全 文 ：第20卷 第4期
Vol.20 No.4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2012年 7月
Jul. 2012
基于双向电泳结合质谱分析燕麦种子
萌发过程蛋白的变化
王霞霞1,2,曹坳程3,柴守玺1*,李 3,徐智明2,常 磊1
(1.甘肃农业大学农学院,甘肃 兰州 730030;2.安徽农业科学院,安徽 合肥 230031;
3.中国农业科学院植物保护研究所,北京 100193)
摘要:为分析燕麦(AvenasativaL.)种子蛋白质在萌发过程中的变化,探求燕麦种子吸胀萌发的机理。采用双向
电泳结合基质辅助激光解析飞行时间质谱的方法对燕麦品种白燕2号种子吸涨萌发0h和25h的蛋白质进行了
分离和鉴定。结果表明:燕麦种子蛋白在吸水萌发25h后18个蛋白点的表达发生了显著变化;这些蛋白质点经质
谱分析并搜索NCBI数据库,有10个蛋白点得到明确鉴定,其中7个蛋白质点表达量在燕麦种子萌发后下降,3个
表达量增加。差异表达的蛋白质包括12s球蛋白、种子贮藏球蛋白和醇溶燕麦蛋白-3等蛋白。这些蛋白表达量的
变化与燕麦种子萌发进程有关,为进一步从蛋白质水平来探索燕麦种子萌发机理提供了理论依据。
关键词:燕麦;萌发;双向电泳;质谱;种子蛋白
中图分类号:S330.2;Q51 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2012)04-0729-06
AnalysisofProteinChangesduringOatSeedGermination
WANGXia-xia1,2,CAOAo-cheng3,CHAIShou-xi1*,LIYan3,XUZhi-ming2,CHANGLei1
(1.GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou,GansuProvince730070,China;
2.AnhuiAcademyofAgriculturalSciences,Hefei,AnhuiProvince230031,China;
3.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)
Abstract:AvenasativaL.‘baiyan2’seedgerminationpathswereexploredusingtwo-dimensionalgelelec-
trophoresiscombinedwithmassspectrometerytoanalyzedifferentialexpressionsofproteinsat0and25h
afterimbibition.Resultsshowedthateighteenproteinspotswerealteredat25hafterimbibition.Tenloci
wereidentifiedusingMALDI-TOFmassspectrometerysearchingNCBIdatabasewithMascotsoftware.
Theexpressionlevelsofsevenidentifiedproteinsdecreased,whilethreeidentifiedproteinspotsincreased
afteroatseedimbibitionat25h.Identifiedproteinsincluding12sglobulin,seedstorageglobulinandalco-
hol-solubleavenin-3wereinvolvedinoatseedgermination.Reporteddataareusefultoestablishapathway
formolecularmechanismsofoatseedgerminationattheproteinlevel.
Keywords:AvenasativaL.;Seedgermination;Two-dimensionalgelelectrophoresis;Massspectrome-
tery;Seedprotein
种子萌发是幼苗生长的先决条件。成熟的种子
内不仅有能发育成完整植株的胚,还有供胚发育所
需的营养物质。种子所贮藏的蛋白是萌发及萌发后
的幼苗生长早期所需碳氮营养及能量的唯一来源;
