全 文 ：第 18 卷 第 2 期
Vol. 18 No. 2
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 3 月
Mar . 2010
复序橐吾组培再生体系研究
董 然1 , 潘艳艳1 , 王丽清2 , 顾德峰1, 刘洪章1*
( 1. 吉林农业大学园艺学院, 吉林 长春 130118; 2. 吉林省磐石市园艺特产技术推广站, 吉林 磐石 132300)
摘要: 用复序橐吾( L igul ar ia j aluensis Kom. )种子获得无菌苗, 取其叶片为外植体, 以 MS 培养基为基础, 通过添
加不同浓度和种类的细胞分裂素及生长素,目的是筛选出叶片组织培养的最适培养基。结果表明: 种子较好的灭
菌时间为 75%酒精 30 s+ 1j 升汞 4 min; 初代培养基为 MS+ 6-BA 0. 5 mg/ L+ 2, 4-D 1. 0 mg / L , 由此获得的愈伤
组织致密、颜色绿, 具有很好的诱导效果,其诱导率达到 90% ; 继代增殖的最适培养基为 MS+ 6-BA 1. 0 mg / L +
NAA 0. 1 mg / L , 其增殖倍数高达3. 9,并且苗生长状况良好;生根最适培养基为: 1/ 2 MS+ NAA 0. 5 mg / L , 生根率
达 100%。
关键词:复序橐吾; 叶片;组织培养
中图分类号: Q943. 1 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 02-0286-05
Establishment of micropropagation system of Ligularia j aluensis Kom.
DONG Ran1 , PAN Yan-yan1 , WANG L-i qing2 , GU De-feng1 , LIU Hong-zhang1*
( 1. Jilin Agricul tural U nivers ity, College of H ort icultur e, Chan gchun 130118, China; 2. Panshi H ort icul tu ral
Specialty T echnical Popularization Stat ion of Jilin Province, Pan shi 132300, C hina )
Abstract: T he experiment w as based on M S cultur e media and L ig ular ia j aluensi s Kom. Used explants
w ere from asept ic leavses of the germinat ion seeds in vit ro. An appr opr iate culture medium was obtained
via regulat ing the concentrat ions of cytokinin and auxin. T he optimal sterilizat ion method for seeds of
L igular ia j aluensi s Kom . w as 75% ethanol 30 s+ 1j H gCl2 4 m in. M S+ 6-BA 0. 5 mg/ L + 2, 4-D 1. 0
mg/ L w as the best culture medium fo r the first generat ion callus, the induced r at io of g reen compact callus
reached 90% w ith this culture medium. T he Propagation Coeff icient of 3. 9 t imes indicated that MS + 6-
BA1. 0 mg/ L+ NAA0. 1mg/ L w as the opt imal culture medium fo r subculture pr oliferat ion. T he best roo-
t ing medium was 1/ 2MS+ NAA0. 5 mg/ L, the surv iv al rate of the plant lets w as show n to be up to 100%.
