全 文 ：第 18 卷 第 4 期
Vol. 18 No. 4
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2010 年 7 月
Jul. 2010
结缕草赤霞素和脱落酸的生物合成与代谢
过程中关键基因片段的克隆
张 鹂, 桂金山, 方 程*
(中国农业大学动物科学技术学院草业科学系/草业科学北京市重点实验室, 北京 100193)
摘要: 在高等植物中, 内根-贝壳杉烯酸氧化酶( KAO)、GA20-氧化酶( GA20ox )、GA3-氧化酶( GA3ox )、玉米黄质环
氧酶( ZEP)、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶( NCED)、8-`羟化酶( CYP707A )和 GA2-羟化酶( GA2ox )被证明在
赤霉素( GA)和脱落酸( ABA)的生物合成与代谢途径中起着重要作用。为进一步确定结缕草 (Zoy sia j aponica)
( ABA )和( GA )合成代谢途径中的关键基因与休眠机制,于 2009 年 8 月从野生结缕草和海青一号结缕草中分离并
克隆出了相关的重要基因: Zj ZE P、Zj GA20 ox、Zj GA2ox、Zj GA3ox、Zj NCED、Zj K A O、18S rR NA。通过测序和序
列比对分析,确认了克隆序列的准确性。
关键词:结缕草; 基因克隆;赤霉素; 脱落酸
中图分类号: Q946. 885. 5/ 6 文献标识码: A 文章编号: 1007-0435( 2010) 04-0539-05
Cloning of the Key Genes involved in Zoysia j ap onica
ABA and GA Biosynthesis and Metabolism Pathway
ZHANG Li, GUI Jin-shan, FAN G Cheng
*
( T he Department of Gras sland Science, College of Animal S cien ce an d T echnology, China Agricultural University
/ Key Laboratory of Grassland Science, Beijing 100193, C hina)
Abstract: In eukaryot ic plants, ent-kaurenoic acid ox idase ( KAO) , GA 20-ox idase ( GA20ox) , GA 3-ox-i
dase ( GA3ox ) , Zeaxanthin epox idase ( ZEP) , 9-cisepoxycaroteno id diox ygenase ( NCED) , 8-`hydr oxy lase
( CYP707A) , GA 2-ox idases ( GA2ox) are convinced to play an important role in A bscisic acid ( ABA) and
Gibberellin acid ( GA) biosynthesis and metabolism pathway. A imed to further study of the key genes of
ABA and GA bio synthesis, metabol ism and their funct ion related w ith seeds dormancy in Zoy sia j aponica,
some genes w ere iso lated and cloned from Zoy sia j aponica w ild type and HaiQing No. 1 in August , 2009.
Sequence fragment of Zj ZEP、Zj GA20ox、Zj GA2ox、Zj GA3ox、ZjN CED、Zj K A O and 18SrRN A in Zoy sia
j aponica were cloned successfully. The accuracy of cloned sequence w as confirmed by sequencing and alig-
ning . .
