全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 01-0043-04
中国假俭草居群遗传多样性研究Ⅱ:三种等位酶证据
宣继萍, 刘建秀*
(江苏省中国科学院植物研究所中山植物园,南京 210014)
摘要: 选择产自我国不同地域的 6 个假俭草(Eremochloa ophiur oides( Munro) Hack)居群, 利用垂直平板丙烯酰胺凝胶电
泳技术分析了过氧化物同工酶( POD)、酯酶同工酶( EST )和苹果酸脱氢酶同工酶 ( MDH)酶谱的 9个等位酶位点。结果
表明: 中国假俭草的基因多样性为 0. 336, 其中居群内为 0. 176,占总变异的 52. 4% , 居群间为 0. 16,占总变异的 47. 6% ;
居群间遗传一致度为 0. 945～1. 000,其中连云港和贵州 2个居群间的遗传一致度明显低于其余 4个 ;中国假俭草居群内
的遗传多样性大于居群间遗传多样性, 种内遗传差异很小。
关键词: 假俭草;居群; 等位酶;遗传多样性
中图分类号: S 812　　　文献标识码: A
Study on the Heredidy Diversity of China Native Centipedegrass
Population (Ⅱ) : Evidence of Alleozyme
XUAN Ji-ping , LIU Jian-xiu
*
( Zhong shan Arboretum , Ins titute of Botany, C hinese Academy of Sciences of J iangsu Pr ovin ce, Nanjing, Jiangsu Province 210014, China)
Abstract: The nine loci of pero xidase isozymes( POD) , esterase( EST ) , and malate dehydrogenase( MDH) in 6
populat ions o f cent ipedegr ass( Eremochloa ophiuroides( M unro ) Hack. ) collected f rom dif ferent areas o f mainland
China w er e detected and analyzed w ith polyacrylam ide gel elect ropho resis method. T he resul ts show that the
gene diversity of the cent ipedeg rass is 0. 336, o f w hich 0. 176 is w ithin the populat ions, amount ing to 52. 4% of
the total ; 0. 16 is among the populat ions, taking 47. 6% of the to tal . Genet ic similarity among the cent ipede-
gr ass populat ions r eaches 0. 945～1. 000. The similarity betw een the Lianyungang populat ion and Guizhou
populat ion is slighter than among the o ther 4 populat ions. T he results illust rate that the genet ic div er sity
w ithin a populat ion is more no table than that among the populat ions in Chinese-nativ e cent ipedegr ass, w hile
the genet ic difference of the cent ipedeg rass species is v er y slight .
Key Words : Cent ipedegr ass; Populat ion; Alleozyme; Genet ic diversity
　　假俭草( Eremochloa op hiuroides( M unro ) Hack. )
是禾本科蜈蚣草属多年生草本植物, 也是蜈蚣草属中
唯一可用作草坪草的二倍体草种 [ 1, 2, 3]。假俭草叶形优
美,植株低矮,生长缓慢,是世界上三大暖季型草坪草
之一。假俭草是典型的二倍体, 既可进行营养繁殖, 也
可用种子繁殖。用假俭草建植的草坪盖度高、耐贫瘠、
病虫害少、易养护, 可广泛用于庭院、休闲与护坡[ 4, 5]。
假俭草在我国主要分布在长江流域及以南的广大地
区,在这些地区无论是沿海滩涂还是内陆高山、河流两
岸、丘林山地中均有广泛分布。在遗传多样性研究中,
等位酶研究具有揭示基因位点变异突出的优点, 是目
前应用较多的研究方法之一。假俭草等位酶分析以酯
酶和过氧化物酶的研究居多。Bouton等 [ 1] ( 1983)、任
健等[ 6] ( 2001)均发现不同的假俭草种源的 EST 和
POD 谱带及酶活性均存在一定的变异。白史且等 [ 7]
( 2002)对 15个假俭草种源的 POD 酶谱分析发现, 电
泳形成 2个区域, 个体材料间的差异明显, 显示出丰富
的同工酶变异, 15个假俭草种源聚类后可分为两大
类。由于这些研究所用的试验材料为种源而非居群, 尚
难以反映我国假俭草种质资源的遗传多样性。
　　江苏省中科院植物研究所从1993年起就在国内
外开展假俭草种质资源的搜集引种和评价工作, 到目
收稿日期: 2003-10-30; 修回日期: 2004-12-8
基金项目:国家自然科学基金项目“中国假俭草种质资源遗传多样性研究”( 30070538)资助
