全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
结缕草耐盐分离群体的构建
郭海林,丁万文,陈静波,陈 宣,刘建秀*
(江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园),江苏 南京 210014)
摘要:为进一步研究结缕草属(ZoysiaWild.)植物的耐盐性遗传机制,通过结缕草耐盐亲本Z105(Z.japonica)和
敏盐亲本Z061(Z.japonica)进行人工杂交,以构建结缕草的耐盐分离群体。首先通过SRAP(Sequence-related
amplifiedpolymorphism)分子标记技术对所获得的F1 群体杂种真实性进行鉴定,在此基础上,通过水培法对F1 群
体的耐盐性进行鉴定。结果表明:F1 群体164个后代中132个后代为真杂种,这些后代的耐盐性表现出连续性的
遗传变异,存在明显的分离现象,成功地构建了结缕草的耐盐性分离群体。这为结缕草耐盐性的遗传分析、遗传图
谱的构建和耐盐性遗传标记的QTL定位奠定了良好的基础。
关键词:结缕草;耐盐性;分离群体;构建
中图分类号:Q943 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0724-06
EstablishingaSegregatingPopulationofSaltTolerantZoysiajaponica
GUOHai-lin,DINGWan-wen,CHENJing-bo,CHENXuan,LIUJian-xiu*
(InstituteofBotany,JiangsuProvinceandChineseAcademyofSciences,Nanjing,JiangsuProvince210014,China)
Abstract:SalttolerantparentZ105(Zoysiajaponica)andsaltsensitiveparentZ061(Z.japonica)were
crossedusingartificialcontrolpolinationmethodtoconstructF1segregatingpopulationofzoysiaforthe
furtherstudyofsalttolerantmechanisms.SRAP(sequence-relatedamplifiedpolymorphism)molecular
markerswereusedtodeterminethehybridauthenticityof164F1progenies.Onehundredthirtytwoprog-
eniesshowedspecificbandswhichwereidentifiedtobetruehybrids.Salttoleranceofthetruehybridswas
identifiedbymeansofahydroponicculturesystem.Resultsshowedthatasuccessionalgeneticvariation
existedamongdifferentprogenies.Asegregatingpopulationofsalttolerantzoysiagrasswasconstructed
whichwilbeusefulforthegeneticmappingconstruction,geneticmechanismanalysisandthemappingof
quantitativetraitlociofsalttolerantzoysiagrass.
Keywords:Zoysiajaponica;Salttolerance;Segregatingpopulation;Construction
结缕草属(Zoysia Wild.)植物是一种优良的
暖季型草坪草,原产于中国、日本和韩国等地,广泛
分布于太平洋西岸和北岸沿海地区。结缕草属植物
大约有11个种,我国有5种,2变种和1变型,其中
的结缕草(Z.japonica)、中华结缕草(Z.sinica)和
沟叶结缕草(Z.matrella)被广泛应用于观赏草坪、
休憩草坪、运动草坪以及保土草坪等各种草坪的建
植中[1-3]。
结缕草属植物的叶片厚硬而近革质,叶肉组织
中还具有双细胞的盐腺,是较其他草坪草更耐盐的
