全 文 ：第21卷 第4期
Vol.21 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2013年 7月
July 2013
doi:10.11733/j.issn.1007-0435.2013.04.026
内蒙古10种草原蝗虫和亚洲小车蝗
不同地理种群的ITS2序列分析
韩海斌,周晓榕,庞保平*
(内蒙古农业大学农学院,内蒙古 呼和浩特 010019)
摘要:为从分子水平对内蒙古草原蝗虫进行系统性研究,对内蒙古地区常见的10种草原蝗虫的120个个体的
rDNA-ITS2序列进行扩增,通过与 GenBank中已知蝗虫的ITS2对比得到180~197bp的ITS2序列。使用
MEGA4.0软件对得到的ITS2序列进行对比,并对15个不同地点的亚洲小车蝗(Oedaleusasiaticus)种群进行比
较分析。结果表明:10种蝗虫的ITS2序列的碱基组成显示出对鸟嘌呤(G)和胞嘧啶(C)的偏好性;15个地点的亚
洲小车蝗种群之间差异小,仅有2个个体产生变异,共有11个变异位点,均为碱基的替换,占所测序列的5.67%。
15个种群聚类结果显示,13个种群为一支先与四子王旗种群聚在一起,再与正镶白旗种群相聚;说明ITS2序列在
蝗虫种下的遗传分化上为高度保守的序列,不适用于蝗虫种下遗传分化的研究。同属蝗虫之间的遗传距离为
0.0000,说明ITS2序列也不能区分同一属蝗虫。槌角蝗科先与网翅蝗科聚类再与斑翅蝗科相聚,最后与斑腿蝗科
相聚,反映了各科亲缘关系的远近。
关键词:蝗虫;rDNA-ITS2;亲缘关系
中图分类号:S763.31;S763.302 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2013)04-0805-07
ITS2SequenceAnalysisofTenGrasshopperSpeciesandDifferentGeographic
PopulationsofOedaleusasiaticusinInnerMongoliaGrassland
HANHai-bin,ZHOUXiao-rong,PANGBao-ping*
(ColegeofAgriculture,InnerMongoliaAgriculturalUniversity,Hohhot,InnerMongolia010019,China)
Abstract:InordertosystematicstudygrasshoppersinInnerMongoliaonamolecularlevel,therDNA-
ITS2sequencesof120individualsfrom10commongrasslandspeciesofInnerMongoliawereamplifiedand
a180~197bpITS2sequencewasobtainedbycomparingwithknowngrasshopper’sITS2inGenbank.
TheobtainedITS2sequenceswerealignedusingMEGA4.0andtheITS2sequencesofOedaleusasiaticus
populationsfrom15differentareaswereanalyzed.Thegrasshopper’sITS2sequenceshowedGCprefer-
ence.ThepopulationsofO.asiaticusfrom15differentareashadsolittledifferencesthatonlytwoindivid-
ualsvaried.Thenumberofvariationsiteswas11whichwerealbasesubstitutionsandmadeup5.67%of
detectedsequences.Clusteringresultsof15populationsshowedthat13populationswasfirstlyclustered
withapopulationfromSiziwangBanner,andfinalywithapopulationfromBaiBanner.Theseresultsin-
dicatedthatITS2wasahighlyconservedsequenceandnotsuitableforresearchongeneticdifferentiation
belowgrasshopperspecielevel.Geneticdistancesofgrasshopperspeciesinthesamegenuswere0.0000,
indicatingthatITS2sequencecouldnotbeusedforspeciesidentificationinthesamegenus.Gomphoceri-
daewasfirstlyclusteredwithArcypteridae,secondlywithOedipodidaeandfinalywithCatantopidae,
showingevolutionaryrelationshipsamongdifferentfamilies.