作者简介:宣继萍( 1976-) ,女,浙江东阳人, 助理研究员, 硕士,主要从事暖季型草坪草种质资源的遗传多样性研究; * 通讯作者 Author for
correspond ence　E-mail: turfun it@ yahoo. com . cn
第 13卷　第 1期
　Vo l. 13　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　 　2005 年　3 月
　M arch 　2005
前为止,已从国内外搜集了 200余份种质资源, 并已对
其形态特征、物候期、结实性、抗寒性、抗旱性、坪用价
值及 RAPD等方面进行了比较系统的研究。本试验在
前人的工作基础上, 对来自中国假俭草种质资源分布
区的 6个代表居群进行了 3个等位酶的分析,旨在从
酶蛋白分子水平上揭示假俭草种质资源的遗传基础及
其差异, 为我国假俭草种质资源的保护和利用提供
依据。
1　材料与方法
1. 1　居群试验材料取样
本实验共选取 6个不同居群的种源, 采样地点见
表 1。所有居群材料都采集于 1999年。由于假俭草匍
匐茎非常发达,而且生长速度较快,为充分保证居群内
个体间的多样性, 每个居群内单株相距 400～500 m ,
分别从各地取草皮种植于南京中山植物园苗圃。
表 1　假俭草种内居群取样地点
Table 1　The location of each population of E remochloa op hiuroides( M unro) Hack
代号
C ode
地点
Locat ion
纬度(°N)
Lat itude
经度(°E)
Long itu de
海拔( m)
Elevation
采样数
Number
1E 湖南长沙 Changsha,H unan 28. 13 112. 45 30～70 12
2E 贵州贵阳 Guiyang, Gu izhou 26. 42 106. 47 1120 12
3E 河南信阳 Xinyang , Henan 31. 83 113. 97 100 14
4E 江苏连云港 Liangyungang, Jiangsu 34. 57 119. 20 4～300 8
5E 广东广州 Guan gzhou, Guan gdong 23. 10 113. 50 40 6
6E 江苏南京 Nanjing, Jiangsu 32. 05 118. 57 30 8
1. 2　等位酶电泳实验
1. 2. 1　酶提取液制备
2002年 10月, 每样株取幼叶 0. 5 g 左右, 先加入
1 ml提取缓冲液, 在冰浴条件下将叶片研磨均匀,再加入
2 ml 提取缓冲液, 将匀浆转移至离心管中, 在 10000
rpm/ m in 下离心15 min。取上清液,放入冰箱中保存。
1. 2. 2　电泳
采用垂直不连续丙烯酰胺凝胶平板电泳,过氧化
物酶和苹果酸脱氢酶的分离胶和浓缩胶的浓度分别为
7%和 4%, 酯酶的分离胶和浓缩胶的浓度为 10%和
3%。制胶具体操作参照何忠效[ 8]等提出的方法进行。
1. 2. 3　染色
POD 染色采用联苯胺法。染液配方为:联苯胺:
4% NH4Cl∶5% EDTA∶0. 3% H2O 2∶双蒸水= 1∶
1∶1∶1∶8, 室温下染色。
MDH 染色液配方为: 1 mol / L DL-苹果酸 10 ml、0.
2 mo l/ L pH 8. 5 Tr is-HCl 20 ml、1% NAD 5 滴、1%
PMS 2滴、1% MTT 5滴、双蒸水70 ml。37℃下染色。
EST 染色液配制: 称取
-醋酸-萘酯 300 mg ,固蓝
RR 盐 300 mg , 分别以少量丙酮溶解后过滤, 加入
400 ml 磷酸缓冲液( 0. 2 mol/ L , pH 6. 4)。胶板放入染
色液中 37℃染色 15 m in。
1. 3　数据处理
通过电泳分析获得二倍体基因型频率,进而计算
基因频率以及下列参数 [ 11, 12] : ( 1)多态位点百分率 P ,
P = 多态位点数/检测位点总数; ( 2)每个位点等位基因
平均数 A , A = 各位点等位基因总和/检测位点总数;
( 3)杂合度观测值 H o, H o= 杂合体个体数/样本大小;
( 4)杂合度期望值 H e, H e= ∑he/ n, he= 1- ∑P i2 ; ( 5)
基因多样度总量 H t ,计算方法同 H e ; ( 6)居群内的基
因多样度 H s,计算方法同 H e; ( 7)居群间的基因多样
度 Dst , Dst= H t- H s; ( 8)居群间基因多样度占基因多
样度总量的比例 Gst , G st= Dst/ H t ; ( 9)居群间的遗传
遗传一致度( I )和遗传距离( D ) , I = ∑X iYi/ X i2Yi 2, 其
中 X i是 X群体第 i个等位基因频率, Yi是 Y群体第 i
个等为基因频率, D = - lnI。以上各遗传参数的意义和
计算方法详见参考文献 [ 9]。
2　结果与分析
2. 1　假俭草居群内和居群间遗传变异分析
假俭草居群 3个酶的酶谱表型(见图 1、2、3)。在
本试验中 POD 酶谱分为 3个区, 最多的有 5条带, 而
EST 酶谱也是分为 A、B和 C 3个区,其中 A 区和 B
区都有 2条带, C 区则有 1～3条带。假俭草各居群中
的等位酶基因频率见表 2。本实验在 3种酶系统中观
测到 9个位点上的 16个等位基因。各居群内的预期杂
合性( H e)和实际杂合性( H o)分别在 0. 2607～0. 3539
和 0. 0303～0. 0576的范围内变动(表 3) ,分率在各居
群间平均为 18. 3%。从表 2中可以看到本研究中假俭
草种源在 MDH 同工酶的谱带上没有任何差异, 其它
2个酶的酶谱上也差异很小。从表 3中可以看到,各居
群内的预期杂合性( H e)和实际杂合性( H o)分别为在
0. 2607～0. 3539和 0. 0303～0. 0576的范围内变动,
差别不大, 连云港和贵州居群的预期杂合度分别为 0.