一种 草 坪 草[4-6],其 中 大 穗 结 缕 草 (Z.mac-
rostachya)、结缕草和沟叶结缕草3个种被列为盐生
植物[7],研究表明,结缕草属植物的耐盐性存在较大
的遗传变异,同一个种的不同种源间在耐盐性上也
存在丰富的变异[8-11]。随着滨海盐碱地区的开发和
园林绿化的需要,选育优质耐盐的草坪草新品种显
得尤为重要。如何培育优质耐盐的结缕草属植物新
品种,明确结缕草属植物耐盐性遗传机制对于选择
适当的育种方法非常重要。前人对小麦(Triticum
aestivum)[12]、水稻(Oryzasativa)[13]、玉米(Zea
mays)[14]、棉花(Gossypiumhirsutum)[15]、西红柿
(Lycopersiconesculentum)[16]和秋葵(Abelmoschus
esculentus)[17]等多种植物的研究均发现,这些植
物在耐盐性遗传上表现为加性和非加性(即显性和
收稿日期:2012-02-07;修回日期:2012-03-20
基金项目:国家青年科学基金项目(30800759)资助
作者简介:郭海林(1975-),女,内蒙古乌盟人,博士,副研究员,主要从事草坪草遗传育种研究,E-mail:ghlnmg@sina.com;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:turfunit@yahoo.com.cn
第4期 郭海林等:结缕草耐盐分离群体的构建
上位性效应)同时存在的遗传模式,且以加性为主,
因此系统选育和杂交育种这2种传统的育种手段是
这些植物培育耐盐新品种的有效方法。
江苏省中国科学院植物研究所从2001年开始
对结缕草属植物的耐盐性进行研究,到目前为止,已
对150余份结缕草属植物种质资源进行了耐盐性鉴
定。为进一步研究结缕草属植物的耐盐性遗传机
制,本研究选取了2份耐盐性极端类型结缕草材料
进行杂交,并通过SRAP分子标记技术和水培法对
杂交后代的杂种真实性和耐盐性进行鉴定,以构建
结缕草的耐盐性分离群体。
1 材料与方法
1.1 材料
试验材料为结缕草属的耐盐亲本Z105(Zoysia
japonica;耐盐系数为0.72)和敏盐亲本 Z061
(Zoysiajaponica;耐盐系数为0.14)[8]及其杂交所
获得的164个后代。Z105为1999年从山东省烟台
市采集的种质材料,Z061为1995年从江苏省南京
市采集的种质材料,现均种植于江苏省中国科学院
植物研究所的苗圃地内,164个杂交后代于花盆中
培养,2个亲本也分别从苗圃地取适量材料与后代
同时在花盆中培养。
1.2 试验方法
1.2.1 杂交方法 杂交育种采用人工控制授粉法。
根据结缕草属植物的开花习性[18],于2006年3-4
月在母本(Z105)孕穗期对其进行套袋,在雌蕊外露
时取父本(Z061)花粉不去雄对母本直接进行授粉,
继续套袋,等6月花序成熟时进行收种。试验于江
苏省中国科学院植物研究所的苗圃地进行。
1.2.2 杂交后代及其亲本基因组DNA的提取和
检测 本试验采用原平皓生物技术有限公司生产的
HF-213新型广谱植物基因组DNA快速提取试剂
盒进行基因组DNA的提取,并采用0.8% 琼脂糖
凝胶电泳检测基因组DNA的质量和浓度(电泳仪
为DYCP-34型,电泳槽为 DYY-5型)。电泳结束
后,在自动凝胶图像分析仪(上海培清科技有限公司
JS-380)上观测,确定DNA浓度并拍照。最后将样
品DNA浓度稀释至50ng·μL-1,并于-20℃保
存。
1.2.3 SRAP-PCR反应体系、扩增程序及扩增产
物的检测 SRAP反应体系、扩增程序及其电泳检
测都采用郭海林等[19]的方法。
1.2.4 杂交亲本间SRAP多态性引物组合的筛
选 根据SRAP-PCR反应体系,随机选取20条正向
引物和10条反向引物,共组合成200对SRAP引物,
引物序列及其组合与郭海林等[19]相同,对2份结缕
草属亲本材料进行多态性SRAP引物组合筛选。
1.2.5 杂交后代真实性鉴定 根据杂交亲本间
SRAP多态性引物的筛选结果,选择多态性高,父本
有特异带的引物组合对杂交后代进行杂种真实性鉴
定,具有父本特异带的后代判断为真杂种。具体鉴
定方法为,首先用第1对引物对所有后代进行鉴定,
有父本特异带的后代,初步鉴定为真杂种,然后用第
2对引物对第1对引物没能鉴定为真杂种的后代进