同时,蛋白质又是一切生理功能的执行者。因此了
解种子所贮存的蛋白质在萌发过程中的降解和利用
情况,是探讨种子萌发机理最直接的途径。蛋白质
研究技术为研究种子萌发过程中蛋白质的动态变化
提供了有力的手段,特别是蛋白质组技术的发展为
揭示种子萌发的机理提供了新的研究思路。姜文
等[1]采用酸性和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测了小
麦(Triticumaestivum L.)种子蛋白质变化对其活
力的影响;党根友等[2]对芸豆(Phaseolusvulgarisl
L.)不同部位(子叶和胚轴)的蛋白在萌发过程中的
动员利用进程做了分析,发现种子蛋白质类型的变
化与种子的活力关系密切。Tian等[3]发现在萌发
收稿日期:2011-12-07;修回日期:2012-05-12
基金项目:安徽省博士后基金资助
作者简介:王霞霞(1977-),女,甘肃庆阳人,博士研究生,主要从事作物生态生理的研究,E-mail:wangxiaxia1029@sina.com;*通信作者
Authorforcorrespondence,E-mail:sxchai@126.com
草 地 学 报 第20卷
过程中,燕麦(AvenasativaL.)种子总蛋白含量仅
略有增加,但其中的赖氨酸含量大幅度升高,到种子
萌发后期可增高30%。徐晓燕等[4]采用双向电泳
结合质谱的方法对大豆(GlycinemaxL.)种子萌发
过程中表达发生变化的蛋白进行了分离鉴定,探索
了种子萌发进程中蛋白质动员机理。
燕麦是禾本科燕麦属(AvenaL.)一年生草本
植物,分裸燕麦和皮燕麦2大类,产区主要集中在北
半球温带地区。中国也是燕麦主产区,尤以裸燕麦
为主。由于其生长快、再生性强、产草量高等优点,
很早就位于我国传统的优良牧草之列。而且研究报
道燕麦种子蛋白营养效价高,具备人体必需的8种
氨基酸;因此,在促进人体生长发育,提高免疫力方
面优于一般谷物蛋白[5-6]。调查结果也表明在未来
中国的粮食结构中,燕麦将可能成为我国第三主粮,
与稻米和小麦形成三足鼎立的结构[7]。
目前对燕麦种子蛋白研究多局限于蛋白的类型
和数量[8-11],以及萌发的生物化学变化[3],尚未有关
于燕麦种子蛋白在萌发进程中表达变化的研究报
道。为了解燕麦种子在萌发过程中蛋白质的变化,
本试验以燕麦白燕2号(baiyan2)品种为研究材料,
采用双向电泳结合基质辅助激光解析飞行时间
(MALDI-TOF)质谱方法研究燕麦种子贮藏蛋白质
在萌发进程中的表达变化,以揭示种子从相对静止
状态到活跃状态过程中涉及的蛋白质的表达变化,
为探讨种子萌发机理提供科学依据。
1 材料与方法
1.1材料及其培养
燕麦品种白燕2号种子,由甘肃农业大学保存。
种子饱满、种皮色泽正常,干燥度为9.64%。种子
经蒸馏水漂洗3次,置于垫有双层15cm定性滤纸
的玻璃培养皿中,每皿100粒,添加10mL蒸馏水,
于20℃恒温光照培养箱中避光培养。
1.2 测定指标及方法
1.2.1 种子鲜重和干重的测定 在0,0.5,1,1.5,
2,3,4,5,6,8,10,12,16,20,24,28和32h分别取
20粒种子,称鲜重;再在80℃下烘至恒重后称重;同
时以胚根突破种皮2mm为准统计萌发的种子数,
均重复3次。按公式:绝对含水量(%)=(鲜重-干
重)/干重×100%,萌发率=萌发种子数/种子总数
×100%,分别计算种子含水量和萌发率,并绘制燕
麦种子吸涨萌芽过程中含水量变化趋势图。
1.2.2 萌发期燕麦种子蛋白质的提取 依据种子
含水量变化曲线图,在种子吸胀0,1,8和25h时随
机选取20粒种子于冰浴研钵中添加液氮磨成粉状,
将燕麦种子粉末转入离心管中,约60mg燕麦种子
粉末分别加入1mL的 MilQ 水、70%的乙醇和
2.5%氯化钠溶液以及双向电泳裂解液(7mol·L-1
尿素、2mol·L-1硫脲、4%CHAPS、65mmol·L-1
二硫苏糖醇和0.5%IPG缓冲液),充分振荡混匀,
于4℃放置10h,12000g离心15min,吸取上清液,
即得蛋白质样品。考马斯亮蓝法测定样品液中蛋白
质的浓度后,分装于离心管中,-80℃冻存。
1.2.3 燕麦种子蛋白电泳和软件分析 将超纯水、
70%乙醇和2.5%氯化钠溶液提取0,1,8和25h的
燕麦种子蛋白用浓度为12.5%的SDS-聚丙烯酰凝
胶分离。取20μg蛋白样品与上样缓冲液于95℃水