Key words: Zoy sia j ep onica ; Cloning; Gibberellin acid; Abscisic acid
迄今利用大量影响种子休眠和萌发相关突变体
及同位素示踪技术的应用发现, 在种子休眠获得或
解除过程中起关键作用的内源信号分子即是脱落酸
( Abscisic acid, ABA ) 和赤霉素( Gibberellin acid,
GA)
[ 1] 。一方面有关激素平衡理论的研究表明, 种
子吸水后脱落酸的合成对于休眠的维持是必需的。
对玉米( Zea may s )的进一步研究显示,种子休眠或
萌发取决于活性脱落酸和赤霉素的平衡, 而不是单
一激素的绝对含量 [ 2, 3]。但关于这 2种激素相互作
用的机理及其调控种子休眠和萌发的信号通路, 目
前尚不清楚。另一方面,有大量的实验发现玉米黄
质环氧化酶( ZEP) 、9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧
酶( NCED)是催化有生物活性脱落酸合成的关键
酶[ 4~ 12] ;内根-贝壳杉烯酸氧化酶( KAO)、GA20-氧
化酶( GA20ox) 和 GA3-氧化酶( GA3ox)是催化生
物活 性 赤 霉 素 合 成 的 关 键 酶; 8-羟 化 酶
( CYP707A) 和 GA2-羟化酶( GA2ox)分别在脱落
酸和赤霉素的失活代谢中起关键的作用 [ 13~ 19] ,而赤
霉素与脱落酸又是影响种子休眠的重要激素,研究
这些激素的合成与代谢途径,有利于深入研究休眠。
收稿日期: 2010- 03-11;修回日期: 2010- 05-10
基金项目:国家自然科学基金( 30972137)
作者简介:张鹂( 1986- ) ,女,四川彭州人,硕士研究生,研究方向为牧草分子技术, E-m ail: zhanglicau@ gmail. com; * 通讯作者 Author for
cor resp ond ence, E-mail: f angcheng@ cau. edu . cn
草 地 学 报 第 18卷
目前在很多植物中都克隆出了相关基因。烟草
( N icot iana p lumbagini f olia ) NpZEP 是最先发现
与 ABA 生物合成有关的酶, NpZEP 基因表达量的
增加与 ABA 含量增加呈正相关; 过量表达 NpZEP
不增加 ABA 含量, 但促进种子休眠[ 20] , 表明 ZEP
调控的环氧类胡萝卜素的含量只在根的 A BA 合成
中起调控作用。NCED基因最初从玉米 ABA 缺失
突变体 vp14 中克隆到, 之后该基因相继在菜豆
( Phaseolus vulg ar is )、豇豆( Vig na unguiculata )、
鳄梨 ( Per sea amer icana ) 和拟南芥 ( A r abid op sis
thal iana )
[ 21~ 23] 等植物中克隆到, 已知的 N CED 都
包含 1个小基因家族。Satio 等 [ 24]和 Kushiro 等 [ 25]
都从拟南芥中分离出了编码 ABA 8-羟化酶的
CYP707A 基因家族。另外, GA20-氧化酶基因在菠
菜( S p inacia oler acea)、豌豆 ( Pisum sativum )、烟
草、多年生黑麦草 ( L ol ium perenne )等植物中克隆
出来。但在结缕草( Zoy sia j ap onica)中仅 GA20ox
得到克隆, 其他几个基因均还未见相关的报道。
结缕草是禾本科( Gramineae) , 结缕草属( Zoy-
sia)草本植物, 具有适应性广,抗旱性强、扩展力强、
耐磨性和耐践踏性强、弹性高等特性,被广泛用于足
球场、高尔夫球场的草坪建植、生态恢复、水土保持
和优良饲料等方面。同时, 结缕草草坪省水、省肥,
其管理费用较冷季型草坪草低 [ 26]。然而, 结缕草
种子具有深休眠特性,在自然条件下发芽率低、发芽
速度慢, 据报道, 未处理种子的发芽率通常低于
5%, 从而为其开发和利用带来了很大困难。并且,
