全 文 ：栀子及其近缘茜草科植物、混伪品的 rDNA－ITS2 序列分析*
黄易1，唐灿1＊＊，傅俊江2，成竞梁2，张春1，刘芳1，何峰1
(1．四川医科大学药学院，泸州 646000;2．四川医科大学医学基础研究中心，泸州 646000)
摘要 目的:利用 rDNA－内转录间隔区 2(internal transcribed spacer 2，ITS2)序列对栀子及其近缘茜草科植物、混伪品进行快
速鉴定。方法:对研究材料 ITS2 片段进行聚合酶链式反应(PCＲ)扩增并双向测序，所得序列经 CodonCode Aligner 拼接后，序
列变异位点采用 PAUP 4． 0b10 进行统计分析，利用 MEGA 5． 0 软件进行数据分析，并构建邻接(NJ)树，再利用已建立的 ITS2
数据库及其网站预测 ITS2 二级结构。结果:对栀子及其近缘茜草科植物、混伪品 ITS2 序列长度为 201 ～ 235 bp，系统发育树上
显示不同来源的样本根据亲缘关系的远近各聚一支，表现出单系性;而同时又与混伪品明显分开。比较 ITS2 二级结构发现，
栀子及其近缘茜草科植物、混伪品在 4 个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论:rDNA－
ITS2 可以方便快捷地鉴定栀子及其近缘茜草科植物、混伪品。
关键词:栀子;茜草科;rDNA－ITS2;DNA内转录间隔区;药材 DNA鉴定;二级结构;植物分子鉴定;基因检测
中图分类号:Ｒ 917 文献标识码:A 文章编号:0254－1793(2015)－1709－07
doi:10． 16155 / j． 0254－1793． 2015． 10． 04
* 四川省科技厅－泸州市政府－泸州医学院三方联合专项－四川优质栀子产能扩大，高品质遗传特征保持稳定的关键技术与高附加值转
化应用产品的开发研究(No． 14ZC0045);四川省科技支撑计划项目－巴中产栀子品质与规范化种植研究(No． 2010SZ0049);泸州市政
府－泸州医学院联合专项－优质栀子泸州引种推广、现有品种品质提高之集成技术创新及转化应用产品开发研究(No． 2013LZLY－
K69);四川省教育厅重点科研项目－川浙赣产栀子中乌索酸含量的比较研究(No． 2005A071);四川省科技支撑计划项目－巴中产栀子
种质资源保护与评价研究(No． 2011SZ0048)
＊＊ 通信作者 Tel:18982455783;E－mail:Tang9670625@ 163． com
第一作者 Tel:15196081737;E－mail:15196081737@ 163． com
Identification of gardenia and relative plants in Ｒubiaceae and its
adulterants using DNA barcoding method based on ITS2 sequence*
HUANG Yi1，TANG Can1＊＊，FU Jun－jiang2，CHENG Jing－liang2，
ZHANG Chun1，LIU Fang1，HE Feng1
(1． Pharmacy School of Sichuan Medical University，Luzhou 646000，China;
2． The Ｒesearch Center for Preclinical Medicine，Sichuan Medical University，Luzhou 646000，China)
Abstract Objective:To rapidly identify gardenia and relative plants in Ｒubiaceae as well as its adulterants using
DNA barcoding method based on internal transcribed spacer 2(ITS2)sequence． Methods:ITS2 sequence of test
samples was amplified by polymerase chain reaction(PCＲ)and sequenced bidirectionally． Sequence assembly and
consensus sequence generation were performed by CodonCode Aligner． The variable sites of the sequence were sta-
tistically analyzed by PAUP 4． 0b10． The related data analysis was performed using software MEGA 5． 0 and the
phylogenetic tree was constructed by using the neighbor－joining(NJ)method． The ITS2 secondary structure was pre-
dicted using ITS2 web server． Ｒesults:The length of ITS2 sequence of gardenia，relative plants in Ｒubiaceae and its
