全 文 ：第１９卷　第６期
　Ｖｏｌ．１９　 Ｎｏ．６
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１１年　 １１月
　 Ｎｏｖ．　　２０１１
应用ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术扩增
落地生根叶片的总ＲＮＡ
钟天秀，曾会明＊
（北京林业大学草坪研究所，北京　１０００８３）
摘要：以落地生根（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ）未长芽和长芽的叶片为材料，提取落地生根的总ＲＮＡ，采用ＳＭＡＲ－
Ｔｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术合成ｃＤＮＡ第１链，优化扩增第２链，通过设置梯度ＰＣＲ扩增循环数，电泳分析后鉴定ｃＤＮＡ
质量。结果表明：未长芽和长芽的材料各１μｇ总ＲＮＡ分别成功扩增质量较高的双链ｃＤＮＡ。此方法的应用解决
了研究材料有限的问题，可由微量的总ＲＮＡ扩增出足够多的高质量双链ｃＤＮＡ，为进一步从基因水平研究落地生
根奠定基础。
关键词：ＲＮＡ；ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成；落地生根
中图分类号：Ｑ５２　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１１）０６－１０５１－０４
Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｌｅａｖｅｓ　ｏｆ　Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ
Ｕｓｉｎｇ　ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ＺＨＯＮＧ　Ｔｉａｎ－ｘｉｕ，ＺＥＮＧ　Ｈｕｉ－ｍｉｎｇ＊
（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｕｒｆ　Ｇｒａｓｓ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｂｅｉｊｉｎｇ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８３，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ　ｌｅａｖｅｓ　ｗｉｔｈ　ｏｒ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｂｕｌｂｉｆｅｒｏｕｓ
ｓｐｕｒｓ．Ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ－ｓｔｒａｎｄ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｓ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ｓｕｐｅｒ　ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｗａｓ　ｅｖａｌｕａｔｅｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｇｒａｄｉ－
ｅｎｔ　ｏｆ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｃｙｃｌｅｓ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ｈｉｇｈ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｓ　ｃＤＮＡ　ｗｅｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ
１ｕｇ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ．Ｔｈｉｓ　ｍｅｔｈｏｄ　ｃａｎ　ｓｏｌｖｅ　ｔｈｅ　ｐｒｏｂｌｅｍ　ｏｆ　ｌｉｍｉｔｅｄ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ　ａｓ　ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｈｉｇｈ－ｑｕａｌｉｔｙ
ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｓ　ｃＤＮＡ　ａｒｅ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｆｒｏｍ　ｓｍａｌ　ａｍｏｕｎｔｓ　ｏｆ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ．Ｔｈｉｓ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ　ａｌｏｗｓ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｒｅ－
ｓｅａｒｃｈ　ｏｆ　Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ＲＮＡ；ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ
　　落地生根（Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ）为景天
科（Ｃｒａｓｓｕｌａｃｅａｅ）落地生根属（ＢｒｙｏｐｈｌｌｕｍＳａｌｉｓｂ）
的一种极易栽培的观赏植物，落地生根叶片的汁液
具有广谱杀菌作用 ，从该植物中分离得到ｂｒｙｏｔｏｘ－
ｉｎｃ（ｂｒｙｏｐｈｙｌｉｎ　Ａ）对癌细胞有显著的抑制作用［１］。
有关落地生根的化学成分和药理作用已有一些研究
报道［２］，但关于落地生根叶片长芽的分子机制研究
尚未见报道。由于落地生根总ＲＮＡ的提取较困难，
难以获得足够量的ＲＮＡ，本文应用高效的ＳＭＡＲ－
Ｔｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术建立微量ＲＮＡ扩增大量ｃＤ－
ＮＡ，为下一步文库的构建及基因筛选提供有力的保
证。
１　材料与方法
１．１　材料
试验材料为落地生根，试验设干旱（叶片长芽）
和正常（叶片不长芽）２个处理。２个处理的落地生
根材料均由同一株落地生根繁殖而成。所有使用的
器具如刀片、锡箔纸，均经过灭ＲＮＡ酶处理。提取
ＲＮＡ试剂由本实验室配置，ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成
试剂盒购自Ｃｌｏｎｔｅｃｈ公司。氯仿、乙醇等试剂购自
北京九州同业生物技术公司。
１．２　总ＲＮＡ的提取
ＲＮＡ的提取方法：分别称取叶片长芽和不长芽
收稿日期：２０１１－０４－０６；修回日期：２０１１－０６－２０
基金项目：“十一五”国家８６３计划项目（２００９ＡＡ１０Ｚ１０９）资助
作者简介：钟天秀（１９８６－），女，四川内江人，硕士研究生，研究方向为草坪草生物技术育种，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｏｎｇｘｉｎｂｉ＠１６３．ｃｏｍ；＊通信作者
Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｃｉｎｆｏ＠ｂｊｆｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
草　地　学　报 第１９卷
的落地生根各２００ｍｇ，液氮研磨充分粉碎，取液氮
预冷的１．５ｍＬ离心管收集粉末，迅速加入１ｍＬ预
热的裂解缓冲液 （硼酸钠十水 ０．１ Ｍ，ＥＤＴＡ
０．２５％，ＳＤＳ　０．５％，脱 氧 胆 酸 钠 ０．５％，ＤＴＴ
０．２５％，ＩＧＥＰＡＬ　ＣＡ－６３０　０．５％，ＰＶＰ（ＭＷ　４０ＫＤ
１％），室温振荡３０ｓ；加入７．５μＬ蛋白酶 Ｋ（２０
ｍｇ·ｍＬ－１），４２℃振荡９０ｍｉｎ；加入８０μＬ　２Ｍ 氯
化钾低温振荡３０ｍｉｎ；１２０００ｒｐｍ，４℃离心２０ｍｉｎ；
取上清放入新的１．５ｍＬ离心管中，放入４℃环境下
过夜沉淀 ＲＮＡ；１２０００ｒｐｍ，４℃离心４５ｍｉｎ；弃去