根据休眠程度的不同, Matumura 将结缕草种子分
为 3个类型 [ 27] : 低休眠(平均发芽率达到 72% ) , 中
等休眠(平均发芽率达到 18% ) , 深休眠(平均发芽
率达到 2%)类型。这些不同休眠程度的结缕草种
子为草本植物休眠机制的研究提供了极好的材料,
并可将其作为草本植物休眠机制研究的模式植物。
为以后进一步研究结缕草 ABA 与 GA 生物合
成代谢途径中的关键基因以及结缕草的激素休眠调
控模式,本试验采用具有显著休眠差异的 2个结缕
草品系作为研究材料, 拟从结缕草种子中克隆出
ABA 和 GA生物合成及失活代谢途径中关键酶的
基因,为深入研究结缕草及其他种子休眠的分子机
理奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料与试剂
结缕草种子海青一号( H1)和野生型 ( WT )于
2009年采自青岛海源草坪有限公司结缕草种子繁
殖基地,带回中国农业大学草地研究所牧草种子楼
后低温保存。
所用的大肠杆菌 DH5菌株, 克隆载体 pMD-
18T, RNA提取试剂盒,反转录试剂盒,琼脂糖凝胶
回收试剂盒, 质粒提取试剂盒, 固相 RNAase 清除
剂等均购于北京天泽基因生物试剂公司。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 引物的设计与合成 通过查阅文献、搜索
GenBank, 根据已经在 GenBank 上登录的植物
K AO、GA20ox、GA3ox、GA2ox、ZEP、N CED、
CYP707A 、18 SrRN A 基因的 cDNA 序列, 用 B-i
oEdit 软件分析这些 cDNA 序列的保守区, 手工设
计引物,用 Primer Premier 5. 0检查引物的特异性
及其他各项指标, 引物由上海博尚生物技术有限公
司合成。
KAOF: 5-CTT CCT CCGCGCCT TCAAGTC-
3; KAOR: 5-GGAGGAAGACGGAGAT CTCCA
GC-3; GA3oxF: 5-CTT CTCCAAGCT CATGT-
GGT C-3; GA3oxR: 5-GT TGGTGAGGAT GT G
GAAGAG-3; GA20oxF: 5-AGGTGGT GAAC-
CACGGCAT-3; GA20oxR: 5-GT AGTGCCT C
T GCGTGAAGTC-3; GA2oxF: 5-T TCGGGT-
TCT TCAAGGTCGTCA-3; GA2oxR: 5-T TGT A
CGCAGCCTT CTT GT ACTC-3; ZEPF: 5-
T TAGCCGAAT GACGCTGC-3; ZEPR: 5-AGC-
T T GT T CCAAT GCAT CGT C-3; NCEDF: 5-
T GCAGAT CGCCGGCAACTT C-3; NCEDR: 5-
CT CGGTGATGGCGAAGTCGTG-3; CYP707AF:
5-AAGAACCCCAACGTGTT CTT-3; CYP707AR:
5-AGCACGAGCAT CT CCAGCT-3; 18SrRNAF:
5-GTACGTGCTACTCGGAT AACC-3; 18SrRNAR:
5-CT TGCTAT GTCT GGACCTGG-3
1. 2. 2 基因的克隆 结缕草萌动的种子与萌发
20 d 的幼苗提取总 RNA, 反转录试剂盒进行 cDNA
第一链的合成,特异的引物扩增相应的基因,回收试
剂盒回收 PCR产物, 扩增片段与 pMD18-T Vecto r
连接转化 DH5, 经酶切和 PCR 鉴定重组质粒, 挑
选阳性克隆送交上海博尚生物技术有限公司测序,
序列分析所用的软件为 BioEdit ( BioEdit ver sion
7. 0. 0) ,同源性检索分析通过在线 BLAST 软件进
行( http: / / www. ncbi. nlm. nih. g ov/ BLAST)。
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第 4期 张鹂等:结缕草 ABA 和 GA 生物合成与代谢过程中关键基因片段的克隆
