全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2006) 02-120-05
用 RAPD标记分析草地早熟禾遗传多样性
田志宏, 邱永福, 严　寒, 何　勇
(长江大学生命科学学院, 湖北荆州　434025)
摘要: 采用 RAPD分子标记技术对从美国引进的12 份草地早熟禾(Poa p ratensis L . )品种的遗传多样性进行分析。结果
表明, 从 60 个随机引物中筛选的 17 个有效引物共扩增出 104 条带, 其中多态性带 65 条,占总带数的 62. 5% , 平均每个
引物扩增出多态性带 3. 82 条; 利用 NTSYS-PC 软件计算品种间 Jaccard 遗传相似系数 ( GS) , 变化范围为 0. 362～
0. 971; 用非加权组法( U PGM A)聚类分析, 建立供试品种的分子系统树状图, 以相似系数0. 7 为标准分为 5 类,其中新哥
来德 ( NuGlade )、解放者( L iberato r )、浪潮( Impact)、午夜 ( M idnight)、自由Ⅱ( F reedom Ⅱ)、超级伊克利 ( T otal eclipse )
和纳苏( Nassau)共 7个品种聚为一类, 兰神( Nublue)和美洲王( America )聚为一类, 其余品种各自为一类; 该结果对引进
草地早熟禾品种资源评价与利用具有一定的参考价值。
关键词: 草地早熟禾; 遗传多样性; RAPD ; 聚类分析
中图分类号: S 812; Q943　　　　文献标识码: A
Genetic Diversity in Kentucky Bluegrass Based on Random
Amplif ied Polymorphic DNA ( RAPD) Analysis
TIAN Zhi-hong, QIU Yong-fu, YAN Han, HE Yong
( Co llege o f L ife Science , Yang tze Univ ersit y, Jing zhou, Hubei Pr ov ince 434025, China )
Abstract: Kentucky blueg rass ( Poa p ratensis L. ) is an important cool-season tur fg rass adapted to a w ide range
of soils and climates in China. The genet ic variation among varieties provides the theo ret ic and pr act ical basis
fo r variety extension and genet ic improvement . An analy sis of genet ic div ersity of the 12 cult ivars of the
kentucky bluegr ass int roduced from America w as carried out , using the RA PD marker s techno log y. Results
show that 17 ef fectiv e primers w ere screened fr om 60 ar bit rary primers, and a total of 104 DNA bands were
amplified; among which 65 DNA bands ( 62. 5%) w ere polymorphic, the average polymorphic DNA bands
amplified by each primer w as 3. 82. The range of Jaccards genet ic similarity coeff icient among the cultivars
computed by NTSYS-PC sof tw are changed w ithin 0. 362 to 0. 971. A DNA mo lecular dendrogr am was
established for the 12 cult ivars of kentucky bluegr ass based on UPGMA analysis. The cult ivars in the
dendrog ram were div ided into f iv e categ ories under the standard of 0. 7 sim ilar ity co ef ficient . Among them ,
“NuGlade”, “Liberator”, “Impact”, “M idnight”, “Freedom Ⅱ”, “T otal eclipse”, and “Nassau”clustered
together into one g roup; “Nublue”and “America”fo rmed ano ther; w hile the r est each formed its ow n
categor y. T he results are valuable for the est imat ion and development of the int roduced cult ivar resources of
kentucky blueg rass.