上清，将沉淀溶于５０μＬ无ＲＮａｓｅ水中；加入５μＬ
３Ｍ的醋酸钠和５０μＬ的氯仿；室温下震荡３０ｓ；
１２０００ｒｐｍ，４℃离心５ｍｉｎ；去４０μＬ的上清液放入
一个新的１．５ｍＬ离心管中，向原管中加入４０μＬ
的ＲＮａｓｅ水，加入４μＬ　３Ｍ 的醋酸钠和４０μＬ的
氯仿；室温下震荡３０ｓ；１２０００ｒｐｍ，４℃离心５ｍｉｎ；
取上清液４０μＬ放入一个新的１．５ｍＬ离心管中；
合并２管得到８０μＬ的上清液，加入８μＬ的醋酸钠
和８０μＬ的异丙醇，上下颠倒混匀几次；冰浴３ｈ；
１４０００ｒｐｍ，４℃离心３０ｍｉｎ；弃去上清，加入２０μＬ
的乙醇，混匀，室温下１２０００ｒｐｍ离心３０ｓ；弃去上
清，室温下１２０００ｒｐｍ离心３０ｓ；室温下将样品吹干
１０ｍｉｎ；将总 ＲＮＡ重悬于１０μＬ无 ＲＮａｓｅ水中。
取２μＬ总ＲＮＡ电泳检测。
１．３　第１，２链ｃＤＮＡ的合成
１．３．１　第１链ｃＤＮＡ的合成　将１０００ｎｇ总ＲＮＡ
和１μＬ　３′ＳＭＡＲＴｅｒ　ＣＤＳ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＩＩ　Ａ （１２μｍ）分
别加入０．２５ｍＬ　ＰＣＲ管中，用无ＲＮａｓｅ水的水补
足溶液体积至４．５μＬ；混匀，简短离心十几秒；放在
ＰＣＲ仪中孵育，７２℃孵育３ｍｉｎ，然后将温度降至
４２℃孵育２ｍｉｎ；再加入２μＬ　５×第１链缓冲液，
０．２５μＬ　ＤＴＴ （１００ｍＭ），１μＬ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ （１０
ｍＭ），１μＬ　ＳＭＡＲＴｅｒ　ＩＩ　Ａ　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（１２
μＭ），０．２５μＬ　ＲＮａｓｅ抑制剂，１μＬ　ＳＭＡＲＴＳｃｒｉ－
ｂｅＴＭ反转录酶（１００Ｕ），上下吸打混匀后短暂离心，
ＰＣＲ仪上４２℃孵育９０ｍｉｎ；７０℃加热１０ｍｉｎ终止
反应；向其中加入４０μＬ的 ＴＥ缓冲液（ｐＨ７．６的
１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）。
１．３．２　第２链ｃＤＮＡ的合成　每个样本取３０μＬ
ｃＤＮＡ第１链放入１．５ｍＬ的反应管中，加入２２２
μＬ超纯水，３０μＬ　１０× Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２ＰＣＲ缓冲液，６
μＬ　５０×ｄＮＴＰ聚合物 （１０ｍＭ），６μＬ　５′ＰＣＲ引物
ＩＩ　Ａ（１２μＭ），６μＬ　５０×Ａｄｖａｎｔａｇｅ　２酶聚合物，短
暂离心后充分混匀，每个样本分成３管标记为 Ａ，
Ｂ，Ｃ，各１００μＬ进行ＰＣＲ。ＰＣＲ反应条件９５℃１
ｍｉｎ，９５℃１５ｓ，６５℃３０ｓ，６８℃３ｍｉｎ，共１５个循
环。当每个反应管进行１５个循环时，在Ｃ管中取
３０μＬ到另一个０．２５ｍＬ反应管标记为优化，４℃保
存Ａ，Ｂ及Ｃ管中余下的７０μＬ。分别在１３，１５，１８，
２１，２４个循环时从优化管中取走ＰＣＲ产物５μＬ；用
１．２％琼脂糖凝胶，１×ＴＡＥ缓冲液，对所留取的５
μＬ产物进行电泳，根据其结果来决定最佳循环数及
ＰＣＥ产物质量及纯度；取出４℃储存的１５个循环的
Ａ，Ｂ，Ｃ管加到优化的循环数；将各样本混合到１．５
ｍＬ离心管中。
１．３．３　ＰＣＲ产物的纯化和质量检测　从１．５ｍＬ
管中取出７μＬ放入一个新的０．２５ｍＬ　ＰＣＲ管中，
标记为Ａ；向管中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇
（２５∶２４∶１），充分混匀；１４０００ｒｐｍ，室温离心１０
ｍｉｎ；取上清放入一个新的１．５ｍＬ离心管中；加入
７００μＬ正丁醇，充分混匀，１４０００ｒｐｍ，室温下离心
１ｍｉｎ；将上层的丁醇去掉，最后得到４０～７０μＬ的
液体；将ＣＨＲＯＭＡ　ＳＰＩＮ＋ＴＥ－１０００柱下上颠倒混
匀；去掉头部及尾部的盖子，在重力作用下，柱中的
缓冲液将会流出，待柱中的缓冲液排空时加入
１．５ｍＬ　１×ＴＮＥ缓冲液（ｐＨ８．０的１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ，１０