浴孵育5min,自然冷却后,取等量的蛋白质样品于
加样孔进行电泳分离,起始电压80V,待样品走出
浓缩胶后,加大电压至100V。待溴酚兰指示剂距
电泳槽底部1cm处停止电泳。
用双向电泳裂解液提取0和25h的燕麦种子
蛋白用双向电泳分离。将800μg燕麦种子蛋白与
终体积350μL的水化上样缓冲液(8mol·L-1尿
素、2mol·L-1硫脲、4%CHAPS、65mmol·L-1二
硫苏糖醇及0.5%IPG缓冲液和痕量溴酚蓝)混合
均匀后加入聚焦盘进行等电聚焦电泳分离,第一向
电泳结束后,将胶条依次用含2.0%二硫苏糖醇和
2.5%碘乙酰胺的平衡缓冲液(6mol·L-1尿素、2%
SDS、0.375mol·L-1Tris-HClpH8.8和20%甘
油)平衡。然后将平衡后的胶条用12%的 SDS-
PAGE凝胶进行第二向分离。起始电压50V电泳
0.5h,待样品走出凝胶后,用200V电压电泳至溴
酚兰指示剂距凝胶底部1cm处停止电泳。电泳结
束后凝胶置于考马斯亮蓝染色液中染色24h,用蒸
馏水 脱 色 至 背 景 清 晰 后,用 UMAX 扫 描 仪
(UMAX,台湾)扫描并采集图像。用PDQuest软件
(Bio-Rad,USA)分析蛋白点染色密度的变化。
1.2.4 差异表达蛋白泳带的鉴定 将染色密度变
化的点切割后置于离心管中。先用超纯水冲洗2
次,然后加入50%乙氰和25mmol·L-1的碳酸氢
铵溶液冲洗30min,移除液体,再加入纯乙氰脱色
过夜,便可获得白色不透明的胶粒。脱色干燥后的
蛋白质胶粒用100μL10mmol·L-1的二硫苏糖醇
037
第4期 王霞霞等:基于双向电泳结合质谱分析燕麦种子萌发过程蛋白的变化
于56℃水浴还原1h后加入50%乙氰和25mmol·L-1
碳酸氢铵溶液100μL清洗胶粒2次,最后用100
μL的55mmol·L-1碘乙酰胺溶液于避光处烷基化
1h。胶粒干燥后加入胰蛋白酶溶液,37℃酶解过
夜;加入 1%TFA 终止反应。最后用 Ultraflex
TOF质谱仪(Bruker,Germany)分析肽质量。用软
件 Mascot搜索NCBI非冗余蛋白质数据库。
2 结果与分析
2.1 燕麦种子萌发过程中含水量及萌发率的变化
为了明确供试燕麦品种白燕2号种子的吸水和
萌发规律,优化萌发期蛋白质研究的取样时间。试
验测定了种子萌发期含水量的变化,并统计萌发率,
得到了白燕2号种子萌发过程中含水量变化趋势图
(图1)。由图1可知,燕麦种子在0~1h内吸水最
快,绝对吸水量达11.0%。在1~20h期间吸水较
慢,绝对吸水量从11.0%增至42.4%,在20h后种
子吸水幅度继续升高,但变化不大。燕麦种子萌发
集中在吸水后的22~32h之间,萌发率达92%,表
明燕麦种子萌发比较集中。根据Bewley[12]提出的
种子萌发过程含水量的变化理论,可以确定燕麦种
子快速吸水期(第1阶段)在0~1h;缓慢吸水期(第
2阶段)在1~20h;生长吸水期(第3阶段)是20h
之后,此时胚根已突破种皮,幼苗生长开始。因此,
将燕麦白燕2号种子萌发过程中蛋白质的取样时间
定为0,1,8和25h是合理的,能够反应燕麦品种白
燕2号种子萌发过程中种子蛋白质组的变化。
图1 燕麦种子萌发过程中的含水量变化趋势图
Fig.1 Moisturecontentsduringoatseedgermination
图2 燕麦种子蛋白质萌发过程SDS-PAGE电泳图谱
Fig.2 SDS-PAGEmapsofoatseedproteinsatdifferentgerminatingstages
注:a为水溶性蛋白电泳图;b为2.5% NaCl盐溶性电泳图;c为70%乙醇溶液溶解蛋白电泳图
Note:ashowsSDS-PAGEmapsofoatseedproteinswithMilQwater;bshowsSDS-PAGEmapsofoatseedproteinswith
2.5% NaClsolution;cshowsSDS-PAGEmapsofoatseedproteinswith70%ethanol
2.2 燕麦种子萌发进程中蛋白质变化的初步分析
如图2所示,以0h蛋白电泳条带为参照分析
不同溶解性蛋白在萌发过程中的差异表达。结果显
示:在萌发过程中,燕麦种子的水溶性蛋白和盐溶性
蛋白电泳条带无显著变化;醇溶性蛋白在吸涨1h
的蛋白电泳条带没有明显的变化;随时间的延伸吸