Key words : Kentucky bluegrass; Genetic div ersity ; Random amplified polymor phic DNA; Cluster analy sis
　　草地早熟禾( Poa p ratensis L. )喜光耐荫, 比其它
冷季型牧草更耐低温和频繁刈剪,绿期长, 颜色光亮鲜
绿, 草质柔软, 耐践踏, 能形成稠密的草皮, 常用于草坪
或绿地的建植, 是应用广泛的优良冷季型草坪草之一[ 1]。
收稿日期: 2005-08-25; 修回日期: 2006-02-17
基金项目: 湖北省重点科技发展计划项目 ( 992P0603) ; 湖北省教育厅重大科研项目( 99Z007) ;湖北省新世纪高层次人才工程科研项目 (鄂人
[ 2003] 31号)资助
作者简介: 田志宏( 1966-) ,男,湖北监利人,教授,博士,主要从事草坪植物生物技术研究, E-mail: zht ian@ yan gtz eu. edu. cn
第 14卷　第 2期
　Vo l. 14　 No . 2
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　　2006年　 6 月
　June　　 2006
目前,我国草地早熟禾品种几乎全部从欧美国家引进,
对该草种的研究主要集中在引种适应性[ 2, 3]和生理特
性[ 4]方面,有关遗传变异的报道较少。随机扩增多态性
DNA ( Random Amplif ied Polymorphic DNA, 简称
RAPD)是利用人工合成的随机引物,在 DNA 聚合酶
的作用下, 以生物基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增
而产生多态性片段。多态性片段的产生是由于不同品
种在其 DNA 等位区域内发生了基因突变、缺失、重复
等结构变异引起的引物结合位点及两结合位点间距离
的变化,从而使 PCR 扩增产生 DNA 片段多态性, 显
示 RAPD标记。该技术操作简单, DNA 用量少且引物
具通用性、广泛性 [ 5]。RAPD技术作为一种重要的遗传
标记手段,已被广泛用于草坪草及牧草的遗传多样性
研究[ 6～11]、亲缘关系和系统进化分析 [ 12～15] , 以及品种
和杂种纯度鉴定[ 16, 17]等方面。
本试验拟对从美国引进的 12个优良草地早熟禾
品种的遗传多样性进行 RAPD分析,探讨RAPD技术
对草地早熟禾品种遗传变异分析的可行性以及品种间
的遗传多样性, 同时建立适宜草地早熟禾的 RAPD 反
应体系,为进一步构建草地早熟禾品种基因组 DNA
指纹图谱及品种性状改良奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　材料
供试的 12个草地早熟禾品种由北京中种草业有
限公司和北京克劳沃种业有限公司提供,于 2001年从
美国引进,种植在长江大学西校区草坪试验基地。品种
编号及名称: 1. 兰神( Nublue) ; 2. 新哥来德( NuGla-
de ) ; 3. 百老汇( Broadway ) ; 4. 自由Ⅱ( Freedom Ⅱ) ;
5. 纳苏 ( Nassau ) ; 6. 解放者 ( L iber ator ) ; 7. 浪潮
( Impact ) ; 8. 超级伊克利 ( To tal eclipse ) ; 9. 优异
( Merit ) ; 10. 公园( Park) ; 11. 午夜( M idnight ) ; 12. 美
洲王( America)。
1. 2　方法
1. 2. 1　总 DNA 提取和纯化
总 DNA 提取参照 Edw ards 等 [ 18]的方法并作改
进。取供试草地早熟禾品种完全展开的幼嫩叶片 0. 1
g , 放在预冷的小型研钵中, 加入预热 80℃ 1. 5×
CTAB 提取缓冲液 1 m l,研磨成浆状,取 800 LL 装入
1. 5 ml微量离心管, 65℃水浴 20 m in, 其间颠倒 1次。
加入 600 LL 氯仿/异戊醇(体积比 24∶1)后上下颠倒