行鉴定,第2对引物鉴定完,再对剩下的后代用第3
对引物进行鉴定,依次类推,直到剩下的后代用5~
6对引物鉴定后均不出现父本的特异带,则认为剩
下的后代为自交种。
1.2.6 杂交后代的耐盐性鉴定 杂交后代及其亲本
的耐盐性鉴定采用盐浓度逐渐增加的水培法进行。
试验材料于2010年6-7月开始培养,培养方法参照
陈静波等[11]的方法,每份材料种植6杯,处理和对照
各3杯。材料培养2个月后,于9月20日开始盐
(NaCl)处理,为防止盐急性伤害,以2.5g·L-1的盐
浓度每天逐渐增加,直到盐浓度达到20g·L-1为止,
达到20g·L-1前对所有材料的枯草进行剔除,并进
行最后一次修剪,修剪高度统一为4cm,此后不再进
行修剪,该浓度维持1个月后进行耐盐性评价。耐盐
性评价指标为叶片枯黄率和枝叶修剪干重降低百分
率,其中叶片枯黄率采用目测法进行评价,是指处理
材料枯叶的百分率;枝叶修剪干重降低百分率是指处
理相对于对照地上部分生长降低的百分率,计算公
式:枝叶修剪干重降低百分率=(对照修剪干重-处
理修剪干重)/对照修剪干重×100%。
2 结果与分析
2.1 杂交后代及其亲本间DNA的提取及其检测
2亲本Z105与Z061杂交共获得了164个杂交
后代,为鉴定其杂种的真实性,首先提取了所有材料
的DNA,并对所提取 DNA 进行浓度和质量的检
测,检测结果表明,本次试验提取的DNA质量好、
浓度高,参试材料均一次性提取成功,本试验最终将
各样品的DNA浓度统一稀释到50ng·μL-1,作为
模板DNA的浓度。
527
草 地 学 报 第20卷
图1 部分参试材料50ng·μL-1DNA的电泳检测图
Fig.1 ElectrophoresisofgenomicDNA(50ng·μL-1)fromtestedsample
2.2 杂交亲本间多态性引物的筛选
通过200对SRAP引物组合对2亲本Z105与
Z061进行扩增,以筛选出父本具有特异带的引物进
行杂种真实性鉴定,结果发现200对引物中有61对
引物在父本中扩增出了特异性条带,占总数的
30.5%。图2所示为前24对引物的筛选结果。
图2 部分SRAP引物组合在2亲本间的扩增结果
Fig.2AmplifiedresultsofparentsusingselectedSRAPprimercombinations
注:M:DNAmarker;1~24为引物组合编号;每个引物组合的试验材料从左至右依次为Z105,Z061
Note:M:DNAmaker;1~24:thenumberofselectedprimercombination;experimentalmaterialswereZ105and
Z061fromlefttorightineachprimercombination
2.3 杂交后代的杂种真实性鉴定
首先用引物 Me4Em8对杂交后代进行鉴定,结
果具有父本特异性条带的 Me4Em8-130bp 和
Me4Em8-150bp的84个后代被鉴定为真杂种,再
用 Me1Em2对剩下的后代进行鉴定,结果具有父本
特异性条带 Me1Em2-150bp的18个后代也被鉴定
为 真 杂 种,然 后 依 次 用 Me2Em4,Me4Em9,
Me16Em1,Me12Em3,Me2Em8对前一对引物鉴定
后剩下的后代进行鉴定,结果通过这5对引物的特
异 性 条 带 Me2Em4-220 bp,Me4Em9-190 bp,
Me16Em1-350bp,Me12Em3-360bp,Me2Em8-380
bp分别将剩下的10个、8个、2个、1个和9个后代
鉴定为真杂种,其余的32个后代又用8对引物
(Me10Em5,Me13Em5,Me19Em19,Me7Em20,
Me14Em18,Me18Em18,Me19Em18,Me1Em19)
鉴定,均不具有父本的特异带,因此被认为是自交
种。具体鉴定情况如表1和图3所示。
2.4 杂交后代耐盐性鉴定
根据杂种真实性的鉴定结果,从132份真杂种中
选取了有足够生物量的120份后代进行耐盐性鉴定。
耐盐性鉴定结果表明,在盐胁迫下,2亲本耐盐性差
异明显,母本Z105表现出较强的耐盐性,叶片枯黄率
为35.00%,枝叶修剪干重降低百分率为42.10%,而
父本的耐盐性非常差,叶片枯黄率为95.00%,枝叶修
剪干重降低百分率为84.59%。120份杂交后代的耐
盐性表现出明显的分离现象,且呈连续性的分散分