涨萌发25h时,在较大分子量35.0~66.2kDa区
间出现较明显的变化。为了进一步分析参与燕麦种
子萌发过程的蛋白,采用基于双向电泳的蛋白质组
学方法对吸涨萌发0和25h的燕麦种子全蛋白电
泳分离并鉴定分析。
2.3 燕麦种子双向电泳凝胶中蛋白点的鉴定
根据蛋白质点染色密度达2倍变化为判定依
据,对0和25h的燕麦种子双向电泳凝胶中蛋白质
点进行分析。结果发现18个蛋白质点发生了显著
变化。说明这些蛋白质参与了燕麦种子的萌发过
程。将这些变化的蛋白质点用 MALDI-TOF质谱
分析,并经 Mascot搜索 NCBI非冗余蛋白质数据
库,仅10个蛋白质点得到有效鉴定。这可能与燕麦
137
草 地 学 报 第20卷
种子蛋白的信息缺少有关。得到鉴定的蛋白质点在
双向电泳凝胶中的位置如图3所示,其中7个蛋白
质表达量下调,3个蛋白质表达量增加。所鉴定蛋
白质的信息如表1所示,包括蛋白质的名称、数据库
登录号、理论分子质量、等电点及质谱得分等。
燕麦种子萌发后表达量下降的蛋白质主要是种
子贮藏蛋白、燕麦蛋白和醇溶蛋白前体等,表达量增
加的蛋白质包括燕麦醇溶蛋白-3和燕麦蛋白等。
此外,由质谱鉴定结果发现,二维凝胶图谱中具有不
同的分子质量和等电点(蛋白质点2,3,4,5和8)鉴
定为同一蛋白-燕麦蛋白,这可能是燕麦蛋白因遗
传变异、翻译后修饰(磷酸化、糖基化或泛素化等)以
及水解等作用而在凝胶中呈现多个蛋白点。
图3 燕麦种子蛋白萌发过程的双向电泳图谱
Fig.3 Two-dimensionalgelelectrophoresismapofoatseedproteinsatdifferentgerminatingstages
注:a为燕麦种子吸水0h蛋白的双向电泳图谱;b为燕麦种子吸水25h时蛋白的双向电泳图谱;蛋白点1~10为质谱鉴定表达变化的蛋白点
Note:ashowstwo-dimensionalgelelectrophoresismapofdriedoatseedproteins;bshowstwo-dimensionalgelelectrophoresis
mapofoatseedproteinsat25hafterimbibition;Proteinspots1~10correspondtoproteinidentificationbymassspectrometer
表1 MALDI-TOF-MS质谱鉴定燕麦种子萌发过程表达变化的蛋白点
Table1 IdentificationofdifferentialproteinspotsduringoatseedgerminationbyMALDI-TOFmassspectrometer
蛋白点
Spot
蛋白名称
Proteinname
登录号
AccessionNo.
分子质量
Molecularweight/kDa
等电点
Isoelectricpoint
得分
Score
1 种子贮藏蛋白Seedstorageprotein gi:166568 24.506 7.55 188
2 燕麦蛋白Aveninprotein gi:166557 25.911 8.15 73
3 燕麦蛋白Aveninprotein gi:166557 25.911 8.15 167
4 燕麦蛋白Aveninprotein gi:327315253 26.116 7.72 82
5 燕麦蛋白Aveninprotein gi:166557 25.911 8.15 64
6 醇溶蛋白前体Permatinprecursor gi:1373392 24.573 8.45 212
7 P10Sh148J07 gi:262411008 68.556 8.82 74
8 燕麦蛋白Aveninprotein gi:166557 25.911 8.15 158
9 12s球蛋白12sglobulin gi:2764800 58.531 8.41 72
10 燕麦醇溶蛋白-3Alcohol-solubleavenin-3 gi:693794 23.718 6.06 97
3 讨论
蛋白质是细胞生物功能的最终体现者。生物体
在不同的发育阶段会合成不同类型和数量的蛋白
质,这些蛋白质构成了细胞各时期生命活动的基础,
因此了解蛋白质的变化是认识生命活动本质的直接
途径[13]。蛋白质组学研究技术的发展,为研究种子
萌发机理提供了新的策略。徐晓燕等[4]采用基于双
向凝胶电泳的蛋白质组学方法检测了大豆种子萌发