数次,至下层液相呈深绿色。13000 r/ min 离心3 min,
取 450 LL 上清液装入 1. 5 m l微量离心管, 加 1 m l
95%乙醇,在冰上静置 20 m in。13000 r/ m in 离心 10
min, 去上清液,用 70%乙醇浸泡沉淀数分钟后倒去,
自然晾干沉淀。待晾干后,加 150 LL 0. 1×T E及 2 LL
10 mg/ m l的 RNase A, 并在 55℃水浴中静置 30 min
完全溶解。加等体积的氯仿/异戊醇(体积比 24∶1)于
DNA 混合液中, 上下颠倒数次至下层液相变混浊,
13000 r / min离心3 min。取上清液于1. 5 ml微量离心
管中,加 300 LL 95%乙醇, 13000 r/ m in离心 10 min,
倒去上清液, 用 70%乙醇浸泡沉淀数分钟后倒去, 自
然晾干沉淀。最后加 100 LL 0. 1×T E 溶解 DNA 样
品,置 4℃保存,测定浓度后待用。
1. 2. 2　PCR扩增
RAPD反应体系参照 Golembiew ski等[ 16]的方法
并进行优化, 通过设置各反应参数的浓度梯度, 筛选出
最适的反应条件,扩增反应在英国产 Hybaid PCR 仪
上进行。在25 LL 的 PCR反应体系中,含2. 5 LL 的 10
×PCR buf fer, 2 LL 的 25 mmol/ L M gCl2, 0. 5 LL 的
10 Lmol/ L dN TPs, 1 U 的T aq酶, 60 ng 随机引物, 30
ng DNA模板。热循环参数为: 94℃预变性 3 min;再进
入循环, 94℃变性 1 min, 40℃退火 1 min, 72℃延伸 1
min, 共 40 个循环; 最后 72℃延伸 10 min, 于 4℃保
存。扩增产物在 1. 4%琼脂糖凝胶上电泳( 5 V/ cm) 2.
5 h 左右,经 0. 5 Lg / ml的EB 染色,用英国产 Syngene
凝胶图像分析系统观察并照相。PCR 扩增所用随机引
物、dNT Ps、T aq DNA 聚合酶购自上海生工( Sangon)
生物工程公司。
1. 2. 3　数据分析
对供试品种的 DNA 样品中扩增的电泳带总数及
多态性带的数目进行统计。每个样品的扩增带按有
( 1)或无( 0)记录。每次实验均重复 2次,对于多态性位
点,仅在重复实验中能稳定出现且清晰的 DNA 带用
于数据分析。利用NT SYS-PC软件计算品种间的遗传
相似系数,对得到的遗传相似性矩阵进行非加权组法
( UPGMA)聚类分析,建立草地早熟禾品种的聚类分
析树状图。
2　结果与分析
2. 1　总 DNA提取质量的检测分析
草地早熟禾 12 个品种提取的总 DNA 样品电泳
检测结果见图 1。可以看出提取的总 DNA 呈一条亮
带,电泳带型清晰、完整、均匀一致,带型基本没有弥散
现象,表明总 DNA样品纯度较高。通过 DNA样品浓
度的测定可知, 该方法提取的总 DNA 样品浓度较高,
大部分在 40～70 Lg/ ml之间,有的达 100 Lg/ m l,完全
121第 2期 田志宠等: 用 RAPD 标记分析草地早熟禾遗传多样性
能满足本实验所需的全部DNA样品量。同时, RAPD检
测表明,用该方法提取的总DNA 样品所扩增的带型清
晰,结果的重复性良好。可见,用改进的小量法提取草地
早熟禾的总DNA 能很好地满足RAPD分析的需要。
图 1　供试草地早熟禾品种提取的总 DNA 电泳图谱
F ig . 1　Electr ophor esis map o f the to tal DNA ex tr acted fr om
t he kentucky blueg rass cultivar s
1～12为品种编号,M 为 KDNA/ Hind Ⅲ+ E co RⅠ标准分子量,图
2同。
Th e material order f rom 1 to 12 corresponds to the k entucky
blu egrass cult ivar s; M r epresents KDNA/ Hind Ⅲ + Eco RⅠ marker;
sim ilar in Figure 2.