Key words: L igular ia j aluensis Kom. ; leaf ; t issue culture
复序橐吾( L igular ia j aluensi s Kom. )为菊科
橐吾属多年生草本植物, 株高 1~ 2 m, 产东北长白
山一带,多生于海拔 450~ 1000 m 的草甸子及林缘
湿草地[ 1] ,是长白山区湿地草原地表持久覆盖的重
要建群种之一。其嫩叶是延边朝鲜族及长白山区人
民广泛食用的特色野菜[ 2] , 称为/马蹄叶0,具有特殊
的香气和风味, 民间认为经常食用具有/宽胸理气、
增进食欲0的作用; 根及根茎在东北地区做 /紫菀0
入药, 称为/山紫菀0, 有润肺、下气、祛痰、止咳的功
能[ 3, 4] ; 同时也是长白山区秋季良好的湿地观花植
物[ 2] , 是难得的集食用、饲用、观赏及药用于一体的
植物资源,但因其开花晚, 种子不仅成熟率低, 出苗
率更低,致使产草量严重不足,而组织培养技术是解
决其快速繁殖的有效途径之一。
目前国内外在组织培养方面, 橐吾属植物相关
报道较少:杜鹃[ 5]等利用蹄叶橐吾的叶片为外植体,
通过诱导愈伤组织途径,获得蹄叶橐吾再生植株;吴
迪瑶[ 6] 等利用糙叶大头橐吾的子叶作为外植体,诱
导出愈伤组织进一步产生不定芽获得再生植株; 卢
婷[ 7 ]等对蹄叶橐吾和窄头橐吾进行研究, 利用叶片
获得再生植株。而复序橐吾的相关研究报道较少。
但作者近年研究发现, 其成熟种子在培养皿中发芽
率较高,但种苗成活率极低, 育苗困难, 因此开展组
织培养技术研究, 可为工厂化育苗提供理论依据,亦
可为其开发利用奠定基础。
收稿日期: 2009-11-10,接收日期: 2010- 01-16
基金项目:吉林省科技厅支撑项目( 20060222)资助
作者简介:董然( 1966- ) ,女,吉林敦化人,教授,博士,主要从事长白山观赏植物资源驯化及开发领域研究, E- mail : Dongr999@ 163. com ;
通讯作者 Author for correspondence, E-mail: lhz999@ 126. com
第 2期 董然等:复序橐吾组培再生体系研究
1 材料与方法
1. 1 试验材料
2008年 8月从长白山区的临江市桦树镇 (海拔
724. 9 m , 42b01. 151cN, 127b14. 976cE) ,将复序橐吾
的种子采回净种后放入 4 e 冰箱备用。9月下旬进行
试验,用种子获得无菌苗,取无菌苗的叶片为外植体。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 无菌苗的获得 选择均匀、饱满的复序橐吾
种子,用清水浸泡 2 h 后剥去外种皮放置容器中。
在无菌条件下用 75%酒精表面灭菌 30 s,无菌水冲
洗 6次,再用 1j升汞进行 5种不同时间的灭菌, 最
后用无菌水冲洗 8次,接种于 MS+ 6-BA 0. 2 mg/ L
+ 蔗糖 30 g+ 琼脂 8 g, pH 为 5. 8的培养基上。
1. 2. 1 愈伤组织的诱导 待培养基上的苗培养 4
周后,无菌条件下将无菌苗的叶片剪切成 0. 5~ 1. 0
cm 小块,接入附加不同浓度 6-BA 和 2, 4-D的 MS
培养基中。试验每个处理 10 瓶, 每瓶一个外植体,
各处理重复 3次, 20 d后开始观察形成愈伤组织大
小、质地、色泽等性状。
1. 2. 2 不定芽的增殖 当初代诱导出的不定芽长
到 1. 5~ 2. 0 cm 左右时,将其剪下后接种到增殖培
养基中进行增殖培养。试验每个处理 10瓶,每瓶一个
外植体,各处理重复3次, 30 d后统计芽的增殖率。
1. 2. 3 生根培养与炼苗移栽 将复序橐吾的增殖
苗,分割单株作为生根苗,接入生根培养基中诱导生
根;当根长至 2~ 3 cm 时进行炼苗移栽,即先将瓶塞
打开,慢慢揭开封口膜, 在自然光照常温条件下, 炼
苗 3~ 5 d小心取出,洗去根上附着的培养基, 移栽
到配好的培养基质中。
1. 3 培养条件
培养条件为: 温度 23 ? 2 e , 光照强度 1000~
3000 lx, 光照时间 12 h # d- 1。
1. 4 数据分析与处理
本研究采用完全随机区组试验设计方法,应用
DPS系统进行数据计算和统计分析。
萌发率= 萌发种子数/接种种子总数 @ 100%
愈伤组织诱导率= 出愈数/接入外植体数 @
100%
增殖倍数= 分化不定芽总数/分化前接种总数
@ 100%
生根率= 生根苗数/接入总苗数 @ 100%
2 结果与分析