adulterants was 201－235 bp． The samples with close genetic relationship were gathered together on the NJ tress，
showing monophyletic，and simultaneously distinguished from their adulterants． The comparison of the ITS2 seconda-
ry structure between gardenia，its relative plants in Ｒubiaceae and its adulterants revealed that gardenia was obvi-
ously distinguished from the adulterants in terms of number，size，position of loop，and the angle of helix exsertion．
Conclusion:ITS2 barcode could be used to identify Gardenia and relative plants in Ｒubiaceae and its adulterants
effectively．
—9071—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(10)
Keywords:Gardenia jaminoides;Ｒubiaceae;rDNA－ ITS2;DNA－ internal transcribed spacer;secondary structure;
herbs DNA identification;plant molecular identification;genetic testing
栀子为茜草科植物栀子(Gardenia jasminoides
Ellis)的干燥成熟果实［1］，本草始载于《神农本草
经》。其性寒味苦，无毒，入心、肝、肺、胃经，能清
热泻火、凉血，具泻火除烦、清热利湿、凉血散瘀之
功，临床用于热病心烦、急性黄疸型肝炎、膀胱炎、
耳赤肿痛、上消化道出血及局部出血，外治扭挫伤
疼。根据现代药理研究证实，栀子具有保肝、利
胆、解热、抗炎、抗病原微生物、镇痛、镇静等作
用［2］。
栀子在我国分布较广，主产于江西、四川、重庆、
湖北、浙江、贵州、湖南、福建等省。由于生长在不同
的环境，使其习性、叶的形状及大小、果实的形状及
大小均发生一些变异。其变异主要可分为 2 个类
型:一类通常称为“山栀子”，果卵形或近球形，较
小;另一类通常称为“水栀子”，果椭圆形或长圆形，
较大。栀子与金樱子形态也很相似，两者极易混淆，
影响了用药的准确性。袁丽华［3］曾对金樱子和栀
子的表观性状，显微、理化和成分进行鉴别。但这些
方法操作较复杂。
在已报道的文献中多采用硅胶干燥的叶片或其
他新鲜组织为对象进行 DNA 的提取、扩增和测序，
以获得可用于分析的 DNA 条形码序列［4 － 5］。研究
结果表明 rDNA－ ITS2 已成为植物类药材有效的鉴
定工具，其鉴定能力在多个科属基原植物及药材的
鉴定中均得到了验证［6］。ITS2 是真核生物 rDNA上
的一段顺反子，位于 5． 8S 和 28SrＲNA 之间，其长度
相对保守，具有较多的碱基信息，但核苷酸顺序变化
较大，能够提供较丰富的信息位点，而被广泛应用;
由于该序列具有适合扩增和测序的长度，有利于对
发生降解的样品进行扩增［7］，ITS2 片段在物种水平
的变异较快，有更多的突变位点以区分不同的物种，
因此，在中药材的物种鉴定方面具有潜在的研究
价值。
目前，基于 ITS2 序列的植物类药材 DNA 条形
码鉴定研究开展得较多，孙稚颖等基于 ITS2 序列
的羌活及其混伪品的 DNA 条形码鉴定［8］，罗焜等
开展的多基原药材秦艽 ITS2 条形码鉴定研究［9］，
谷巍等开展的芡实及其近缘种药材 ITS2 条形码鉴
定研究［10］，邬兰等［11］使用 ITS2 序列有效地鉴别
中药材佩兰及其混伪品。我国对栀子及其茜草科
种质资源研究甚少，基于分子水平的遗传多样性
分析鲜有报道。有李栎等［12］对海南地区的茜草科
黎族药用植物 11 个种 16 个样品进行快速鉴定。
本研究小组利用 ISSＲ 分析对巴中、江津和纳溪这
3 个不同产地栀子的亲缘关系进行研究［13］。采用
ISSＲ分子标记方法对栀子进行了分类鉴定和系统
学研究，多态性水平较低，存在一定的局限性，已
不能满足日益复杂的分类需求。而利用 rDNA－
ITS2 序列是一种通过短的标准的 DNA 序列作为
标记来实现物种快速准确鉴定的方法，具有操作
简易，可重复性强，结果稳定可靠等优点［14］。本研
究采用 ITS2 序列来鉴定栀子及其近缘茜草科植物
(水栀子、白花蛇舌草、巴戟天、鸡矢藤、香果树)、
混伪品(金樱子)，为茜草科植物分子鉴定研究提
供了新的方法。
1 仪器
1． 1 仪器、试剂与药材 BIO－ＲAD 公司 Universal
Hood Ⅱ凝胶成像系统，基因有限公司(Gene Compa-