2. 2　RAPD多态性分析
首先用 S1～S60共 60个随机引物分别扩增 12个
品种的 DNA 样品, 筛选出扩增带型清晰且具多态性
的引物,由筛选的引物再次扩增各 DNA 样品,最后进
行带型统计的引物是扩增带型重复性好且清晰的引物
(图 2)。从筛选出的 17个引物中共扩增出 104条带,
其中多态性带 65条,占总带数的 62. 5% ;非多态性带
39条,占总带数的 37. 5%。每个引物扩增的多态性带
数目不同,最多的为 8条, 最少的为 1 条, 平均每个引
物扩增出多态性带3. 82条(表 1) , 表明草地早熟禾品
种的多态性较高,早熟禾属这种较高的多态性可能其
在自然条件下属异花授粉植物有关[ 13]。
RAPD 技术是利用一系列引物对整个基因组
DNA 进行多态性检测,检测区域几乎可以覆盖整个基
因组,可以检测出不同品种间的微小差异。因此,该技
术能有效地进行品种鉴定或纯度分析 [ 19]。本研究结果
表明,部分草地早熟禾品种具有 RAPD扩增的特异性
带。如公园( Park)在引物 S3和 S20扩增的产物中有
特异性带,而引物 S2能区分百老汇( Broadw ay )和公
园( Park) ,且将其余 10个品种分成两组。
图 2　引物 S2扩增供试草地早熟禾品种的 RAPD 带型
F ig . 2　RAPD po lymorphism s o f the kent ucky bluegr ass
cultivar s g enerat ed by pr imer S2
表 1　引物、序列和扩增结果
T able 1　L ist of primers, their sequences and amplified results
引物
Pr imers
序列( 5′-3′)
S equences
扩增带数
Amp lif ied bands
多态性带数
Polym or phic bands
多态性带百分率( % )
Percentage of polym orphic bands
S2 T GATCCCT GG 6 6 100. 00
S3 CAT CCCCCTG 9 6 66. 67
S9 T GGGGGACTC 5 3 60. 00
S12 CCTT GACGCA 6 3 50. 00
S13 T T CCCCCGCT 7 7 100. 00
S15 GGAGGGT GTT 3 1 33. 33
S16 T T TGCCCGGA 4 2 50. 00
S20 GGACCCT T AC 8 6 75. 00
S21 CAGGCCCT TC 6 3 50. 00
S26 GGT CCCT GAC 5 3 60. 00
S27 GAAACGGGTG 11 8 72. 73
S37 GACCGCT T GT 7 3 42. 86
S44 CAGAGGTCCC 5 4 80. 00
S49 T TCAGGGT GG 5 1 20. 00
S54 GT CGT TCCT G 6 3 50. 00
S57 AGGGGGTT CC 4 2 50. 00
S58 T GGGGACCAC 7 4 57. 14
总计 Total 104 65 62. 50
2. 3　遗传相似系数和聚类分析
根据带型统计分析结果, 计算各品种间的遗传相
似系数(表 2) ,同时利用 U PGMA 方法进行聚类分析
并建立分子系统树状图(图 3)。从遗传相似系数矩阵
122 草　地　学　报 第 14卷
可知,草地早熟禾品种间的相似系数变化范围较大, 为
0. 362～0. 971。其中解放者与浪潮之间相似系数最大,
表明两者的遗传差异较小, 而超级伊克利与公园之间
相似系数最小,表明两者的遗传差异较大。从图 3可
知,若以相似系数 0. 7为界,可将 12个草地早熟禾品
种分为 5类, 其中新哥来德、解放者、浪潮、午夜、自由
Ⅱ、超级伊克利和纳苏共 7个品种聚为一类,兰神和美
洲王聚为一类,优异、百老汇和公园各自聚为一类。由
此可见,草地早熟禾品种间的遗传差异较大,导致它们
的分类也较为分散。
表 2　供试草地草熟禾品种间遗传相似系数
T able 2　Genetic similar it ies coefficient among the kentucky blueg rass cultivar s
品种编号
No. of cul t ivar
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
1 1. 000
2 0. 754 1. 000
3 0. 609 0. 652 1. 000