过程中蛋白质的变化。结果发现,在种子快速吸水
期间发生量或质的变化的差异蛋白仅占大豆种子总
蛋白的2.87%,到种子萌发时表达变化的蛋白也仅
仅增至6.38%。然而,He等[14]采用1-DE结合LC
MS/MS研究水稻(OryzasativaL.)萌发时全蛋白
质组电泳图谱,发现萌发时有673个蛋白质表达,按
其功能可分为14大类。数量最大一类是代谢相关
237
第4期 王霞霞等:基于双向电泳结合质谱分析燕麦种子萌发过程蛋白的变化
蛋白,这些代谢蛋白分别参与不同的代谢途径。许
丽璇等[15]采用双向电泳技术对水稻种子未萌发和
萌发1~4d胚进行蛋白质分离及鉴定分析,结果发
现随着种子萌发,种子胚蛋白质的表达数量逐渐减
少,萌发4d的种子蛋白表达量较未萌发种子减少
了38.6%;通过质谱鉴定确认了6个表达量变化较
大(2.5倍以上)的蛋白质,分别为硫氧还蛋白、热休
克蛋白、ATP合酶、LEA蛋白12、核苷二磷酸激酶
和乙二醛酶,其中核苷二磷酸激酶和乙二醛酶在萌
发后期表达量明显增加。在水稻萌发中还发现:萌
发过程中表达量下调蛋白主要是贮藏蛋白(如球蛋
白和谷蛋白)、与种子成熟有关的蛋白(早期胚胎蛋
白)以及与干燥有关的蛋白;表达量上调蛋白主要包
括UDP-葡萄糖脱氢酶、果糖激酶、葡萄糖磷酸变位
酶和丙酮酸脱羧酶[16]。本试验通过双向电泳对燕
麦种子萌发阶段的蛋白进行了电泳分离,结果发现
在燕麦种子萌发过程中12s球蛋白、燕麦蛋白和燕
麦醇溶蛋白-3等10个蛋白发生了变化。这些蛋白
质的差异表达与燕麦种子的萌发生理活动有关。
燕麦种子的贮藏蛋白与其他谷类有所不同。种
子蛋白质按其溶解性分为4大类:球蛋白、清蛋白、
谷蛋白和醇溶蛋白。其中后二者是谷物种子的主要
蛋白质[17]。然而燕麦种子蛋白质以球蛋白为主,约
占总蛋白的75%~80%,其次是醇溶蛋白,清蛋白
和谷蛋白的含量非常低[18]。前人研究发现燕麦蛋
白结构与小麦的α-,β-和γ-醇溶蛋白及大麦B-醇溶
蛋白结构相似,具有同源性[19]。这说明本试验中所
鉴定得到的燕麦种子萌发时发生差异表达的蛋白质
主要为醇溶类蛋白(70%),例如蛋白点2,3,4,5,8
为燕麦蛋白(gi:166557和gi:327315253);蛋白点6
为醇溶蛋白前体(gi:1373392);蛋白点10为燕麦醇
溶蛋白-3(gi:693794)。而作为燕麦种子蛋白主要
组分的球蛋白,在萌发过程中仅鉴定到12s球蛋白
发生了变化。据此推断,燕麦种子中大量的球蛋白
可能主要用于萌发后幼苗的形态建成活动中。党根
友等[2]、庄炳昌等[20]研究发现,在萌发过程中高分
子量蛋白亚基先降解,且降解速度大于低分子量蛋
白亚基。也有研究报道燕麦种子在萌发过程中总蛋
白含量降低,但可溶性蛋白含量增加[21]。路苹等[22]
在小麦萌发中发现,随萌发的进行种子的醇溶蛋白
含量降低。邱然等[23]也发现大麦(Hordeumvul-
gareL.)萌发过程中随着清蛋白含量的升高,其主
要蛋白质醇溶蛋白的含量越来越低,而且醇溶蛋白
的降解量与内肽酶活力的升高正相关。据此推断萌
发期内大麦种子醇溶蛋白的降解是萌发的氮营养主
要来源。然而也有研究认为醇溶蛋白是在谷物成熟
后期合成,并将淀粉颗粒包裹起来[24],因此在种子
萌发过程中,如果醇溶蛋白降解不完全将会使得淀
粉酶与淀粉颗粒的结合形成物理屏障,从而限制淀
粉的水解[25],最终会削弱种子的生理功能。而Kim
等[26]在大豆上发现萌发期大豆和早期大豆幼苗中
80%的差异表达蛋白是大豆种子的主要储藏蛋白-
大豆球蛋白和伴大豆球蛋白的亚基。这可能是物种
差异所引起的。
4 结论
本试验以双向电泳结合 MALDI-TOF对燕麦
种子萌发阶段的蛋白表达进行了研究。结果发现,
在萌发过程中,燕麦种子的种子贮藏蛋白、燕麦蛋
白、醇溶蛋白前体等10个蛋白质发生了差异表达。
经分析,其中70%的蛋白质属于醇溶蛋白。这些蛋
白质的降解变化与燕麦种子的萌发有关,为从蛋白
质水平探索燕麦种子吸涨萌发的机理提供了科学依
据。然而,为了揭示燕麦萌发阶段蛋白质的降解利
用,全面系统的认识燕麦种子萌发机理,还需结合多
种组学技术进行全面的研究。
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(责任编辑 李美娟
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