ny Limited)PCＲ 仪，北京六一仪器厂 76662GC114
电泳仪，北京六一仪器厂 DYCP－31C 电泳槽，国华
电器有限公司 HH－2 数显恒温水浴锅，Mini－6K 微
型离心机，LD－HL－8 专用纯化水机，XK96－A 快速
混匀器，NanpDrop ND－1000 紫外分光光度仪，New
Brunswick Eppendrof centrifuge 5418 高速离心机，德
国 Eppendorf微量移液器(2． 5、10、20、100、200、1000
μL);MDF－382E－80 ℃冰箱，ES－120 电子天平，哈
东联 DL － CJ － 1NDⅡ超净工作台。
1． 2 试剂 植物基因组 DNA提取试剂盒(北京天
根生化科技有限公司，批号 DP305)，引物(上海生
工生物工程股份有限公司合成)，琼脂糖(批号
3002，规格 100 g)，核酸染料 Goldview(批号 D0125，
规格 1 mL)，2 × Tap PCＲ MasterMix(批号 KT201)，
PCＲ用水(高压灭菌双蒸水)。
1． 3 药材 样品来自四川巴中、纳溪、泸县，江西、
湖北、重庆等地方，药用植物 9 个种 25 个样品为实
验材料，每一种样品提取 3 份，所有样品经课题组蒲
清荣副主任中药师鉴定，2 个核酸序列样品来源于
GenBank，栀子的 GenBank 号为 GQ434647，金樱子
的 GenBank 号为 GQ43465。材料的详细信息见
表 1。
—0171— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(10)
表 1 样品的编号及对应的信息
Tab． 1 Number and the corresponding information of the samples
编号
(No．)
样品名称
(sample name)
样品产地
(sample location)
GQ－SC1
GQ－SC2
GQ－SC3
GQ－SC4
GQ－SC5
GQ－SC6
GQ－SC7
GQ－SC8
GQ－SC9
GQ－SC10
GQ－SC11
GQ－SC12
GQ－SC13
GQ－CQ
GQ－JX
GQ－HB
ＲL－SC1
ＲL－SC2
ＲL－SC3
ＲL－SC4
HD－SC
MH－SC
PS－SC
GJ－SC1
GJ－SC2
GJ－SC3
ＲC－SC
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
观赏栀子(Gardenia jasminoides)
狭叶栀子(Gardenia stenophylla)
卵叶栀子(Gardenia jasminoides)
大花栀子(Gardenia jasminoides Ellis var． grandiflora Nakai)
小叶栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
栀子(Gardenia jasminoides)
金樱子(Ｒosa laevigata)
金樱子(Ｒosa laevigata)
金樱子(Ｒosa laevigata)
金樱子(Ｒosa laevigata)
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)
巴戟天(Morinda officinalis)
鸡矢藤(Paederia scandens)
水栀子(Gardenia jasminoides var． radicans Makino．)
水栀子(Gardenia jasminoides var． radicans Makino．)
水栀子(Gardenia jasminoides var． radicans Makino．)
香果树(Emmenopterys henryi)
四川巴中(Bazhong，Sichuan)
四川广安(Guang’an，Sichuan)
四川纳溪(Naxi，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川泸州(Luzhou，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川纳溪(Naxi，Sichuan)
四川广安(Guang’an，Sichuan)
四川纳溪(Naxi，Sichuan)
四川纳溪(Naxi，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
GenBank:GQ434647
重庆市江津(Jiangjin，Chongqing)
江西省赣州(Ganzhou，Jiangxi)
湖北孝感(Xiaogan，Hubei)
GenBank:GQ43465
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川峨眉山(Emei Mountain，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川泸县(Luxian，Sichuan)
四川纳溪(Naxi，Sichuan)
四川巴中(Bazhong，Sichuan)
四川峨眉山(Emei Mountain，Sichuan)
