全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 03-0190-04
16个天然冰草种群遗传多样性 RAPD分析
李景欣1, 2,云锦凤2 ,郭　军1
( 1. 内蒙古民族大学, 通辽　028042; 2. 内蒙古农业大学,呼和浩特　010019)
摘要: 采用 57 个 10 bp 随机引物, 对16 个天然冰草( A gropy r on cristatum)种群 352 个单株的基因组 DNA 进行 RAPD多
态性检测。结果表明:从 57个 RAPD引物中选出多态性标记的引物11 个;检测出 125 个位点, 102 个显多态性;用 Shan-
non 多样性指数量化的遗传多态度为 2. 19, 种群内和种群间遗传变异比例分别为 60%和 40% ,种群间的遗传相似度在
0. 7702～0. 9776之间 ,遗传距离的变化范围为 0. 0226～0. 2611; 聚类分析结果表明: 16 个种群大致可分为 4 类, 生境和
表型相近的种群基本聚为一类, 和形态学研究的结果基本一致, 证明物种变异与生境密切相关。
关键词: 冰草;遗传多样性; 遗传相似度;遗传距离; 聚类分析;随即扩增多态 DNA;种群
中图分类号: Q943　　　文献标识码: A
RAPD Analysis of the Genetic Diversity of 16 Natural Wheatgrass
Populations( Agropyron Cristatum)
LI Jing-xin
1, YU N Jin-feng
2 , GUO Jun
1
( 1. Agronomy College, Inner Mongolia Nat ionalit ies U nivers ity, T ongliao, Inn er Mongolia Auton omous Region 028042,C hina;
2. Ecology and Environmental S cience Col leg e, In ner Mongol ia Agricultural University, Huhhot ,
Inner M on golia Autonomous Reg ion 010019, China)
Abstract: Eleven random primers ( 10bp) w ere selected f rom 57 primers for RAPD analysis of 352 wheatgrass
individuals w hich w ere collected from 16 natural populations of Inner Mongolia. A hundred and thr ee polymor-
phic loci w er e detected fr om 125 loci. Calculated by Shannon Index , the average genet ic diversity was 2. 19, the
percentage of g enetic v ar iat ion were 60% w ithin each populat ion and 40% among the populat ions. T he inter-
population sim ilar ity r ange w as 0. 7702～ 0. 9776 and the interpopulat ion genet ic distance range w as
0. 0226～0. 2611. T hr ough cluster analysis, the 16 populat ions w ere divided into 4 categor ies. T he populat ions
w ith similar ecolo gical environment and prototype clustered to gether, a fact basical ly consistent w ith the result
of morphological research, indicat ing that species variat ion is clo sely related to the env ir onment .
Key word: A gropy ron cristatum; Genet ic diversity ; Genet ic similarity ; Genet ic distance; Cluster analysis ;
RAPD( Random Amplified Polymor phic DNA ) ; Populat ion