2. 1 不同灭菌时间对复序橐吾种子萌发率的影响
本试验采用 75%酒精和 1j升汞( HgC12 )对外
植体进行灭菌。接种 10 d后观察并统计种子萌发
率(表 1)。由表 1可知, 在用 1 j升汞( HgC12 ) 进
行不同时间的灭菌时, 随着 HgC12 灭菌时间的增加
种子萌发率先升高后降低, 在处理 4 m in时的种子
萌发率最高达 96. 7%,故种子最适灭菌时间为 75%
酒精 30 s+ 1j升汞 4 min。
表 1 不同灭菌时间灭菌效果比较
Table 1 Compar ison of ster ilizing effect of different sterilizing t imes
灭菌剂
Bactericidal agent
外植体数(个)
Number of explants
灭菌时间(分)
S teriliz at ion t ime ( min)
变褐数(个)
Number of brow ning
污染数(个)
Num ber of pollut ion
萌发率( % )
Germinat ion ( % )
H gCl2 溶液
M ercuric chloride
solut ion
60 0 1 18 68. 3
60 2 0 8 86. 7
60 4 1 1 96. 7
60 6 5 2 88. 3
60 8 10 4 76. 7
2. 2 不同培养基对复序橐吾叶片愈伤组织诱导的
影响
不同植物激素组合对复序橐吾叶片愈伤组织的
形成具有重要影响。接种 20 d 后开始观察愈伤组
织形成情况, 在 6-BA 和 2, 4-D组合的 MS 培养基
上,大部分外植体的上端切口处开始膨大, 20 d 后
开始有浅绿色愈伤组织出现(图 1) ; 继续培养至 40
d时,愈伤组织表面可见明显的凹凸现象, 并开始分
化出不定芽(图 2)。
由表 2可知,培养 40 d时,在含有 0. 5 mg / L 6-
BA和 1. 0 mg/ L 2, 4-D 的培养基上获得较好状态
的愈伤组织,愈伤组织致密、颜色绿, 愈伤块大且均
匀,具有很好的诱导效果, 诱导率高达 90%。由此
确定复序橐吾叶片最佳诱导培养基为 MS+ 6-BA
0. 5 mg/ L + 2, 4-D 1. 0 mg / L 。
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表 2 培养基对复序橐吾愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects o f media on callus induction o f Lig ular ia j aluensis
培养基
Cu lture medium
6-BA 2, 4- D
接种数
Ex plan ts
number
出愈数
Callu s number
诱导率( % )
Rat io of callus
induced
愈伤组织诱导情况
Callu s in duct ion situation
0. 5 0. 5 30 24 80%
愈伤组织多,褐色,无分化能力
Many callus, brow n, no st rong dif ferent iat ion ab ilit y
0. 5 1. 0 30 27 90%
愈伤组织多且紧密,绿色,分化能力强
Many callus, com pact , green, no s t ron g dif ferent iat ion abi lit y
0. 5 1. 5 30 21 70%
愈伤组织少,绿色,分化能力强
Few callu s, green , st rong dif feren tiat ion abil ity
1. 0 0. 5 30 18 60%
愈伤组织多,褐色,无分化能力
Many callus, brow n, no st rong dif ferent iat ion ab ilit y
1. 0 1. 0 30 21 70%
愈伤组织多松散,绿色,分化能力强
Many callus, loose, g reen, s tr on g dif ferentiat ion abil it y
1. 0 1. 5 30 15 50%
愈伤组织少,绿色,分化能力强
Few callu s, green , st rong dif feren tiat ion abil ity
2. 3 不同培养基对复序橐吾不定芽增殖的影响
不定芽的增殖是建立组培无性系的基础, 增殖