2607和 0. 2762,实际杂合度分别为 0. 0303和0. 0383,
都明显低于其它 4个居群, 说明这两个居群的遗传变
异低于其他几个居群。
44 草　地　学　报 第 13卷
图 1　假俭草 POD等位酶酶谱表型
Fig . 1　The POD t ype of the E remochloa op hiuroides( M unro) Hack
注:从左向右为 1～6居群,其中 1-12是第一个居群; 13-24是第二个居群; 25-38是第三个居群;
39-46是第四个居群; 47-52是第五个居群; 53-60是第六个居群
Note: From lef t t o right are th e 1～6 populat ions . 1～12 belong to the f irs t populat ion ; 13～24 to th e second;
25～38 to the third; 39～46 to the forth; 47～52 to the f ifth ; 53～60 to the s ixth
图 2　假俭草MDH 等位酶酶谱带型
F ig . 2　The MDH type o f the Eremochloa ophiur oid es ( Munro ) Hack
注:每个泳道加样顺序与图 1相同
Note: T he samples of lane are the same as th e fig ure 1
图 3　假俭草 EST等位酶酶谱带型
F ig . 3　T he EST type o f the Eremochloa ophiur oid es ( Munro ) Hack
注:每个泳道加样顺序与图 1相同
Note: T he samples of lane are the same as th e fig ure 1
表 2　假俭草 6 个居群的 9 个位点上的基因频率( q)
T able 2　Allele fr quences at nine loci in the six
popula tion o f Eremochloa ophiur oid es ( Munro ) Hack
位点
Locus
居群 Populat ion
1E 2E 3E 4E 5E 6E
POD-1 a 0. 522 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
b 0. 478 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
POD-2 a 0. 500 0. 000 0. 500 0. 500 0. 500 0. 469
b 0. 500 1. 000 0. 500 0. 500 0. 500 0. 531
POD-3 a 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
b 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
MDH-1 a 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
b 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
MDH-2 a 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
b 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
MDH-3 a 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000 1. 000
b 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000 0. 000
EST -1 a 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
b 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
EST -2 a 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
b 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500 0. 500
EST -3 a 0. 429 0. 417 0. 370 0. 773 0. 467 0. 471
b 0. 571 0. 583 0. 630 0. 237 0. 533 0. 529
2. 2　假俭草居群内和居群间的基因多样性
基因多样度指标见表 4。假俭草 6个居群 9个位
点的平均总基因多样度H t为0. 336。所有位点的基因
多样性均为居群内大于居群间( Gst< 0. 5)。
表 3　假俭草种内遗传多样性各度量值
Table 3　T he values o f heredity diver sity am ong various
populations of Eremochloa ophiur oides( Munro) Hack
居群
Populat ion
预期
杂合性
H e
实际
杂合性
H o
每位点等
位基因数
A
多态位
点比率
P
1E 0. 3378 0. 0476 1. 67 22%
2E 0. 2762 0. 0383 1. 56 11%
3E 0. 3144 0. 0576 1. 78 22%
4E 0. 2607 0. 0303 1. 67 11%
5E 0. 3330 0. 0444 1. 67 22%