Keywords:Grasshopper;rDNA-ITS2;Geneticrelationship
内蒙古自治区有各类草原7880万hm2,可利用
面积6359万hm2,约占全国天然草原面积的1/4,
占全区土地总面积的67.49%,是我国最重要的畜
牧业生产基地之一。蝗虫是农田、草原上的毁灭性
收稿日期:2013-01-26;修回日期:2013-04-16
基金项目:国家公益性行业(农业)科研专项(200903021)资助
作者简介:韩海斌(1987-),男,内蒙古乌兰察布人,博士研究生,主要从事昆虫分子生态学研究,E-mail:hhb.25@163.com;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:pangbp@imau.edu.cn
草 地 学 报 第21卷
害虫[1-3],近年来,随着气候的异常,生态环境的日益
恶化,内蒙古草原蝗虫灾害连年大面积暴发成灾,已
成为自治区草原生态和畜牧业生产中最为严重的生
物灾害之一,对农牧民生活带来了巨大的损失[4]。亚
洲小车蝗(Oedaleusasiaticus)是北方地区的优势蝗
虫[5],更是内蒙古草原蝗虫的主要优势种,也是农牧
交错地带的重要经济害虫[6]和草原退化的指示种[7]。
李东伟等[8]运用RAPD标记、高书晶等[9-11]采用等位
酶技术、线粒体ND1序列和COⅠ序列,以及邰丽华
等[12]使用RAPD标记分别对亚洲小车蝗不同地理种
群的遗传多样性进行了研究分析。汪桂玲等[13]、高
书晶 等[14]、马 喜 平 等[15]、任 竹 梅 等[16]、李 春 选
等[17-18]、Chapco等[19]、Flook等[20]、Rowel等[21]和邵
红光等[22]分别采用不同的分子遗传学方法研究了蝗
总科不同蝗虫之间的亲缘关系和系统进化方向。
核糖体DNA(rDNA)是目前广泛使用的细胞
核DNA分子标记,rDNA单位由18S,5.8S,28S
RNA编码区、基因间隔区(IGS)、第1和第2转录
间隔区(ITS1和ITS2)、外转录间隔区(ETS)组成,
编码区的序列高度保守,间隔区的进化速度大约与
物种形成的进程相仿[23-25]。核糖体DNA中的内转
录间隔区(rDNA-ITS)序列的进化速率较快,可以
提供较丰富的变异位点和信息位点[26]。已有学者
使用ITS序列对昆虫的遗传结构进行研究[27],
Gómez-Zurita等[28]和李正西等[29]分别对鞘翅目叶
甲科的 Timarcha 属和赤眼蜂属(Trichogramma
Westwood)的不同种的ITS2序列进行了研究分析,
探讨它们之间的系统发生关系。王莉萍等[26]对美
洲斑潜蝇(Liriomyzasativae)不同地理种群的
ITS1序列进行了分析研究。然而,目前为止rDNA
序列分析还未用于蝗虫系统进化及遗传分化的研
究。因此,本研究对内蒙古地区常见的10种蝗虫的
rDNA-ITS2序列进行扩增、测序和比较分析。希望
从分子水平构建内蒙古地区的蝗虫系统进化关系,
以及不同地理环境和生态条件对亚洲小车蝗不同地
理种群遗传分化的影响,了解物种遗传分化的方向,
就能更好地对有害生物进行综合防治,从而为重灾
蝗区蝗虫的防治工作提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 供试虫源
供试蝗虫均采自内蒙古草原的自然种群,用养
虫笼活体带回实验室后,单头装入离心管中液氮处
理后40℃冷冻保存,具体信息如表1所示。
1.2 基因组DNA提取
取单头蝗虫后足股节,用液氮研磨成粉移入1.5
mL离心管中,使用天根dp304动物基因组DNA提
取试剂盒对草原蝗虫样本提取DNA,20℃下保存
备用。
1.3 PCR扩增反应体系和反应条件及产物检测
PCR反应体系为50μL:DNA模板2μL,10×
PCRBuffer5μL,dNTPmix (2.5mmol·L-1
each)4μL,上下游引物(10μmol·L-1)各2μL,
TaKaRaTaq(5U·μL-1)0.6μL(大连宝生物工
程有限公司),ddH2O补足至50μL。