2 结果与分析
2. 1 RNA的提取与反转录
将提取的总 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳, 电泳
结果如图 1、图 2所示。28S RNA和 18S RNA 条带
清晰, 证明获得了较完整的总 RNA,基本没有降解。
RNA 的光密度比值: OD260 / OD 280都介于 1. 7~ 2. 1
之间,表明几乎无蛋白质和苯酚污染,说明 RNA 的
纯度比较高,可以用于反转录。
图 1 海青一号幼苗总 RNA 变性胶电泳
F ig . 1 Denaturalized agaro se gel elect rophor esis
of To tal RNA fr om seedlings of H aiQing No. 1
图 2 海青一号种子总 RNA常规胶电泳
F ig. 2 Agaro se gel electr ophoresis o f
Total RNA from seeds o f Ha iQ ing No. 1
2. 2 目的片段的克隆
根据水稻、小麦、大麦、拟南芥,及其他物种同源
基因的核苷酸保守序列设计引物进行 RT-PCR 扩
增, 分别 得 到 ZEP、GA20 ox、GA2ox、GA3 ox、
N CED、CYP707 A、KA O、18S rRN A 等 8个基因的
部分基因片段, 且与预测的片段大小基本一致
(图 3)。
图 3 8 个基因 cDNA片段扩增结果
F ig . 3 Amplification result of eight genes from cDNA fr agment ( M : marker)
2. 3 阳性克隆的鉴定
用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的片
段,连接到 pMD-18T 克隆载体上, 转化大肠杆菌
DH5。从转化的平板上挑选白斑摇菌, 随机挑选
几个进行菌液 PCR,其中扩增出目的片段的可能为
阳性克隆, 测序以确定其正确性。
2. 4 测序结果及同源性分析
阳性克隆经测序(每个基因仅测一个反应) , 各
得到一段序列。通过生物信息学分析发现这些核苷
酸序列与水稻、小麦、大麦等相应基因序列具有很高
的相似性,并且结缕草的这些基因片段与上述物种
中的相应基因具有相似的保守区域或结构域。这也
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草 地 学 报 第 18卷
预示他们具有类似的功能, 同时也表明这些扩增片
段确实是结缕草中 GA 和 ABA 代谢途径中相应的
基因片段, 并将这些基因分别命名为: Zj ZEP、Zj-
GA20ox、Zj GA2ox、Zj GA3ox、Zj NCED、Zj C-
YP707A、Zj K AO。
3 讨论
种子休眠受到胚和种皮等器官的影响。内源激
素(主要是脱落酸与赤霉素)是胚调控种子休眠的主
要途径,而种皮阻碍水和气体进入,并且胚生长的机
械束缚形成对种子萌发具有抑制作用。结缕草种子
的休眠是种皮与胚共同作用的结果,属于综合型休眠[ 26]。
夏更寿等[ 28] 对光盐交互胁迫下台湾沟叶结缕
草的生理状况进行了研究;韩烈保等[ 29] 对低温胁迫
下结缕草品种的抗寒性差异做了分析; Ryo ji
Okaw ara等[ 30] 对低温和高温胁迫下结缕草的一些
生理指标变化进行了测定; 还有其他研究者也对各
种胁迫下(干旱、高盐、低温等)结缕草中相关激素、
酶的含量进行了测定。进一步地, Do 等 [ 31] 研究了
正常情况下休眠种子中 ABA 的含量, 并得出高浓
度的 ABA 可能是影响种子休眠最主要的因素, 外
源施用 ABA 能抑制非休眠种子萌发。Matthew [ 32]
研究了结缕草种子成熟过程中, ABA浓度与休眠程
度的关系。综上所述, 以往研究主要集中在 2 个方
面:休眠程度的测定和比较;生境条件如经纬度、海
拔和成熟期水热条件等对种子休眠性的影响等。
随着分子技术水平的发展,国内外大量学者开
