 5次;
又用 0. 1%的升汞消毒 18 m in, 用无菌水冲洗 10
次,最后用无菌吸水纸将种子吸干。
1. 2. 2 培养基 以 MS 培养基为基本培养基[ 10] ,
附加 200 mg L- 1水解酪蛋白( CH ) , 蔗糖 30 g
L
- 1
,琼脂 7 g L- 1 , pH 值 5. 8, 120 灭菌 23 min。
各培养基添加不同浓度的 2, 4D 和/或 6BA 和/或
NAA(表 1)。诱导培养基为 A1~ A12,增殖培养基
为 B1~ B7,生根培养基: 1/ 2M S+ C1~ C4。
表 1 培养基的激素组成
T able 1 Different combinations of 6BA and 2, 4D in the medium
培养基编号
Medium
No.
诱导培养基
In duct ion medium
2 , 4D
mg L- 1
6BA
mg L- 1
培养基编号
Medium
No.
诱导培养基
In duct ion m edium
2 , 4D
mg L- 1
6BA
mg L- 1
培养基编号
Medium
No.
诱导培养基
Induct ion medium
2 , 4D
mg L- 1
6BA
m g L - 1
A1 0 0 B1 0 0 C1 0 0
A2 0 1 B2 0 0. 5 C2 0 0. 1
A3 0 2 B3 0 1 C3 0 0. 2
A4 0 3 B4 0 1. 5 C4 1 0. 1
A5 0. 5 0 B5 0 2 C5 1 0. 2
A6 0. 5 1 B6 0 2. 5
A7 0. 5 2 B7 0 3
A8 0. 5 3
A9 1 0
A10 1 1
A11 1 2
A12 1 3
1. 2. 3 外植体的选择 将处理好的种子接种到
MS 无激素培养基上, 在 ( 25 1) 的暗环境下培
养,待胚芽伸长至 2~ 3 cm 时, 用灭菌的剪刀和镊
子切取无菌苗的茎尖作为诱导丛生芽的外植体。
1. 2. 4 丛生芽的诱导 将切取的外植体分别置于
填加不同浓度 2, 4D和 6BA 的 MS 培养基上, pH
值调节至 5. 8。每个培养皿接 20 个外植体,设置 5
个重复。培养温度 25 1 , 光照 12 h/ d,光强 2000
~ 3000 lx。20 d后统计产生丛生芽的茎尖数和每
个芽从的平均芽数。
1. 2. 5 丛生芽增殖与继代 20 d 后, 将生长良好
的丛生芽块剥去较老的叶鞘和叶原基发育的幼叶,
把芽丛分开成单株芽, 剥离小芽时要避免损伤叶原
基附近的分生组织[ 5]。将分开的单芽分别转移到不
同的增殖培养基上, 以 MS 培养基为基本培养基,
附加不同浓度 6BA, pH 值调节至 5. 8,每个处理放
置 20个单芽,设置 5 个重复, 每 20 d 继代 1 次, 放
入光照培养箱中, 温度 25 1 ,光照强度为 2000~
3000 lx,光照时间 12 h d- 1 , 20 d后统计丛生芽的
增殖情况。
1. 2. 6 丛生芽筛选剂及浓度的选择 抗生素筛选
剂为 G418 (庆大霉素衍生物, Genet icin, 50、100、
150、200、250、300 mg L- 1 )或 Kan (卡那霉素, ka
namycin, 200、300、400、500、600、700 mg L- 1 )或
Hyg (潮霉素, Hyg romycin, 25、50、75、100、150、200
mg L1)。筛选剂对愈伤组织抑制效果的测定:取
同一培养时期相同状态的丛生芽块置于含不同浓度
筛选剂的培养基上, 记录每一处理丛生芽的平均芽
数( W1 ) , 培养一段时间后,再次记录其芽数( W2 )。
1. 2. 7 生根及移栽 待丛生芽长至 3~ 4 cm 长且
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草 地 学 报 第 18卷
有 3~ 5片叶时,将其切割成单株接种于生根培养基
上,置于光照培养箱中, 25 下光照 16 h, 光照强度
2000~ 3000 lx, 20 下黑暗 8h, 待3- 4 w 后形成完
整植株,即可去掉封口膜,加入少许自来水, 在培养
室中炼苗 3 d。然后洗净根部附着的培养基, 移入装
有泥土和蛭石( 11)的花盆中, 30 d后可移入大田。
1. 2. 8 数据处理
诱导率= 产生丛生芽的茎尖数/接种的茎尖数