2 方法
2． 1 DNA 提取 用北京天根生化植物基因组
DNA提取试剂盒，按其说明步骤进行提取，将每个
栀子材料及茜草科其他植物、混伪品逐一提取
DNA。NanpDrop 紫外分光光度仪测定 OD260 /OD280
比值及 DNA浓度，1%琼脂糖电泳检测。 － 20 ℃冰
箱保存，备用。提取出来的 DNA，经电泳检测，均是
单一的条带，没有杂带。
2． 2 PCＲ 扩增及测序 PCＲ 扩增、测序引物一
致，正向引物为 5－GCATCGATGAAGAACGCAGC－
3，反向引物为 5－TCCTCCGCTTATTGATAT－3，由
上海生工有限公司合成引物。PCＲ 反应总体积 25
μL，其混合物成分为 2 × Tap PCＲ MasterMix 12
μL，高压灭菌双蒸水 9 μL，正反引物各 1 μL，DNA
模板 2 μL;扩增程序为 PCＲ 程序:94 ℃(预热 5
min)，94 ℃(变性 30 s)，56 ℃(退火 30 s)，72 ℃
(延伸 45 s)，72 ℃(后延伸 10 min)，40 cycles，
4 ℃保存。PCＲ 产物用琼脂糖，1 × TAE 缓冲液，
Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统成像记录。PCＲ产
物直接送上海生工有限公司进行双向测序。测序
引物同 PCＲ引物。
2． 3 数据处理 测序峰图利用 CodonCode Aligner
V 3． 0(CodonCode Co，美国)校对拼接，去除引物区。
然后，将所有序列用软件 MEGA 5． 0(molecular evo-
lutionary genetics analysis)分析比对并基于 K－2－ P
模型进行遗传距离等分析，用邻接(NJ)法构建系统
聚类树，利用 Bootstrap(1 000 次重复)检验各分支
的支持率。ITS 序列采用基于隐马尔可夫模型的
HMMer注释方法去除两端 5． 8S 和 28S 区段即可获
得 ITS2 间隔区序列［6］。根据 Koetschan 等建立的
ITS2 数据库及其网站预测栀子及其茜草科植物、混
伪品的 ITS2 茎环二级结构［15］。
3 结果与分析
3． 1 PCＲ的扩增效率 PCＲ 扩增产物经 1%的琼
—1171—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(10)
脂糖凝胶电泳分析长度相差不大，只出现均在 300
bp左右，并且条带清晰，无杂带，见图 1。
图 1 样品 ITS2 序列 PCＲ扩增电泳图
Fig． 1 PCＲ amplification of ITS2 from samples
M． Marker 1． GQ－SC6 2． GQ－SC7 3． GQ－SC8 4． GQ－SC9 5． MH－SC
6． PS－SC 7． GQ－SC10 8． GQ－SC11 9． GQ－SC12 10． ＲL－SC2 11． HD－
SC 12． ＲC－SC 13． GJ－SC1 14． GJ－SC2 15． GQ－SC1 16． GQ－SC2 17．
GQ－SC3 18． GQ－SC4 19． GQ－SC5 20． GQ－CQ 21． GQ－JX 22． GQ－HB
3． 2 序列比对 将栀子与近缘茜草科植物、混伪品
进行 ITS2序列比(图 2)，种内存在 2 个变异位点，重
庆栀子、巴中栀子与其他栀子分别为 46 bp处 G－T－C
变异，所以该位点可以区分出三者;水栀子 GJ－SC2
与其他栀子在 217 bp 处存在 T－G变异，可以加以区
别。对栀子药材与金樱子混伪品种间序列进行比对
后，变异位点有多个，很容易区分开来;近缘物种白花
蛇舌草、巴戟天、香果树与栀子变异位点有多个，也比
较容易区分开来，变异位点均在图上用红色标出。
3． 3 栀子药材种内及种间变异分析 栀子及其茜
草科植物、混伪品种间序列长度为 201 ～ 235 bp，其
中巴戟天序列最长，GC含量为 54． 9% ～ 75． 0%，栀
子 ITS序列种内变异较少，但与其他近缘物种及混
伪品的种间变异位点较多，经 MEGA 软件比对共有
172 处。本研究比较了栀子以及茜草科植物、伪品
金樱子的 ITS2 序列比对后的长度，GC 含量平均值、
保守位点个数和变异位点个数等，其存在较多的变
异位点，序列变异位点采用 PAUP 4． 0b10 进行统
计。信息见表 2。
图 2 栀子与近缘茜草科植物、混伪品进行 ITS2 序列比
Fig． 2 Comparison on ITS2 sequences of plants of gardenia and related species in Ｒubiaceae and its adulterants
—2171— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(10)
表 2 栀子以及茜草科植物、混伪品 GC含量平均值和长度
Tab． 2 GC contents and lengths of ITS2 of gardenia，and related species in Ｒubiaceae and its adulterants
样品
(samples)
ITS2 长度