　　冰草( A gropy ron cristatum)为禾本科小麦族冰草
属的多年生草本植物,分布于欧亚大陆温寒带高原及
沙地。冰草是一种重要的植物资源,各种营养成份相对
较高, 具有较高的饲用价值[ 1] ,抗逆性和适应性强, 喜
沙质土壤,耐瘠薄,可用于防风固沙、水土保持等,生态
价值较高[ 2]。冰草作为重要的小麦野生近缘种, 对小麦
白粉病、黄矮病、锈病等病害具有高度免疫性,其众多
优异基因可用于小麦的遗传改良 [ 3]。
种质的遗传多样性评价是育种研究的重要内容,
它决定了这些种质在今后育种实践中的有效利用。经
典的形态学标记, 利用表型来研究基因多样性, 由于受
环境因素的影响, 有些情况下不能真实反映遗传变异,
必须进行更高水平( DNA 水平)的研究。随机扩增多态
DNA ( RAPD)是 1990年由Will iams等[ 4]提出的分子
标记技术,由于其快速、灵敏、简便易行,而且可以在无
任何分子生物学资料的物种上直接运用, 因而在植物
收稿日期: 2004-05-08;修回日期: 2004-12-25
基金项目:“863计划”资助项目,项目编号 2002AA241101
作者简介:李景欣( 1968-) ,女,蒙古族,内蒙古通辽市人,副教授,博士,主要从事植物遗传育种的教学与科研,已发表学术论文 10余篇
第 13卷　第 3期
　Vo l. 13　　No. 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　　2005年　 9 月
　Sept. 　　2005
遗传多样性及相关研究中得到广泛应用[ 5～8]。本研究
采用 RAPD技术对冰草的遗传多样性进行分析,从分
子水平探讨其遗传变异,从而为这一资源的遗传改良
及合理利用和保护提供可利用资料。
1　材料与方法
1. 1　材料
2002年 8月在内蒙古自治区冰草分布区分单株采
收成熟种子, 2002 年11月温室育苗, 2003年 5月移栽
到内蒙古农业大学试验田。本试验所采用的16材料分别
来自呼伦贝尔盟( 1份)、通辽市( 1份)、赤峰市( 3份)、锡
林郭勒盟( 7份)、达茂旗( 2份)和大青山( 2份)。
1. 2　DNA提取与 PCR扩增
每个种群选择株丛径中等、生长正常的单株 22
株,分别剪取叶片洗净, 液氮研磨备用。基因组 DNA
提取采用 CT AB法。PCR 反应总体系 25
l,包括 20
ng/
l模板 DNA 2
l, 100 Pmol /
l随机引物 1
l, 10
mmol/ L dNT PS 0. 25
l, 5 U /
l T aqDNA 聚合酶 0.
2
l, 10 mmo l/ L MgCL 2 2
l, 10X buf fer 缓冲液 2. 5

l及灭菌三蒸水补至 25
l。PCR 扩增反应基本程序
为 94℃预变性 3 min, 94℃变性 1 min, 37℃退火 1
min, 72℃延伸 1 m in, 45 次热循环, 在 72℃延伸 5
min。反应在PCR 仪上进行。扩增产物用1. 5%浓度琼
脂糖凝胶电泳分离 30～40 min, EB染色,紫外透射反
射仪上观察并用自动凝胶成像系统照相。
1. 3　引物
筛选出适宜引物 11个,引物序列如表 1所示。
表 1　RAPD 引物序列
T able 1　Sequences of t he RAPD pr imer
引物 Primer 序列 S equences 引物 Pr imer 序列 Sequences
S005 T GCGCCCTT G S315 CAGACAAGCC
S027 GAAACGGGTG S442 ACGTAGCGT C
S053 GGGGTGACGA S445 CCCAGTCACT
S125 CCGAAT TCCC S446 CCACGGGAAG
S133 GGCTGCAGAA S455 T GGCGT CCT T
S134 T GCTGCAGGT
1. 4　数据分析
样品扩增产物的电泳分离谱带在某一位点按有或
无记录。存在即赋值为“1”,反之则为“0”。做 0, 1矩阵
图,建立原始谱带矩阵输入计算机, 据此统计位点总
数、多态位点数和每个位点在群体中的分布频率。群体
的多态位点百分率 P= 该群体的多态位点数/位点总
数×100%。
　　用 Shannon 多样性指数来计算各种群的遗传多态
度 H o ,平均种群内的遗传多态度 H p op ,以及各种群的遗
传多态度总量 H sp ; 利用 POP-GENE1. 32软件计算群
体间的遗传相似度( F )和遗传距离( D )。用 UPGMA
( U nw eightedpair-gr oup method w ith arithmet ic mea-
ns)构建系统树。
2　结果与分析
2. 1　多太位点百分率
根据个体间扩增产物的一致性, 从 57个随机引物