上游引物(CAS5.8SFC:5′-TGAACATCGAC
ATTTYGAACGCACA-3′),下 游 引 物 (CAS28
SB1d:5′-TTCTTTTCCTCCCCTTATTAATATG
CTTA-3′),引物序列参考自文献[25],由上海生工
生物工程有限公司合成。
反应程序(BIO-RADPCR仪):95℃预变性3
min;94℃变性1min,55℃退火1min,72℃延伸1.5
min,共35个循环;72℃延伸8min,4℃保存。PCR
产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行检测(ADVANCE
水平电泳仪)
1.4 产物序列测定及序列分析
亚洲小车蝗每个种群取5头样本,其他9种草
原蝗虫各取5头样本,委托上海生工生物工程有
限公司对PCR产物进行测序,结果序列与 Gen-
Bank中已知蝗虫Chorthippusparallelus(登录号:
AY585651.1)、中华稻蝗(Oxyachinensis)(登录
号:AF385193.1)、日本稻蝗(Oxyajaponica)(登
录号:AF385194.1)、小稻蝗(Oxyahylaintricata)
(登录号:AF385196.1)、台湾小稻蝗(Oxyapodis-
ma)(登录号:AF385195.1)的ITS2序列对比得到
180~197bp的ITS2序列,使用 MEGA4.0软件
对蝗虫的ITS2序列进行比较分析,分别计算其碱
基含量和遗传距离,选取基于 Kimura-2-Parameter
双参数模型[30],根据遗传距离采用 UPGMA聚类
法构建系统进化树,同时用Bootstrap1000次检验
系统树中各分支的置信度[31],来推演系统发生
关系。
608
第4期 韩海斌等:内蒙古10种草原蝗虫和亚洲小车蝗不同地理种群的ITS2序列分析
表1 蝗虫样本采集信息
Table1 Colectingdataofgrasshoppersample
蝗虫种类
Grasshopperspecies
种群代码
Populationcode
采集地点
Colectinglocality
地理坐标
Geo-coordinates
海拔
Altitude/m
采集日期
Colectingdate
一、斑翅蝗科Oedipodidae
1、斑翅蝗亚科Oedipodinae
亚洲小车蝗Oedaleusasiaticus
OAKL 开鲁县KailuCounty N43°38′19.20″,E121°34′3.12″ 240 2010-08-05
OABZ 巴林左旗BaarinLeftBanner N43°47′27.99″,E119°11′32.14″ 691 2010-08-13
OABY 巴林右旗BaarinRightBanner N43°22′33.91″,E118°45′2.80″ 643 2010-08-13
OAKQ 克什克腾旗 HexigtenBanner N43°18′17.88″,E116°49′57.12″ 1249 2011-08-17
OADL 多伦县DuolunCounty N42°02′9.49″,E116°25′1.44″ 1324 2010-08-04
OABQ 正镶白旗ZhengxiangbaiBanner N42°13′7.08″,E115°06′18.42″ 1400 2011-08-16
OAHD 化德县 HuadeCounty N41°57′31.80″,E114°03′15.42″ 1461 2011-08-16
OAHQ 镶黄旗XianghuangBanner N42°19′21.22″,E114°4′57.12″ 1241 2010-07-20
OACH 察右后旗ChaharRightBackBanner N41°29′50.23″,E112°29′32.33″ 1536 2011-08-16
OASQ 四子王旗SiziwangBanner N41°46′41.04″,E111°49′38.40″ 1419 2010-08-10
OADM 达茂旗DarhanMumingganUnitedBanner N41°32′44.70″,E110°32′29.70″ 1476 2011-07-28