100%
增殖率= 产生丛生芽的芽尖数/接种的芽尖数
100%
平均芽数的增长率 r= ( W2- W1 ) / W1 100 %
平均芽数的相对增长率 R= r/ r0 100 %( r0 为
不加筛选剂培养的丛生芽平均芽数增长率)。
生根率= 生根数/接种苗数 100%
使用 SPSS 11. 5统计软件分析 P = 0. 05 水平
上数据间的差异性。
2 结果与分析
2. 1 不同 2, 4D和 6BA 浓度对不同品种的多年
生黑麦草丛生芽诱导的影响
将切取的外植体分别接种于附加不同浓度 2,
4D和 6BA的诱导培养基上(表 1) , 5 d 后茎尖开
始伸长(图 1A ) , 8~ 10 d后从茎尖表面上开始有小
芽长出(图 1B) , 15~ 20 d后形成具有 10~ 20 个小
芽的芽丛(图 1C) , 20 d后统计产生丛生芽的茎尖数
和芽丛的平均芽数。不同的外源激素种类、浓度或
配比对黑麦草丛生芽的形态发生产生了很大的影响
(表 2)。由表 2可知, 在不填加 2, 4D 和 6BA 的
A1培养基上,黑麦草的 3个品种均没有长出丛生
芽。在不含有 2, 4D 的 A2~ A4培养基上, 能够长
出绿色的丛生芽,但部分丛生芽呈玻璃化,一些叶片
有黄色斑点;当 6BA浓度为 2. 0 mg L- 1时, 丛生
芽的出芽数和芽丛的平均芽数较多, 6BA 浓度过低
或过高都会降低丛生芽的诱导率;在 A7培养基上,
小芽叶色鲜绿, 芽块长势很好, 丛生芽的诱导率最
高,每个芽丛的平均芽数也最多,其中里加的诱导率
最高,贝尔勒次之,马拉松最低;在 A8~ A12的培养
基中,丛生芽块的发生率降低, 大部分芽基部愈伤
化,还有部分白化芽的发生,有的芽块上还长出较多
叶片。因此,以 A7培养基( M S+ 0. 5 mg L- 1 2,
4D+ 2. 0 mg L - 1 6BA)作为诱导培养基。
2. 2 不同的 6BA 浓度对不同品种的多年生黑麦
草丛生芽增殖的影响
20 d后将诱导的丛生芽块切成单芽或具 1~ 2
个小芽的小芽块(图 1D) , 分别转到附加不同浓度 6
BA的增殖培养基中继代培养, 研究其对丛生芽增
殖的影响。外源激素的种类和浓度或其组合的不同
在黑麦草丛生芽的形态发生中起着非常关键的作用
(表 3)。5~ 8 d后, 单芽或小芽块上开始有 2~ 5个
小芽发生(图 1E) , 10~ 15 d后形成具多个小芽的旺
盛芽丛(图 1F)。由表 3可知,在不含有 6BA 的 B1
培养基中,无丛生芽的产生,单芽或是小芽块均生长
成小植株;在 B2~ B5培养基中,随着 6BA 浓度的
增加, 3个品种丛生芽的增殖率和芽丛的平均芽数
都在增加,当 6BA浓度低于 2. 0 mg L - 1时,丛生
芽较少,且芽丛最多也只有 3~ 4个小芽; 3个品种
均在 B5培养基中的丛生芽生产最为旺盛, 其中里
加的增殖率最高 ( 98%) , 芽丛的平均芽数也最多
( 9. 65) ,贝尔勒次之, 马拉松最低; 当 6BA 浓度高
于 2. 0 mg L- 1 L 时, 芽丛的叶色浓绿,但是部分芽
玻璃化,部分叶面有黄化现象,还有部分白化苗的发
生。因此,以 B5培养基( M S+ 2. 0 mg L - 1 6BA)
作为增殖培养基。
2. 3 继代时间对丛生芽增殖的影响
在 B5培养基上每 20 d继代一次,接种于继代
培养上的丛生芽块的形态、结构因继代天数的长短
而有所不同。由图 2可知:随着继代培养时间的延
长, 3个品种丛生芽的增殖能力都有不同程度的变
化。里加和贝尔勒在继代培养基上继代培养 60 d
时芽丛的平均芽数最多,而马拉松在继代培养基上
继代培养 80 d时芽丛的平均芽数最多。随着继代
天数的继续增加,芽丛的平均芽数明显下降。当继
代天数在 100 d以上时, 丛生芽的增殖率明显下降。
2. 4 多年生黑麦草不同品种对丛生芽诱导和增殖
的影响
由表 5可知, 不同多年生黑麦草品种的愈伤组
织诱导率和分化率不同,其中,里加的诱导率和增殖
率在同等条件下显著高于马拉松( P< 0. 05) , 分别
达到 80%和 98% ,贝尔勒则介于两者之间;而在芽
丛的平均芽数中, 无论是接种后的茎尖,还是继代后
的芽块,里加的芽丛平均芽数都显著高于贝尔勒和
马拉松,分别高达 6. 71和 9. 65, 而马拉松的芽丛平
均芽数最低, 仅为 6. 58和 8. 74。这说明基因型对
丛生芽的诱导和增殖有很大的影响。