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＮａＣｌ，０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ）；待１×ＴＮＥ缓
冲液排空时加入样本，注意不要加到柱子的内壁上；
向柱子内加入２５μＬ　１×ＴＮＥ缓冲液；向柱子内加
入１５０μＬ　１×ＴＮＥ缓冲液；将柱子放入一个新的
１．５ｍＬ离心管中，向柱子内加入３２０μＬ　１×ＴＮＥ
缓冲液，收集洗脱液作为纯化后的ｃＤＮＡ，标记为
Ｂ；将柱子放入一个新的１．５ｍＬ离心管中，向柱子
内加入７５μＬ　１×ＴＮＥ缓冲液，收集洗脱液，标记为
Ｃ；用１．２％琼脂糖凝胶，１×ＴＡＥ缓冲液，将Ａ，Ｂ，Ｃ
共３个样本进行电泳，根据其结果来判断过柱纯化
的效率。
２　结果与分析
２．１　落地生根叶片总ＲＮＡ提取结果
１．２％琼脂糖凝胶电泳检测，可见总ＲＮＡ为明
显的２８ｓ和１８ｓ，条带亮度比值约为１．５∶１（图１），
表示所提取的ＲＮＡ未见降解。
２５０１
第６期 钟天秀等：应用ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术扩增落地生根叶片的总ＲＮＡ
图１　落地生根叶片总ＲＮＡ
Ｆｉｇ．１　Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａｌｅａｖｅｓ
Ｍ：Ｄ２０００
２．２　ｃＤＮＡ扩增结果
各取１０００ｎｇ总ＲＮＡ用于第１链ｃＤＮＡ的合
成，在第２链合成中，通过优化管的１３，１５，１８，２１，
２４个循环结果确定最佳循环数。图２（Ａ，Ｂ）中，１
泳道为１ｋｂ　ｍａｒｋｅｒ，２，３，４，５，６泳道分别为１３，１５，
１８，２１，２４个循环数的结果，可看出落地生根未长芽
的叶片在１５个循环数达到平台期，落地生根长芽的
叶片也在１５个循环数达到平台期。因此，落地生根
未长芽的叶片的最佳循环数为１５，落地生根长芽的
叶片的最佳循环数为１５。最终，未长芽和长芽的落
地生根叶片扩增出较好的结果。
图２Ａ　未长芽落地生根ｃＤＮＡ第２链扩增
Ｆｉｇ．２Ａ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｋａｌａｎｃｈｏｅ　ｄａｉｇｒｅｍｏｎｔｉａｎａ
ｌｅａｖｅｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｂｕｌｂｉｆｅｒｏｕｓ　ｓｐｕｒｓ
１：λ－ＨｉｎｄⅢｄｉｇｅｓｔ　ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ，２：１３个循环，３：１５个循环，
４：１８个循环，５：２１个循环，６：２４个循环
２．３　ｃＤＮＡ纯化结果
将ｃＤＮＡ纯化后，从Ａ中取３μＬ，Ｂ和Ｃ中各
取１０μＬ在１．２％琼脂糖凝胶电泳上进行电泳，图３
中，１泳道为１ｋｂ　ｍａｒｋｅｒ，２，３，４泳道分别为落地生
根叶片纯化前Ａ，纯化后Ｂ，纯化后Ｃ。从图中可看
出，Ｃ管中纯化后的ｃＤＮＡ浓度比Ｂ管中纯化后的
ｃＤＮＡ浓度高，说明过柱纯化的效率较高。
３　讨论与结论
影响ｃＤＮＡ 合成产量和质量的因素主要有２
方面，一是从总 ＲＮＡ 中分离得到 ｍＲＮＡ 的过程
中，由于多种因素（如糖、酚、醌的含量，高速离心等）
的影响，极易造成 ｍＲＮＡ５′端一些序列信息的丢
失。二是普通的逆转录反应往往不能转录全部的
ｍＲＮＡ序列，在ｃＤＮＡ的５′末端不能完全重现ｍＲ－
ＮＡ的序列，造成低丰度的基因在这个过程中被损
失。张鹂［３］等在克隆结缕草（Ｚｏｙｓｉａ　ｊａｐｏｎｉｃａ）中赤
霉素和脱落酸相关代谢途径中的基因时，就只克隆
出功能基因的部分片段。
ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术使用总ＲＮＡ作为
起始材料，利用含有经过修饰的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）引物，特
３５０１
草　地　学　报 第１９卷
异的结合在 ｍＲＮＡ加Ｐｏｌｙ　Ａ的位置，避免过长的