OAGY 固阳县GuyangCounty N41°28′16.80″,E109°44′19.20″ 1641 2011-07-28
OAWZ 乌拉特中旗 UratMiddleBanner N41°24′59.13″,E108°11′49.28″ 1364 2010-07-23
OAEQ 鄂托克旗OtogBanner N39°34′49.26″,E107°02′32.22″ 1652 2011-07-31
OAAZ 阿拉善左旗AlxaLeftBanner N38°52′1.20″,E105°48′5.04″ 1946 2011-07-30
2、痂蝗亚科Bryodeminae
鼓翅皱膝蝗
Angaracrisbarabensis
AB 四子王旗SiziwangBanner N41°46′41.04″,E111°49′38.40″ 1419 2012-08-09
红翅皱膝蝗
Angaracrisrhodopa
AR 四子王旗SiziwangBanner N41°46′41.04″,E111°49′38.40″ 1419 2012-08-09
白边痂蝗
Bryodemaluctuosumluctuosum
BL 达茂旗DarhanMumingganUnitedBanner N41°21′7.92″,E111°14′24.42″ 1613 2012-08-04
3、异痂蝗亚科Bryodemelinae
黄胫异痂蝗
Bryodemellaholdereriholdereri
BH 四子王旗SiziwangBanner N41°46′41.04″,E111°49′38.40″ 1419 2012-08-09
轮纹异痂蝗
Bryodemellatuberculatumdilutum
BD 察右中旗ChaharRightMiddleBanner N41°10′13.56″,E112°35′6.78″ 2042 2012-08-09
二、网翅蝗科Arcypteridae
网翅蝗亚科Arcypterinae
宽翅曲背蝗
Pararcypteramicroptera
meridionalis
PM 达茂旗DarhanMumingganUnitedBanner N41°21′7.92″,E111°14′24.42″ 1613 2012-08-04
三、槌角蝗科Gomphoceridae
槌角蝗亚科Gomphocerinae
宽须蚁蝗
Myrmeleotetixpalpalis
MP 达茂旗DarhanMumingganUnitedBanner N41°21′7.92″,E111°14′24.42″ 1613 2012-08-04
毛足棒角蝗
Dasyhippusbarbipes
DB 达茂旗DarhanMumingganUnitedBanner N41°21′7.92″,E111°14′24.42″ 1613 2012-08-04
四、斑腿蝗科Catantopidae
星翅蝗亚科Caliptaminae
短星翅蝗
Calliptamusabbreviatus
CA 达茂旗DarhanMumingganUnitedBanner N41°21′7.92″,E111°14′24.42″ 1613 2012-08-04
2 结果与分析
2.1 亚洲小车蝗不同地理种群的rDNA-ITS2序列
分析
亚洲小车蝗测序结果经比较、剪切后得到194bp
的rDNA-ITS2完整序列,测试的15个种群的75个
个体中仅有四子王旗和正镶白旗种群的2个个体产
生变异,共有11个变异位点,均为碱基的替换(包括2
个转换和9个颠换)(图1),占所测序列的5.67%。
序列中G+C含量(66%)高于 A+T含量(34%),
与已知GenBank中5种蝗虫的rDNA-ITS2序列碱
基组成特点基本一致(平均碱基含量G+C为67.9%,
708
草 地 学 报 第21卷
图1 亚洲小车蝗2个变异个体ITS2序列对比
Fig.1 AlignmentsofITS2sequencesoftwoindividualvariationsofOedaleusasiaticus