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第 4期 刘珍等:多年生黑麦草高频丛生芽增殖培养体系的研究 579
草 地 学 报 第 18卷
图 1 黑麦草丛生芽培养
F ig . 1 Multiple shoo ts format ion
A:无菌种子苗上切取的茎尖生长点部分; B:诱导 8~ 10 d的茎尖; C:诱导 15~ 20 d的茎尖; D:继代增殖培养基上的小芽块;
E:在增殖培养基上生长 5~ 8 d的芽丛; F:在增殖培养基上生长 20 d的芽丛
A: S hoot apices f rom 1w eekold as ept ically germinated seedlings ; B: Sh oot apices indu ced for 810 d; C: Shoot apices induced for 15 20 d;
D: Shoot apices t ran sferred to prolif erat ion m edium; E: Mul t iple sh oot clum ps cultur ed for 5~ 8 d on prolif erat ion
medium; F: Mult iple shoot clumps cu ltured for 20 d on prolif erat ion medium
2. 5 多年生黑麦草丛生芽块筛选剂及浓度的选择
本研究选择了 G418、Hyg 和 Kan 3种较常用
的筛选剂, 将黑麦草的丛生芽块分别接种于含有不
同筛选剂和浓度的增殖培养基上。结果表明: 这 3
种筛选剂对多年生黑麦草愈伤组织的生长有不同的
抑制作用, 抑制效果随浓度的增加而增强,并且在同
一浓度下, 筛选的时间越长, 其抑制作用越明显。
Hyg 的抑制效果最好, G418 次之, Kan的抑制效果
最差,当浓度达到 700 mg L- 1时, 多年生黑麦草 3
个品种的丛生芽块都仍有 30%左右的增长能力(表
6)。因此, 在以后的转化中可以应用 Hyg 和 G418
这 2种筛选剂对转化后的丛生芽块进行筛选。
综合考虑筛选剂、筛选剂浓度和筛选时间 3 方
面因素的影响(图 3) , 多年生黑麦草丛生芽的筛选
方案应以 G418 150 mg L - 1浓度下筛选 40 d 左右
或者是 Hyg 75 mg L- 1浓度下筛选 30 d左右为宜。
2. 6 生根与移栽
将生长良好的丛生芽块分开成单株接种于生根
培养基( C1~ C5)诱导生根。生根培养 15 d 左右有
大量白色的小根出现, 最后有几条根长得较长、较
快,芽苗也迅速长高,接种 20 d后统计生根结果(表
7)。由表 4可知, 所用培养基上都有根生成,说明丛
生芽生根较容易; 结合生根率和生长势, 我们认为
C2培养基( 1/ 2M S+ NAA0. 1 mg L - 1 )较适宜丛
生芽生根。
3. 1 植物激素的种类和浓度对丛生芽诱导的影响
丛生芽诱导率及芽块质量取决于基因型、外源
激素以及取材部位等多种因素。本研究使用 2, 4D
和 6BA 作为诱导激素, 与鲍芫等人 [ 11]在偃麦草离
体培养时采用的诱导激素相同,但是与马晖玲 [ 12]等
人在草地早熟禾植株再生研究中单独使用 2, 4D作
为诱导激素不同, 所以应根据供体材料的不同选取
适宜的激素种类。适宜的激素浓度配比是提高丛生
芽诱导率并获得高质量芽块的基础。少量的 6BA
促进丛生芽的诱导, 高浓度的 6BA 抑制丛生芽的
诱导,抑制作用随着 6BA 浓度的增加而增强。这
580
第 4期 刘珍等:多年生黑麦草高频丛生芽增殖培养体系的研究
表明激素间的协同作用很重要, 张万军等 [ 13]在多年
生黑麦草组织培养与植株再生的研究中也提到激素
的协同效应有必要进行深入的研究。
表 4 不同继代时间丛生芽增殖能力的比较
Table 4 Compar ison of the capability on the pr oliferat ion of shoot clumps in different subcultute day s
继代天数
Subcul tu re Day
芽丛平均芽数 Average shoots of p er clum p
贝尔勒 Belle 马拉松 Marathon 里加 Regal
0 0 g 0 g 0 g
20 8. 92 1. 60e 6. 52 1. 88 f 9. 85 2. 57e