的同时也必须伴随芽苗分化, 才能保证有足够生长
健壮的成苗。将生长良好的不定芽转入不同激素配
比的增殖培养基中, 进行不定芽增殖, 经过约 30 d
的诱导培养(诱导情况见表 3) ,产生大量丛生芽(图3)。
由表 3 可知, 培养基 MS+ 6-BA 1. 0 mg / L +
NAA 0. 1 mg / L 对复序橐吾不定芽诱导效果最好,
其增殖倍数最高为 3. 9;并且苗生长状况良好, 可以
满足快速繁殖的目的。
2. 4 不同培养基对复序橐吾生根的影响
从表 4可知, M S、1/ 2 M S、1/ 4 M S 3种培养基
均能诱导生根, 但生根效果不同, 生根率以在 1/ 2
M S培养基上最高,为 87%; 以 1/ 2 MS 为基本培养
基,附加 NAA 0. 5 mg/ L 时,生根率达 100% ,生出
的根比较多,均匀且粗壮, 植株长势良好(图 4)。生
根最适培养基为 1/ 2 M S+ NAA 0. 5 mg/ L。
表 3 不同激素浓度配比对复序橐吾不定芽增殖的影响
Table 3 Effect of differ ent combinations o f ho rmone on pro liferation o f adventitio us buds of L igular ia j aluens is
培养基
Cu lture medium
6-BA NAA
接种数量
Inoculation
amount
增殖个数
Number of
prolif erat ion
增殖倍数
Prolif erat ion
mult iple
诱导情况
Situation of indu ct ion
0. 5 0. 1 30 51 1. 7
不定芽少、低矮
Few buds grow thickset and w eak
0. 5 0. 2 30 84 2. 8
不定芽分化率低、生长慢、淡绿、长势较弱
Few buds grow thickset an d slender, dw arf and w eak
1. 0 0. 1 30 117 3. 9
不定芽分化率高、芽健壮、幼苗健壮、色深绿
Many buds grow robu st and st rong, gr een
1. 0 0. 2 30 63 2. 1
不定芽低矮、纤细、丛生状
Buds grow thickset and slender, roset te b uds
1. 5 0. 1 30 93 3. 1
不定芽分化率高、色淡绿、长势较弱
Many buds grow regularly but w eak ly, gr een
1. 5 0. 2 30 84 2. 8
不定芽分化率低、生长纤细,淡绿、长势较弱
Few buds grow thickset , s lend er and w eak
表 4 不同培养基对复序橐吾生根的影响
Table 4 Effect o f different cultur e media on roo ting o f L igular ia j al uens is
培养基
Cu lture medium
NAA( m g/ L )
生根率( %)
Root ing rate
生根状况
S itu at ion of rooting
M S 0 65 根系不发达 Weak roots
1/ 2 MS 0 87 根系粗壮 T hick root s
1/ 4 MS 0 79 根系不发达 Weak roots
1/ 2 MS 0. 1 93 根系不发达,纤细,数量少 Weak roots, slen der, f ew r oots
1/ 2 MS 0. 5 100 根系粗壮,数量多,植株生长良好 Th ick root s , many root s, grow w ell
1/ 2 MS 1. 0 97 根系过于发达,粗壮,数量多 Excessively thick root s, man y root s
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第 2期 董然等:复序橐吾组培再生体系研究
3 讨论
3. 1 本实验通过种子萌发的无菌苗叶片作外植体
来获得再生植株,它不受季节和植株发育时期等因
素的限制,具有取材方便、操作简单等优点, 为试验
提供了丰富的材料,而且可以筛选出多种优良的无
性系。该方法可以省去繁琐的灭菌程序, 为复序橐
吾的组织培养与快速繁殖提供了全新思路。
3. 2 橐吾属的组织培养在蹄叶橐吾、糙叶大头橐吾
和窄头橐吾中均有研究, 但都是通过叶片形成愈伤