6E 0. 3529 0. 0335 1. 67 22%
2. 3　假俭草居群间的遗传分化
居群间的遗传一致度( I ,或称相似性系数)和遗传
距离( D )列于表 5。假俭草种内居群之间的遗传一致度
在 0. 945以上, 居群间的平均遗传距离为 0. 018, 可
见, 6个居群之间的遗传距离很近、差异很小。连云港
与贵州 2个居群间的遗传一致度明显低于其余 4个,
说明这 2个居群间有一定程度的分化。贵州和连云港
居群与其余几个居群间的遗传一致度小于其余几个居
群相互间的遗传一致度,说明贵州和连云港居群与其
余几个居群间的遗传分化较大。此外,南京与广州居群
间的遗传距离为 0, 说明这 2个居群之间没有分化。
45第 1期 宣继萍等:中国假俭草居群遗传多样性研究Ⅱ:三种等位酶证据
表 4　假俭草遗传多样性统计量
Table 4　Stat istics of g enet ic diver sity of
Eremochloa op hiur oides( Munro ) Hack
总基因
多样性
H t
居群内
基因多样性
H s
居群间
基因多样性
Dst
居群间基因
分化指数
Gst
种内平均
Mean in sp ecies
0. 336 0. 176 0. 160 0. 476
表 5　假俭草种内居群间遗传一致度( I)和遗传距离(D)分析
Table 5　Genetic similar ity ( I ) and distance (D ) betw een
population of Eremochloa op hiuroides( Munro) Hack
居群
Populat ion
1E 2E 3E 4E 5E 6E
1E ***** 0. 031 0. 001 0. 021 0. 001 0. 002
2E 0. 967 ***** 0. 033 0. 055 0. 033 0. 029
3E 0. 999 0. 967 ***** 0. 029 0. 002 0. 002
4E 0. 979 0. 945 0. 971 ***** 0. 017 0. 017
5E 0. 999 0. 967 0. 998 0. 983 ***** 0. 000
6E 0. 998 0. 971 0. 998 0. 983 1. 000 *****
　　备注:左下角为遗传一致度( I ) ,右上角为遗传距离( D )
Note: Data of lef t h al f refers to I ; Data of right half refers to D
3　讨　论
3. 1　任键[ 6]等在 5个野生四川假俭草的 POD 酶研究
得到的酶谱显示,酶带明显地分成 A 区和 B区, EST
酶谱可分为 A、B、C 三个区,本试验中得到的 POD 酶
谱和EST 酶谱与任键等人的结果不一致。得到不同酶
谱的原因可能是因为取样时期不同, 本试验中的取样
时期是 10月即假俭草的结实期,与任键等人的取样时
间不同。假俭草 6个居群的 MDH 酶谱上没有任何差
异,表明在 MDH 这个同工酶检测到的几个位点上假
俭草种内不存在任何差异, 可初步认为假俭草在这几
个位点上是稳定的。本试验假俭草种内 6个居群之间
的三种酶系统各位点上差异较小,且有限的差异主要
存在于居群内而不是居群之间。
3. 2　植物的繁育系统调节着居群内及居群间实际产
生的变异性[ 10]。植物的繁育系统分为内繁育和外繁
育,外繁育这种开放式的繁育系统的居群内个体间保
持着丰富的遗传多样性而居群间的相似性大于差异
性。由于假俭草的开放受粉率、异花受粉率分别为
59%～90%和 45%～66%,自花受粉率为 0%～59% ,
可见假俭草是属于外繁育植物,因此出现居群内变异
大于居群间变异的现象也就不难理解了。
3. 3　本试验的目的在于探究中国假俭草种内的遗传多
样性, 在等位酶分析之前,已在形态特征、抗性及 RAPD
分子标记等几个方面进行了研究, 均已成文发表或待
发, 本试验是在此基础上进行的。由于试验条件所限,选
取的等位酶种类只有三种, 因此研究结果并不能完全揭
示中国假俭草的遗传多样性, 但所得到的基本结果与
RAPD标记及形态特征等方面的研究结果一致,即居群
内的遗传多样性大于居群间,连云港和贵州居群与其他
几个居群间存在一定的遗传分化,南京和广州2个居群
间的遗传距离很近。由于假俭草在各个地域分布的多寡
不同, 因此在搜集种源时各居群所取的样本数有多有
少, 本试验中选取了每个居群中最有代表性的种源进行
研究,对于各自居群的遗传性应有一定的代表性,再结
合本项目其他方面的研究结果,可以对中国假俭草的遗
传多样性作一比较完整的结论。
4　结　论
4. 1　中国假俭草在 POD、EST 和 MDH 三个酶系统
的 9个位点上的多态位点百分率为 18. 3%, 各居群内
的预期杂合性 ( H e ) 和实际杂合性 ( H o) 分别在
0. 2607～0. 3539 和 0. 0303～0. 0576的范围内变动,
连云港居群和贵州居群的预期和实际杂合度都明显低
于其它 4个居群。
4. 2　中国假俭草居群 3个酶系统的 9个位点的平均
基因多样度 H t= 0. 336, 居群内的基因多样性大于居
群间( Gst< 0. 5) ,即中国假俭草种内的遗传多样性主
要存在于居群内而不是居群间。
4. 3　假俭草种内居群之间的遗传一致度在 0. 945 以
上,居群间的平均遗传距离为 0. 018, 6个居群之间的
遗传距离很近;连云港与贵州 2个居群间有一定程度
的分化;连云港与贵州 2个居群与其余 4 个居群间的
遗传分化较大;南京居群与广州居群间的遗传距离为
0, 说明这 2个居群之间没有分化。
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46 草　地　学　报 第 13卷