40 30. 15 3. 34c 10. 82 1. 60 e 25. 21 8. 46cd
60 46. 32 3. 77a 20. 05 0. 93 c 54. 02 3. 45a
80 41. 21 2. 42b 44. 35 1. 52 a 42. 54 1. 37b
100 28. 36 2. 09c 35. 62 1. 52 b 32. 15 2. 57c
120 20. 05 2. 00d 12. 58 1. 24 d 27. 12 2. 01d
140 6. 25 1. 64f 5. 06 1. 68 f 7. 56 1. 39f
表 5 不同多年生黑麦草品种的丛生芽诱导率和增殖率
Table 5 The effect of var ieties Lolium Perenne L on the induction and proliferat ion of shoo t clumps
品种
Variety
接种的茎尖数
No. of shoot t ips
incubated
诱导率
Induct ion rate
%
芽丛的平均芽数
Average shoots
of per clump
继代的芽尖数
No. of bud t ips
subcul tu red
增殖率
Prol iferation rate
%
芽丛的平均芽数
Average shoots
of per clum p
贝尔勒 Bel le 100 78 1. 05ab 6. 62 0. 91b 100 94 1. 18 ab 8. 92 2. 79 b
马拉松 Marath on 100 75 1. 08b 6. 58 0. 61b 100 91 1. 43 b 8. 74 0. 49 b
里加 Regal 100 80 1. 54a 6. 71 0. 52a 100 98 1. 71 a 9. 65 1. 65 a
表 6 不同筛选剂对愈伤组织生长的抑制作用
Table 6 Effect of different selection r eagents forcallus gr ow th, mg L- 1
G418
浓度
Concent ration
抑制效果 inhibit ion , %
贝尔勒
Belle
马拉松
Marathon
里加
Regal
Hyg
浓度
Concent rat ion
抑制效果 inh ibit ion, %
贝尔勒
Bel le
马拉松
Marathon
里加
Regal
WKan
浓度
Concent rat ion
抑制效果 inhibit ion, %
贝尔勒
Bel le
马拉松
Marathon
里加
Regal
50 68. 21 72. 30 70. 40 25 77. 60 44. 28 67. 81 200 89. 25 84. 63 76. 52
100 51. 32 60. 21 45. 81 50 42. 12 28. 35 34. 26 300 78. 21 75. 45 69. 35
150 39. 61 45. 62 32. 42 75 10. 25 10. 52 12. 37 400 65. 22 69. 11 60. 30
200 8. 25 6. 81 9. 25 100 3. 87 0. 81 1. 32 500 71. 28 70. 20 63. 45
250 1. 42 0. 50 0. 82 150 1. 24 0. 34 0. 15 600 60. 20 58. 64 50. 84
300 0. 10 0 0 200 0 0 0 700 30. 65 25. 63 32. 61
注: 抑制效果为丛生芽块平均芽数的相对增长率,取自筛选 30 d后的统计结果
Note: Inhib iti on refers to the relat ive grow th rate of the average number of sh oot clum ps, taWKen f rom th e selectin g result s after 30 d
图 2 不同时期丛生芽增殖能力的比较
Fig . 1 Comparison o f the capability on the pro lifer ation o f shoot clumps
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草 地 学 报 第 18卷