组织再分化形成不定芽途径进行的,发现橐吾愈伤
组织存在多态性,不仅表现在外形特征上,更重要的
是各类型愈伤组织在分化能力上具有明显差异[ 5, 7] ,
有的芽可在愈伤组织上自动发生,推测可能是胚性
愈伤组织,而其他类型的愈伤组织芽的分化率很低,
作者在本试验中也发现类似现象。
3. 3 在植物组织培养过程中,愈伤组织的产生和分
化离不开植物激素的调节和控制,常用的植物激素
有 2, 4-D、NAA、6-BA 和 KT 等。孟玉玲[ 9] 等在对
红三叶组织培养及再生植株研究中发现, 一种生长
素和一种分裂素组合使用,可使豆科牧草的愈伤组
织分化;高浓度 2, 4-D对植物本身会造成毒害作用,
但适宜浓度对愈伤组织形成具有促进作用 [ 10] ;张磊
等[ 1 1]证明了过高或过低的 2, 4-D 浓度都不利于胚
性愈伤组织的形成和分化作用;王丽等[ 12] 以大赖草
成熟胚为外植体组织培养研究表明, 减少培养基中
2, 4-D 的浓度有利于愈伤组织绿色芽点的出现; 张
万军[ 13]认为在黑麦草的组织培养过程中, 激素的作
用表现出明显的协同效应, 合理地调节 2, 4-D 和
KT 的浓度与比例是黑麦草愈伤组织分化、成苗的
关键。本试验在愈伤组织诱导阶段, 除了使用细胞
分裂素 6-BA 外, 还添加了生长素 2, 4-D, 不仅证明
了 2, 4-D对复序橐吾愈伤组织诱导的重要作用, 而
且也发现了过高浓度的 2, 4-D对愈伤组织诱导的抑
制作用,这与栾晓敏等[ 14] 的结论一致。
3. 4 目前把生长素/细胞分裂素比值运用于组培
中,认为二者的比例决定着芽和根的分化, 当生长
素/细胞分裂素比值高时, 有利于长根、低时有利于
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草 地 学 报 第 18卷
长芽, 中间比值利于愈伤组织的诱导和分化。在复
序橐吾组培过程中,过高浓度的细胞分裂素有利于
芽的诱导,但不利于苗生长,此时苗易出现玻璃化等
现象。姜素云 [ 15] 在黑麦草增殖培养基中添加 2. 0
mg/ L 的 6-BA, 增殖效果最好; 葛淑俊等[ 16] 发现 6-
BA 对甘草试管苗的增殖起决定性作用, 其增殖倍
数可稳定达到 25倍。本试验在不定芽增殖阶段主
要使用的是 6-BA 和 NAA, 其中 6-BA 最高浓度为
1. 0 mg/ L,浓度再高将会抑制芽的增殖,并且生长缓慢。
3. 5 大量研究表明, 植物组织培养生根过程中,
NAA起一定的促进作用,但是过高的 NAA 对生根
时间具有明显的抑制作用[ 17]。本试验中较高水平
的 NAA 对生根则有一定的抑制作用, 生根培养基
以 1/ 2 M S 添加 NAA 0. 5 mg / L 时, 生根率达
100%,生出的根比较多,均匀且粗壮,植株长势良好。
4 结论
以复序橐吾种子获得无菌苗的叶片为外植体,
不受季节、时间的影响,可大大提高繁殖系数和工作
效率。本试验采用 75%酒精和 1j升汞( HgC12 )对
外植体进行灭菌, 筛选出种子较好的灭菌时间为
75%酒精 30 s+ 1j 升汞 4 min, 此种消毒方法可使
复序橐吾的种子萌发率高达 96. 7%; 代种子培养 4
周后,无菌条件下取无菌苗的叶片为外植体, 接入附
加不同浓度 6-BA 和 2, 4-D的 MS 培养基中进行愈
伤组织的诱导, 选出最佳诱导培养基为 MS+ 6-BA
0. 5 mg/ L+ 2, 4-D 1. 0 mg/ L ,由此获得的愈伤组织
致密、颜色绿,具有很好的诱导效果,其诱导率达到
90% ;将生长良好的不定芽转入含有不同 BA 和
NAA的增殖培养基中进行不定芽增殖, 经过 30 d
的诱导培养, 产生大量丛生芽, 其增殖倍数高达
3. 9, 并且苗生长状况良好, 选出增殖最适培养基为
MS+ 6-BA 1. 0 mg/ L+ NAA 0. 1 mg / L ;将复序橐
吾的增殖苗,分割单株作为生根苗,接入生根培养基
中诱导生根, 以 1/ 2 M S 为基本培养基, 附加 NAA
0. 5 mg/ L 时,生根率达 100%, 生出的根比较多,均
匀且粗壮,植株长势良好,故生根最适培养基为 1/ 2
M S+ NAA 0. 5 mg / L。
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(责任编辑 李 扬)
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