Ｐｏｌｙ　Ａ影响后续的ＰＣＲ反应，当反转录到达 ｍＲ－
ＮＡ的５′末端，也就是ｃＤＮＡ第１链的３′末端，会在
ｍＲＮＡ　５′末端特有的帽子结构即甲基化的Ｇ时，连
续在合成的ｃＤＮＡ末端加上几个ｄＣ，这样得到单链
ｃＤＮＡ 包含了完全的 ｍＲＮＡ 的 ５′末端和增加
ＳＭＡＲＴｅｒ寡核苷酸序列，从而有利于第２链的合
成。ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术是ＳＭＡＲＴ　ｃＤＮＡ
合成技术的升级，能够得到更完整的ｃＤＮＡ。
目前利用ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术进行研究
工作在国内外文献中均有报道。Ｓｕｚａｎｎｅ　Ｄ　Ｖｅｒ－
ｎｏｎ［４］等比较２种方法合成ｃＤＮＡ应用到微阵列技
术上的效果：①用５μｇ总ＲＮＡ进行反转录；②用１
μｇ的总ＲＮＡ通过ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术反转
录。用２种方法合成的探针检测５８８个基因的表达
情况，用反转录合成的ｃＤＮＡ可以检测到９７个阳
性基因，用ＳＭＡＲＴｅｒ合成的ｃＤＮＡ探针可以检测
到１２２个阳性基因。由此得出结论，ＳＭＡＲＴｅｒ技
术合成的探针产量更高，重复性也更好。Ｌｕｃｉａｎｏ　Ａ
Ｍｏｒｅｉｒａ等［５］通过ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术克隆
蜂毒磷脂酶基因，研究蜂毒磷脂酶抑制转基因蚊子
中痢疾寄生虫的生长情况。ＷＥＮ　Ｊｉａｎｊｕｎ等［６］应用
此技术克隆和鉴定一个含 ＷＤ区域的新基因在鱼
卵中的差异表达。赵桂媛［７］等通过ＳＭＡＲＴｅｒ策略
构建小黑杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ　Ｘ　ｘｉａｏｈｅｉ　Ｔ．Ｓ．Ｈｗａｎｇ　ｅｔ
Ｌｉａｎｇ）茎形成层全长ｃＤＮＡ文库。Ｊ　Ｒ　Ｃｅｓａｒ等［８］
利用ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术建立南美白对虾腹
肌的ｃＤＮＡ 文库，并对 ＥＳＴ 进行分析。Ｐｅｎｇ－ｆｅｉ
Ｇａｏ等［９］为研究鸽子孵化、筑巢、产卵形成的分子机
制，利用ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术，建立了ｃＤＮＡ
文库，从中克隆和鉴定鸽子体内的泛素及泛素结合
酶基因。郭俣等［１０］利用ＳＭＡＲＴｅｒ技术构建了北
京油鸡肝脏伞长ｃＤＮＡ文库，从中克隆了北京油鸡
ｐｕｒＨ 基因。Ｓｅｔｈ　Ｄ等［１１］通过ＳＭＡＲＴｅｒ技术可
以从人类酒精肝癌细胞样品中获得相对于原来总量
３８００倍的ＤＮＡ探针，突破了样品的限制，能够进行
更多的ＤＮＡ微阵列的实验，研究人类酒精肝发生
的分子机制。
ＳＭＡＲＴｅｒ　ｃＤＮＡ合成技术直接从总ＲＮＡ中
反转录得到ｃＤＮＡ，在ｃＤＮＡ合成的过程中，当到达
ｍＲＮＡ的５′端时会在合成的ｃＤＮＡ末端加上几个
ｄＣ，这巧妙地保证了ｃＤＮＡ的完整性，得到的ｃＤ－
ＮＡ质量好、产量高，为接下来的相关研究工作提供
了基本保障。
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ｕｉｔｉｎ－ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　ｇｌａｎｄ　ｌｉｂｒａｒｙ
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ａｔｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｒｅａｌ　ｔｉｍｅ　ＰＣＲ
ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｏ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎ　ｐｒｉｍａｔｅｓ
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（责任编辑　吕进英）
４５０１