始从细胞水平、分子水平研究植物的休眠与萌发机
理,并利用突变体、基因分离技术等从拟南芥、大麦、
玉米鉴定分离出了 ABA、GA 生物合成和代谢途径
中的关键基因, 还确定了部分基因的细胞学定位。
主要成果有:在种子休眠和萌发过程中起关键作用
的内源信号分子是脱落酸和赤霉素[ 1] ; ABA 的生物
合成主要是经间接途径由 C40类胡萝卜素氧化裂解
形成 ABA,在这个途径中的关键酶基因是玉米黄质
环氧化酶基因( ZEP)和 9-顺式-环氧类胡萝卜素二
氧化酶基因( N CED )。而 ABA 的代谢是通过羟基
化途径完成的, 在这个途径中的关键基因是 A BA
8-羟化酶基因( CYP707A ) [ 20~ 26] ; GA 调控植物的
生长主要是通过控制细胞内的 GA 浓度和细胞对
GA 的响应来实现的; GA 的生物合成途径中的关键
酶基因是 GA20ox 和 GA3ox ; GA 的失活代谢主要
是 2-羟化反应,催化此反应的酶也是依赖于 2-氧
化戊二酸的二氧化酶( GA2ox )。
前人的结论主要基于模式植物拟南芥和农作物
的研究而得, 在草坪草和牧草方面研究不多,而结缕
草作为我国重要的乡土草种,具有适应性广、抗旱性
强、耐磨性和耐践踏性强、弹性高等优良特性,是草
坪业潜在的应用草种。但由于其休眠性较强,不利
于种子直播式的草坪建植,因此其推广应用受到阻
碍。为克服结缕草种子休眠的瓶颈, 深入开展休眠
的分子机理研究成为必然。而在结缕草种子休眠的
生理实验所积累的数据显示, 植物激素, 尤其是
ABA和 GA 在调控结缕草中的休眠性方面起着重
要作用。为了阐明结缕草种子休眠和萌发过程中
ABA和 GA 消长与其代谢途径中相关基因的关系,
以及作为未来潜在的基因操作靶点, 本试验克隆了
结缕草ABA 代谢途径中的关键基因 Zj ZEP、
ZjN CED、Zj CYP 707A 和 GA 代谢途径中的关键
基因 Zj K A O、Zj GA20 ox、Zj GA3o、Zj GA2ox , 为下
一步 ABA 和 GA 途径中关键基因的确定、激素含
量与相关基因表达动态以及休眠调控模式的建立都
奠定了分子基础, 是结缕草分子水平研究的开端。
由于结缕草种子微小、淀粉含量丰富, 从种子中
提取高质量的 RNA 相对比较困难。因此探索出一
套适合于高淀粉含量种子的 RNA 提取方法。后续
的提取实验发现, 它不仅适用于种子 RNA 的提取,
而且对小苗和成熟的植株提取效果也很好。而进一
步的 RT-PCR 扩增发现, ABA 和 GA 代谢途径中
的相关基因在吸涨的种子和结缕草幼苗 cDNA 的
扩增效果和难易程度存在很大差异。因此,为了快
速地克隆出这些基因片段, 分别使用上述 2 组 cD-
NA 模板对这些基因进行分别克隆, 并达到预期的
目标。鉴于, 目前只克隆出这些基因的部分片段,并
未获得基因全长。因此,还不足以分析与其他物种
中相关基因的进化关系。但从这些克隆片段的同源
性搜索来看, 确实属于其他物种中相应的同源基因。
因此,进一步试验应集中在对结缕草种子从休眠到萌
发的进程中, 基因表达动态进行 Rea-l t ime PCR 分
析,找出与结缕草种子萌发或休眠相关的重要基因,
并获得基因的全长,对其功能进行深入研究。
4 结论
通过 RT-PCR,从我国野生的结缕草和海青一
号结缕草中获得了 Zj ZEP、Zj GA20ox、Zj GA2 ox、
Zj GA3 ox、ZjN CED、Zj K AO、18SrRN A 等基因的
部分序列,通过测序和序列比对分析,确认了克隆序
列的准确性, 且克隆出的核苷酸序与大麦、小麦和水
稻等物种中的相关基因具有较高的同源性,为结缕
草 ABA 和 GA 生物合成代谢途径的进一步研究以
及休眠研究奠定了基础。
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第 4期 张鹂等:结缕草 ABA 和 GA 生物合成与代谢过程中关键基因片段的克隆
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