布,叶片枯黄率变异范围为10.00%~98.33%,平均
为50.39%,变异系数为40.50%,枝叶修剪干重降低
百分率变异范围为1.87%~91.40%,平均为52.38%,
变异系数为46.50% (图4和图5)。
627
第4期 郭海林等:结缕草耐盐分离群体的构建
表1 杂种真实性鉴定结果及其引物序列
Table1 IdentificationoftruehybridsandSRAPmarkers
引物组合Primercombinations 引物序列Primersequence 鉴定为真杂种数量 No.ofhybrids
Me4Em8
Me4:5′-TGAGTCCAAACCGGACA-3′
Em8:5′-GACTGCGTACGAATTGCC-3′
84
Me1Em2
Me1:5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′
Em2:5′-GACTGCGTACGAATTCTG-3′
18
Me2Em4
Me2:5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
Em4:5′-GACTGCGTACGAATTTGA-3′
10
Me4Em9
Me4:5′-TGAGTCCAAACCGGACA-3′
Em9:5′-GACTGCGTACGAATTTCA-3′
8
Me16Em1
Me16:5′-TGAGTCCAAACCGGGAC-3′
Em1:5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′
2
Me12Em3
Me12:5′-TGAGTCCAAACCGGTAG-3′
Em3:5′-GACTGCGTACGAATTGAC-3′
1
Me2Em8
Me2:5′-TGAGTCCAAACCGGAGC-3′
Em8:5′-GACTGCGTACGAATTGCC-3′ 9
图3 SRAP引物组合 Me4Em8对部分杂交后代的鉴定结果
Fig.3 SRAPanalysisofselectedcrossprogenywithprimerMe4Em8
注:箭头所指为父本所具有的特异性条带,前2个材料分别为母本和父本,其余均为后代
Note:Arrowheadindicatedthespecificbandsofmaleparent.Firstandsecondmaterialsarefemaleand
maleparentrespectively,othersareprogenies
图4 120个杂交后代叶片枯黄率测定结果
Fig.4 Leaffiringpercentageof120
Z105×Z061hybrids
图5 120个杂交后代枝叶修剪干重降低百分率测定结果
Fig.5 Reducedpercentageofdryshootclipping
weightof120Z105×Z061hybrids
3 讨论与结论
结缕草与其他草坪草一样,花序比较小,小穗更
小,这给杂交育种带来一定的困难,不仅去雄工作量
非常大,还不容易操作。本研究根据结缕草属植物
的开花习性,即雌蕊先熟、雄蕊后熟的特性,采用不
727
草 地 学 报 第20卷
去雄的方法直接进行杂交育种,然后对杂种的真实
性进行鉴定,以剔除自交种。杂种鉴定的方法很多,
包括形态特征、细胞染色体差异、同工酶标记及分子
标记等,其中形态特征和同工酶标记易受环境的影
响,而结缕草属植物的染色体数均为2n=4x=40,
且染色体非常小[20],因此很难从细胞染色体的差异
进行杂种鉴定。SRAP分子标记技术是2001年开
发的一种新型分子标记技术,引物设计简单,具有通
用性,通过正向引物和反向引物的自由组合,可以在
较少的引物基数中进行多种组合,提高了引物的使
用率,大大降低成本。近年来,作者所在实验室将
SRAP分子标记技术应用于结缕草属植物的研究
中,首先优化了结缕草属植物的SRAP-PCR反应体
系[21],在此基础上,应用SRAP标记技术对缕草属
植物进行了遗传多样性的研究[19]、指纹图谱的构建
及杂种真实性的鉴定[22],多年的应用结果发现,
SRAP分子标记技术不仅简单快捷,同时具有稳定
性好和多态性高的优点,是简单又经济、有效又可靠
的分子标记系统,可有效应用于结缕草属植物的研
究中。本研究通过SRAP分子标记技术对164个
杂交后代的杂种真实性进行鉴定,结果有132个后