图2 10种蝗虫之间的ITS2序列对比
Fig.2 AlignmentsofITS2sequencesfromtengrasshopperspecies
注:种群代码同表1所列,下同
Note:PopulationcodeisthesameasthatinTable1,thesameasbelow
A+T为32.2%)。15个种群的聚类结果显示(图
3),13个地理种群共同聚为一支先与四子王旗种群
聚在一起,再与正镶白旗种群相聚。
2.2 10种草原蝗虫的rDNA-ITS2序列分析
内蒙古10种草原蝗虫测序结果经比较、剪切后
得到180~197bp的rDNA-ITS2完整序列,平均碱
基含量G+C为67.6%,A+T为32.3%。ITS2序
列之间差异显著,共有81个变异位点,其中毛足棒
角蝗(Dasyhippusbarbipes)、宽须蚁蝗(Myrmeleo-
tettixpalpalis)、宽翅曲背蝗(Pararcypterami-
cropterameridionalis)、短星翅蝗(Calliptamusab-
808
第4期 韩海斌等:内蒙古10种草原蝗虫和亚洲小车蝗不同地理种群的ITS2序列分析
breviatus)和亚洲小车蝗具有特异变异位点,特异变
异位点数为2~36个,其中宽须蚁蝗最少为2个,短
星翅蝗最多为36个;红翅皱膝蝗(Angaracrisrhodo-
pa)和鼓翅皱膝蝗(Angaracrisbarabensis)序列相同与
其他蝗虫之间有1个特异的变异位点(图2)。这些位
点均可作为蝗虫之间鉴别的分子标记。
图3 内蒙古亚洲小车蝗15个种群间基于遗传距离的UPGMA聚类图
Fig.3 UPGMAdendrogramof15OedaleusasiaticuspopulationsfromInner
Mongoliabasedongeneticdistance
由表3可知,10种蝗虫的遗传距离在0.0000~
0.2651之间,其中短星翅蝗和宽翅曲背蝗之间的距
离最大(0.2651),轮纹异痂蝗(Bryodemellatuber-
culatumdilutum)和黄胫异痂蝗(Bryodemellahol-
dereriholdereri)之间的距离与红翅皱膝蝗和鼓翅
皱膝蝗之间距离相同,都为0.0000。由10种蝗虫
的系统发育树可以看出(图4),红翅皱膝蝗和鼓翅
皱膝蝗与白边痂蝗(Bryodemaluctuosumluctuo-
sum)先聚在一起再与轮纹异痂蝗和黄胫异痂蝗
相聚为一支;毛足棒角蝗与宽须蚁蝗相聚再与宽
翅曲背蝗聚为一支;这2支相聚再与亚洲小车蝗
相聚;再与短星翅蝗聚在一起。结果表明,聚类
大致遵循同一属的蝗虫先相聚,再与同一亚科的
蝗虫聚类,再与同一科的相聚,槌角蝗科先与网
翅蝗科相聚,再与斑翅蝗科相聚,再与斑腿蝗科
聚类。
表3 10种蝗虫基于ITS2序列的遗传距离
Table3 GeneticdistancebasedonITS2amongtengrasshopperspecies
DB MP PM CA BL BD BH AR AB OA
DB - 0.0119 0.0171 0.0443 0.0194 0.0204 0.0204 0.0204 0.0204 0.0283
MP 0.0236 - 0.0133 0.0432 0.0183 0.0194 0.0194 0.0193 0.0193 0.0273
PM 0.0480 0.0297 - 0.0463 0.0224 0.0234 0.0234 0.0234 0.0234 0.0308
CA 0.2484 0.2399 0.2651 - 0.0362 0.0352 0.0352 0.0360 0.0360 0.0397
BL 0.0605 0.0542 0.0797 0.1786 - 0.0059 0.0059 0.0058 0.0058 0.0227
BD 0.0669 0.0605 0.0862 0.1709 0.0058 - 0.0000 0.0083 0.0083 0.0216
BH 0.0669 0.0605 0.0862 0.1709 0.0058 0.0000 - 0.0083 0.0083 0.0216