(length of ITS2)/bp
平均 GC含量
(average GC content)/%
保守位点个数
(number of conservative sites)
变异位点个数
(number of mutation sites)
栀子(Gardenia jasminoides)
金樱子(Ｒosa laevigata)
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)
巴戟天(Morinda officinalis)
鸡矢藤(Paederia scandens)
香果树(Emmenopterys henryi)
201
215
214
235
232
215
74． 1
55． 3
73． 4
54． 9
75． 0
70． 7
199
123
146
150
144
162
2
100
55
51
57
39
3． 4 物种间 ITS2 序列 K－2P 遗传距离比较 利用
MEGA 5． 0 分析 ITS2 序列，基于 Kimura－2－parame-
ter(简称:K－2P)模型计算遗传距离，K－2P 平均距
离为 0． 181，栀子种内最小 K－2P 距离为 0． 000，种
内最大的 K－2P距离为 0． 005，种内平均 K－2P 距离
为 0． 002，栀子与其他近缘物种茜草科植物的种间
最小 K－2P距离为 0． 187，种间最大 K－2P距离为 0．
286，种间平均 K－2P 距离为 0． 244。栀子和混伪品
金樱子之间种间最小 K－2P距离为 0． 429，种间最大
K－2P距离为 0． 495，平均 K－2P 距离为 0． 464。其
中重庆栀子、四川巴中栀子、水栀子与其他栀子遗传
距离较近，K－2P 距离为 0． 005，而金樱子与栀子距
离较远。栀子的种内最大 K－2P距离远小于与混伪
品间的最小 K－2P 距离，说明了基于 ITS 序列能将
栀子和混伪品区分开来。种间变异较大，能与其他
同属近缘物种及混伪品均能区分开来。其他的栀子
与 GQ－SC2 有一样的 K－2P遗传距离，所以省略，未
列出。详细信息见表 3。
表 3 栀子及其茜草科植物、混伪品 ITS2 的种内种间 K－2P距离
Tab． 3 Genetic distances of ITS2 sequences of plants of gardenia，Ｒubiaceae and its adulterants
1． GQ－SC13 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
2． GQ－SC1 0． 005
3． GQ－SC2 0． 000 0． 005
4． GQ－CQ 0． 005 0． 005 0． 005
5． GJ－SC2 0． 005 0． 011 0． 005 0． 011
6． ＲC－SC 0． 187 0． 192 0． 187 0． 192 0． 192
7． MH－SC 0． 247 0． 253 0． 247 0． 253 0． 253 0． 280
8． PS－SC 0． 275 0． 280 0． 275 0． 280 0． 275 0． 291 0． 236
9． HD－SC 0． 264 0． 264 0． 264 0． 258 0． 269 0． 286 0． 242 0． 308
10． ＲL－SC1 0． 434 0． 429 0． 434 0． 434 0． 429 0． 429 0． 434 0． 467 0． 445
11． ＲL－SC2 0． 467 0． 462 0． 467 0． 467 0． 462 0． 462 0． 462 0． 489 0． 473 0． 093
12． ＲL－SC3 0． 456 0． 451 0． 456 0． 456 0． 451 0． 445 0． 451 0． 500 0． 473 0． 077 0． 044
13． ＲL－SC4 0． 495 0． 489 0． 495 0． 495 0． 489 0． 500 0． 484 0． 533 0． 500 0． 121 0． 082 0． 071
3． 5 聚类分析 基于 ITS2 序列，利用 MEGA5． 0 构
建的 NJ系统聚类树(图 3)显示，可以看出，除金樱
子以外，其他样本均被聚为 1 枝，供试样本各种种内
样本均分别聚在 1 支，表现出单系性。其中不同来
源的栀子样品聚在 1 支，自展支持率达到 99%，表
现出单系性。同时，香果树与栀子聚在一起，支持率
为 95%，说明栀子和香果树有很高的亲缘性。鸡矢
藤与巴戟天聚在一起，白花蛇舌草单独为 1 支，混伪
品 4 个样本的金樱子分别聚为 1 支，支持率为
99%，表现出单系性。通过树状图可以明显看出，对
栀子及其近缘茜草科植物、混伪品很容易区别开来，
因此 rDNA－ITS2 能用于栀子及其近缘茜草科植物、
混伪品的鉴定。
3． 6 ITS2 序列二级结构 在比较样本中各种种
内 ITS2 二级结构(图 4)时发现，ITS2 二级结构结果
可以看出所有物种的二级结构均为 1 个中心环及 4
个螺旋区构成，它们之间结构差异较大，每个螺旋上
又有或多或少的大小不一的茎、环结构、位置以及螺
旋发出时的角度均各有不同。种内无明显差异;种