图 3 筛选时间对丛生芽平均芽数相对增长率的影响
Fig . 3 Effect of different cultural time on g row th rate o f shoot clumps
3. 2 6BA浓度的不同对丛生芽增殖的影响
6BA是一种高效的植物细胞分裂素,它调控细
胞核基因的活性和蛋白质的磷酸化与翻译[ 14] 。从
本研究结果可知, 6BA 显著地提高了丛生芽的诱导
率和增殖率,可能是因为多年生黑麦草组织中含有
内源细胞分裂素, 6BA 促进内源细胞分裂素的生物
合成并使植物体保持较高的内源激素水平。因此,
若想通过加外源细胞分裂素来使细胞达到较高的分
裂状态,应根据供体材料的内源激素水平确定外源
激素浓度。在增殖培养阶段为了促进芽的增殖, 仅
添加细胞分裂素 6BA, 这与杨茹等人[ 15] 在组织培
养中设计培养基时所做的处理相同。
3. 3 继代时间对黑麦草丛生芽增殖的影响
以茎尖生长点为外植体的丛生芽增殖培养具有
诱导率高、增殖速度快、试验周期短的特点, 但是只
有在长时间离体培养中保持较高增殖能力的芽块才
能作为遗传转化受体, 因为转化后的受体细胞需要
长时间的继代筛选, 否则将会严重影响转化效果。
继代使丛生芽增殖迅速, 生物量大幅度扩大, 既保持
了芽块的高质量状态, 同时为基因转化提供足够的
材料。实验中发现继代时间的长短对芽块的再生起
着重要作用。这与王丹等[ 16] 对丛生芽继代培养的研
究结果相一致。之后的生根培养采用培养基 1/ 2MS
+ NAA0. 1 mg L- 1 ,与张献龙等[ 17] 得出的结论: 高
浓度 NAA 的培养基不利于生根的诱导是一致的。
3. 4 基因型对丛生芽诱导与增殖的影响
禾草的诱导和增殖能力、细胞的全能性潜在趋
势及感受态程度因品种不同而存在差异。研究表
明,同一种类不同品种的外植体对同一培养基的反
应存在较大差异。因此, 通过对不同品种进行筛选
以得到再生能力强的品种。杜雪玲等[ 18] 在不同品
种黑麦草外植体的转化研究中得出相同结论。本研
究也发现丛生芽的形成、增殖和根的发生都受基因
型的控制。基因型的作用受各种内外因素影响: 供
体植物本身的生理状况、外植体内源激素的水平、外
植体对 2, 4D和 6BA 不同的敏感性[ 19]。添加一定
浓度的生长素和细胞分裂素能在一定程度上提高诱
导率,但它可能对芽产生毒害,这种毒害作用又因不
同品种的耐受力、不同培养基的缓解力而不同, 最终
不同品种禾草对各种培养基的反应形成差异。
3. 5 多年生黑麦草丛生芽块筛选剂浓度的选择
筛选剂以及其浓度的选择是植物遗传转化成功
的关键之一, 不同的植物种类对各种筛选剂的敏感
性不同, 所要求的筛选剂及其浓度也不同。在选择
培养基中加入筛选剂会对细胞的生长产生选择压,
加入的抗生素浓度越大, 选择压也越大。在此阶段
若没有高效的筛选体系,会使未成功转化的植株逃
逸筛选压,若一味地加大筛选压,虽然能更有效地得
到转化细胞, 但同时也严重影响了转化细胞生长和
再生能力。筛选压力过高导致非转化细胞死亡, 死
细胞的某种物质扩散到其他细胞中而干扰后者的生
长代谢[ 20] ,从而降低转化效率。
4 结论
本研究以多年生黑麦草丛生芽块的诱导与增殖
培养及植株再生为对象,建立了丛生芽高效增殖体
系,探讨了建立多年生黑麦草遗传转化受体系统的
必要条件。结果表明:丛生芽诱导最适 2, 4D和 6
BA浓度分别为 0. 5 mg L - 1和2. 0 mg L- 1 ; 丛生
芽增殖最适 6BA 浓度为 2. 0 mg L - 1 ; 继代天数
过长对丛生芽块生长不利, 里加和贝尔勒最佳继
代时间为60d, 而马拉松为80d;不同品种的多年生
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第 4期 刘珍等:多年生黑麦草高频丛生芽增殖培养体系的研究
黑麦草丛生芽诱导率和增殖率不同; 生根培养基为
1/ 2 MS + NAA 0. 1 mg L- 1。确定丛生芽的最
适筛选剂为 G418和 Hyg,其浓度分别为 150 mg
L
- 1和75 mg L- 1。
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(责任编辑 李 扬)
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