代被鉴定为真杂种,32个后代被鉴定为自交种,自
交种的比率为19.51%,前期研究结果表明,结缕草
属植物的自交结实率为0.0%~54%,平均为
16.15%[18],这一结论进一步证实了SRAP分子标记
技术在结缕草属植物杂种真实性鉴定中的可靠性。
在盐胁迫下,结缕草属植物在形态和生理生化
方面均会发生一系列的反应,相应的耐盐性评价指
标也有很多,如形态指标:叶片枯黄率;生长量指标:
枝叶修剪干重;生理指标:渗透势,渗透调节物的变
化、无机离子和活性氧清除酶类的活性等。在对大
批量的材料进行耐盐性鉴定时,用哪些指标进行耐
盐性鉴定是最理想的,研究表明叶片枯黄率、枝叶修
剪干重和根系修剪干重3个指标操作方便省时、准
确性高,是开展暖季型草坪草大规模种质资源抗盐
性快速评价的理想指标[23]。本研究采用叶片枯黄
率和枝叶修剪干重降低百分率对杂交后代及其亲本
的耐盐性进行鉴定,发现2亲本不论是叶片枯黄率
还是枝叶修剪干重,耐盐性的鉴定结果均表现为
Z105具有较强的耐盐性,而Z061对盐胁迫敏感,与
李亚等[8]的鉴定结果一致。这一结果进一步验证了
叶片枯黄率和枝叶修剪干重用于结缕草属植物耐盐
性鉴定的有效性。
结缕草属植物为常异花授粉植物,亲本异质性
很高,不论是杂交的F1 代群体还是自交的F1 代群
体均会发生性状分离,因此,在对结缕草属植物进行
遗传学研究时,可以直接利用F1 分离群体进行研
究,Cai等[24-25]就利用结缕草的自交F1 群体分别构
建了结缕草属植物的 AFLP和SSR遗传图谱。当
然也可以利用F2 群体进行遗传学研究,Yaneshita
等[20]就利用F2 分离群体构建了结缕草属植物的
RFLP遗传图谱。这些图谱的构建为结缕草属植物
重要性状的QTL定位及其标记辅助育种均奠定了
良好的基础,但是从未有人专门针对某个性状来构
建结缕草属植物的分离群体,进行遗传作图。本研
究选择结缕草耐盐性2极端类型种质材料进行杂
交,获得了包含132个真杂种的F1 群体,耐盐性鉴
定结果表明,后代的耐盐性表现出明显的分离现象,
其中叶片枯黄率和枝叶修剪干重的变异范围分别为
10.00%~98.33%和1.87%~91.40%,且呈连续性
的变异,这一群体的构建,为结缕草遗传图谱的构建、
耐盐性遗传分析和耐盐性的QTL定位均奠定了良好
的基础。
从对F1 群体耐盐性鉴定的结果还可以发现,后
代耐盐性的变异范围远远超出了双亲值的范围,这
说明在杂交育种的过程中通过基因重组产生了超亲
后代,这一结果初步表明可以通过杂交育种的手段
获得耐盐新品种,在下一步工作中将基于已构建的
耐盐分离群体对结缕草的耐盐性主基因和多基因的
遗传模式进行研究,以明确结缕草属植物耐盐性是
否存在主基因,以及主基因的遗传效应等,为采取合
理的杂交育种模式提供理论指导。
参考文献
[1] EngelkeMC,AndersonS.Zoysiagrasses(Zoysiaspp.)[G]//
MichaelDC,RonnyRD,eds.Turfgrassbiology,genetics
andbreeding.NewJersey:JohnWileyandSons,Inc.,2002:
271-285
[2] 董厚德,宫莉君.中国结缕草生态学及其资源开发与应用
[M].北京:中国林业出版社,2001
[3] 郭海林,刘建秀.结缕草属植物育种进展概述[J].草业学报,
2004,13(3):106-112
[4] MarcumKB,AndersonSJ,EngelkeMC.Saltglandionse-
cretion:AsalinitytolerancemechanismamongfiveZoysiagra-
ssspecies[J].CropScience,1998,38(3):806-810
[5] MarcumKB.Salinitytolerancemechanismsofgrassesinthe
subfamilyChloridoideae[J].CropScience,1999,39(4):1153-
1160
[6] MarcumKB,MurdochCL.Salinitytolerancemechanismsof
sixC4turfgrasses[J].JournaloftheAmericanSocietyfor
HorticulturalScience,1994,119(4):779-784
下转734页
827