间存在明显差异。重点差异存在于香果树样本
ITS2 二级结构在中心环上有多出一短茎，因此，依
据 ITS2 二级结构，可以直观地鉴别栀子及其近缘茜
草科植物、混伪品。
—3171—药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(10)
图 3 基于 ITS2 序列构建的主流栀子及其近缘茜草科植物、混伪品
的邻接(NJ)树(bootstrap 1 000 次重复，枝上数值仅显示自展支持率
≥50%，采用 K－2P距离法)
Fig． 3 Dendrogram of gardenia and related species in Ｒubiaceae and its
adulterants constructed with ITS2 sequences using NJ method(The boot-
strap scores(1 000 replicates)are only shown(≥50%)for each branch，
using the K－2P distance method)
4 讨论
4． 1 ITS2 序列在鉴别栀子中的作用 因采用传统
的药材鉴定方法比较困难，而 DNA条形码鉴定技术
因其通用、快捷等优势，已成为近年来分子生药鉴定
的热点，尤其对于缺乏遗传背景信息的中药材样品
具有较好的鉴别能力［16］。中药 DNA 条形码鉴定研
究是以 ITS2为主体条形码序列鉴定中药材的方法体
系，能够实现对中药材及其基原物种的准确鉴定，
Chen等［17］通过对 753 个属 4 800 个种内 6 600 个药
用植物样本的研究表明，ITS2在种水平的鉴定效率达
到 92． 7%，因此推荐为药用植物的标准条形码。Luo
等［18］以芸香科 72 属 192 种 300 个样本为研究对象，
通过对热点候选条形码(matK、rbcL、psbA－ trnH、
rpoC1、ycf5、ITS2、ITS)的筛选研究表明，ITS2 条形码
具有良好的 PCＲ 效率和测序成功率，在所考察的序
列中具有最大种间变异和最小种内变异，且两者存在
显著差异，具有最高的物种鉴定成功率。本研究中，
利用通用引物对栀子及其近缘茜草科植物、混伪品
ITS2序列扩增，得到了 100%的扩增效率，测序质量
好。从NJ系统聚类树上看出，ITS2序列构建NJ系统
聚类树能将栀子及其近缘茜草科植物、混伪品分别聚
类，且各近缘属物种均能聚在具有支持率较高的单系
分支中，因此，ITS2 序列较适用于栀子及其近缘茜草
科植物、混伪品物种的鉴别。
4． 2 栀子及其近缘茜草科植物、混伪品间的分子鉴
别 作为 DNA条形码序列必须是种间差异比较大，
便于区分;种内差异比较小，从而使种间与种内变异
有个很好的界定［19］。本文应用 DNA 条形码 ITS2
图 4 主流栀子及其近缘茜草科植物、混伪品 ITS2 预测序列的二级结构比较
Fig． 4 Comparison on ITS2 secondary structure among gardenia and related species in Ｒubiaceae and its adulterants
—4171— 药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2015，35(10)
序列片段对中药材栀子及其近缘茜草科植物、混伪
品进行了鉴别研究，发现栀子的种内平均 K－2P 距
离为 0． 002，种内最大 K－2P 距离 0． 005，种间混伪
品平均 K－ 2P 距离 0． 464，种间最小 K－ 2P 距离
0． 429;栀子的种内最大 K－2P 距离远小于种间混伪
品最小 K－2P距离。在序列对比中，水栀子 GJ－SC2
与其他栀子在 217 bp 处存在 T－G 变异，可以加以
区别，而其他 2 个样品无此变异，可能是此 2 个样品
水栀子与栀子的叶片形态极其相似，而且不同的地
域采集样品等干扰因素导致肉眼很难准确鉴别，通
过本研究能够较准确区分栀子和水栀子，或许是本
研究的一个重要的价值所在。虽然基于 NJ 系统聚
集树将栀子及其近缘茜草科植物、混伪品区分开，但
对于不同来源的栀子样品，ITS2分析方法不能很好地
区分，也许对同一属下的不同物种区分能力可能相对
较低，此点或许是 ITS2 的一个缺陷。未来在栀子属
DNA条形码的研究中，将 ITS2 序列与其他条形码序
列做适当的结合应会得到更好的效果，有待于进一步
立项研究。李栎等［12］利用 ITS2 条形码序列对茜草
科黎药植物进行了鉴定，但仅对茜草科的物种进行过
研究，而对于其混伪品如金樱子等混伪品物种没有涉
及。综合以上结果，rDNA－ITS2序列可以作为栀子及
其近缘茜草科植物、混伪品的鉴定。另外，每批样品
至少重复测序 3 次，显示 ITS2 条形码在多样本的基
础上，通过多次 PCＲ扩增实验均能获得稳定的结果，
因此能够为栀子药材的有效鉴定提供依据。
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(本文于 2014 年 12 月 29 日收到)
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