AR 0.0668 0.0605 0.0862 0.1781 0.0058 0.0117 0.0117 - 0.0000 0.0236
AB 0.0668 0.0605 0.0862 0.1781 0.0058 0.0117 0.0117 0.0000 - 0.0236
OA 0.1200 0.1130 0.1405 0.2086 0.0801 0.0735 0.0735 0.0865 0.0865 -
注:对角线以下为遗传距离,对角线以上为标准误
Notes:Databelowdiagonalaregeneticdistancesandabovediagonalarestandarderrors
3 讨论与结论
3.1 不同地理种群亚洲小车蝗rDNA-ITS2序列分
析
王莉萍等[26]和李正西等[29]对美洲斑潜蝇和赤
眼蜂的ITS研究提出,同一个体的不同拷贝间的
ITS序列遗传变异非常小,可忽略同一个体不同拷
贝之间的差异,所以本研究没有对同一个体不同拷
贝进行测定。本研究样本序列采用PCR产物直接
测序法,样本的纯化和序列测定由上海生工生物工
908
草 地 学 报 第21卷
图4 10种蝗虫基于UPGMA构建的系统树
Fig.4 UPGMAdendrogramoftengrasshopperspecies
程有限公司完成。结果经对比、剪切得到亚洲小车
蝗194 bp的ITS2完整序列,在15个种群的个体
中只有2个种群的2个个体发生变异,仅有11个变
异位点,因此推测对ITS2序列来说这11个位点是
亚洲小车蝗发生种群变异的活跃位点。序列中G+
C含量高于 A+T 含量,这与赤眼蜂[29]、褐飞虱
(NilaparvatalugensStal)、白背飞虱 (Sogatella
furciferaHorvnth)、灰飞虱(Laodelphaxstriatel-
lusFalen)[32]及米尔顿姬小蜂(Anselmellamiltoni
Girault)[33]的ITS2序列碱基组成相反。15个种群
的聚类结果显示(图3),13个地理种群共同聚为一
支先与四子王旗种群聚在一起,再与正镶白旗种群
相聚,说明地理差异与蝗虫ITS2序列的遗传分化
无显著相关性。因此,本研究认为该基因为高度保
守的序列,不适用于蝗虫种下遗传分化的研究,这一
结果与王莉萍等[26]和李正西等[29]对美洲斑潜蝇和
赤眼蜂的ITS研究结果一致。根据蝗虫ITS2序列
高度保守的特性,可以相对容易的对蝗虫残体以及
低龄蝗蝻进行分类、鉴定,对蝗虫的分子系统学有着
重要的意义。
3.2 10种蝗虫之间rDNA-ITS2序列分析
10种蝗虫的ITS2序列分析结果表明,蝗虫的
ITS2序列显示出一定的GC偏好性。遗传距离为
0.0000~0.2651,说明同一属的蝗虫之间ITS2序
列没有差异。从它们的聚类结果来看,同一属的蝗
虫相聚,再与同一亚科的蝗虫聚类,再与同一科的相
聚。但是结果中显示亚洲小车蝗与斑翅蝗科其他蝗
虫的亲缘关系较远,与高书晶等[14]对内蒙古8种蝗
虫RAPD标记研究结果中,亚洲小车蝗与白边痂蝗
相聚再与聚在一起的红翅皱膝蝗和鼓翅皱膝蝗相聚
存在差异,可能是标记方法不同所致。本研究结果
显示,槌角蝗科先与网翅蝗科相聚,再与斑翅蝗科相
聚,再与斑腿蝗科聚类,表明了各科蝗虫的亲缘关系
的远近,这一结果与汪桂玲等[13]对蝗总科5种蝗虫
的比较研究结果一致。而任竹梅等[16]对线粒体
Cytb基因序列研究及印红等[34]对蝗总科部分种类
16SrDNA序列研究认为,槌角蝗科先与网翅蝗科
相聚,再与斑腿蝗科相聚,再与斑翅蝗科聚类。
综上所述,关于DNA序列的研究,已经广泛的
应用于昆虫分子系统学的研究中,并取得了一定成
果。但是不同的序列所得结果并不一致,在进一步
的研究中,应该增加研究内容所涵盖的信息量,以期
为分子系统学的研究提供依据。
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(责任编辑 李美娟)
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