4 0. 768 0. 870 0. 609 1. 000
5 0. 754 0. 768 0. 565 0. 783 1. 000
6 0. 739 0. 928 0. 580 0. 855 0. 725 1. 000
7 0. 768 0. 957 0. 609 0. 884 0. 754 0. 971 1. 000
8 0. 652 0. 783 0. 638 0. 797 0. 725 0. 797 0. 826 1. 000
9 0. 725 0. 681 0. 594 0. 667 0. 739 0. 638 0. 667 0. 725 1. 000
10 0. 449 0. 464 0. 377 0. 449 0. 580 0. 391 0. 420 0. 362 0. 435 1. 000
11 0. 768 0. 841 0. 580 0. 826 0. 725 0. 913 0. 884 0. 826 0. 638 0. 391 1. 000
12 0. 768 0. 696 0. 638 0. 681 0. 638 0. 681 0. 652 0. 536 0. 609 0. 420 0. 681 1. 000
图 3　供试草地早熟禾品种聚类分析树状图
F ig . 3　UPGMA dendrogr am gener ated by cluster analy sis
o f the kentucky blueg r ass cult ivar s
3　讨论与结论
3. 1　RAPD 是一种显性标记, 它能从分子水平上揭
示品种间存在的遗传差异, 但也有一定的局限性,主要
表现为稳定性较差。本实验从 60个随机引物中筛选出
带型清晰可辨并呈现多态性的引物 17个,严格保证
RAPD扩增反应体系的一致性, 稳定性较好。前人研
究表明,利用 RAPD分子标记对植物的遗传多样性进
行分析时,所得结论与形态学研究结果及其亲缘关系
基本一致[ 20, 21]。本研究结果表明, RAPD技术能有效
地检测出草地早熟禾品种间的遗传变异, 具有较高的
遗传多样性。且这种变异可能与品种的性状有关,我们
对其坪用性状的研究表明,超级伊克利、自由Ⅱ、解放
者和浪潮 4个品种的关联序依次排在最前面,综合评
定最好,均匀度表现最好, 抗旱性能也最强,它们依次
聚类在一起, 成为一类;同时综合评定优良的午夜也与
以上品种紧密地聚在一起, 但抗旱性能强的公园与以
上 4个品种聚类距离较远; 除以上性状外, 绿度最好的
3个品种浪潮、解放者和超级伊克利, 成坪后生长速度
最慢的浪潮和午夜,它们的相似系数均较大,聚类时都
各自分成一类[ 22, 23]。其它性状也存在类似情况,可能
暗示着性状表现相似的品种在聚类分析中常常比较靠
近,坪用性状表现相近的品种常有聚类在一起的趋势。
在供试草地早熟禾引物筛选中获得了品种的特异性
带,这些带可进一步转化为品种的指纹,成为区分其它
品种的特征带, 故利用 RAPD技术建立草地早熟禾品
种的指纹图谱是切实可行的。
3. 2　种质资源丰富的遗传变异是进行品种性状改良
和优良品种选育的前提。本实验中 12个草地早熟禾品
种间的遗传差异较大,它们在聚类树状图中分布也较
分散。其原因是草地早熟禾品种在自然条件下为异花
授粉植物,其中一些栽培品种常由若干选系组成,或直
接从不同生态环境下选育出来的,且染色体数目很多,
变化很大,以至于品种间的遗传基础复杂, 存在较大的
遗传差异[ 1, 24, 25]。因此,本研究结果可以反映目前国内
常用草地早熟禾品种遗传多样性的现状。
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(下转第 128页)
123第 2期 田志宠等: 用 RAPD 标记分析草地早熟禾遗传多样性
定: 随着温度的降低,叶片膜相对透性增大, 在处理温度
下的相对电解质外渗率均低于对照; 在自然低温条件
下, 3个诱变系束缚水含量、叶绿素含量明显高于对照;
与 10月下旬-12月上旬之间观察结果一致, 证实辐照
高羊茅突变体的抗冷性明显强于对照。
4. 3　3个突变体形态学上已发生变化,其鲜重和干重
均低于对照,株型变小[ 8] , 而且叶根比也降低, 这一形
态上的变化, 易于抵抗逆境(如干旱与冷害)。M 0、M 1
代 RAPD分析结果表明这些诱变体在 DNA 水平上发
生了变异。
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(责任编辑　才　杰)
128 草　地　学　报 第 14卷