中选取 11个,对 16 个冰草群体的遗传多样性进行分
析。每个引物扩增出 2～6个可辨认的片段, 共记录
125个片段, 其中 102个显多态性, 多态位点百分率为
83. 00%。由统计的谱带可见,多态位点百分率因引物
和群体而异。同一引物对不同的群体和个体扩增的条
带数不同,说明不同的群体及同一群体的不同个体均
存在较丰富的变异。图 1为引物 133分别对种群 6和
10的 1～22个个体扩增产物的电泳图谱。表 2列出了
11个引物在 16个种群扩增的总产物数。
图 1　引物 S133 对冰草种群 6 和种群 10个体
扩增产物电泳图谱
F ig . 1　Electr ophor esis dia gr ams of indiv idual amplified
pr oducts of A . cristatum POP6 and POP10 w it h pr imer S133
2. 2　群体遗传多态度
利用 Shannon多样性指数对 11个引物所检测到
的表型频率进行多样性分析, 根据群体的遗传多态度
( H o ) ,计算出平均遗传多态度( H pop )和遗传多态度总
量( H sp ) (表 3)。
191第 3期 李景欣等: 16个天然冰草种群遗传多样性的 RAPD 分析
表 2　选取的 11 个随机引物扩增产物数量
Table 2　Amplification pr oducts of the 11 arbitr ary pr imer s used in the study
引物 Prim er S005 S027 S053 S125 S133 S134 S315 S442 S445 S446 S455 合计 T otal
位点总数 T otal no. of RAPD loci 11 15 11 14 11 13 11 9 8 10 12 125
多态位点数 T otal no. of
polymorph ic polymorph ic loci
11 11 10 12 10 12 9 8 5 8 6 102
多态位点百分率( % )
Percent of polym or phic loci
100 74 90 86 90 92 82 90 63 80 50 83
表 3　由 Shannon 多样性指数估计的遗传多样性在冰草群体内和群体间的分布
T able 3　Par tito n of the genet ic diver sity w it hin and among stocks of A gropy ron cr istatum estimated by Shannon index
引物 Primer S 005 S027 S053 S125 S133 S134 S315 S442 S445 S446 S455 均值 Mean
H p op 2. 80 2. 12 0. 95 0. 61 3. 02 3. 91 3. 14 0. 97 3. 50 1. 20 1. 71 2. 19
H sp 3. 21 2. 93 1. 67 1. 22 4. 34 5. 36 5. 01 1. 76 6. 02 3. 25 2. 68 3. 22
H p op / H sp 0. 87 0. 72 0. 57 0. 50 0. 69 0. 73 0. 63 0. 56 0. 58 0. 37 0. 64 0. 60
( H sp -H pop ) / H sp 0. 13 0. 28 0. 43 0. 50 0. 31 0. 27 0. 27 0. 44 0. 42 0. 63 0. 36 0. 40
　　由表 3可知平均群体内的遗传多态度( H p op )为
2. 19,群体的遗传多态度总量( H sp ) 为 3. 22。由 H pop /
H sp比值可见,引物 S005和S446检测出群体内的最大
和最小遗传变异分别是 0. 87和 0. 37,种群内的遗传
变异均值为 0. 60。而种群间的遗传变异均值为 0. 40。
即种群内的遗传变异大于种群间。
2. 3　遗传距离
16 个冰草种群的遗传相似度( I )与遗传距离( D )
见表 4。分析结果表明, 遗传相似度最大为 0. 9776
( POP15 与 POP16 之间) , 最小为 0. 7702( POP7 与
POP13 之间 ) ; 遗传距离的变化范围在 0. 0226～
0. 2611之间。
对 RAPD数据进行聚类分析,构建了冰草的 U P-
GMA 系统树(图 2)。16个种群大致分成 2个群系, 从
二级聚类结果可看出, POP13、POP14、POP15 和
POP16 聚为 1 类; POP4 POP6 POP7 POP8 POP9
POP10聚为第2类 POP1、POP5聚为第 3类; POP2、
POP3、POP11和 POP12聚为第 4类。
表 4　遗传多样性相似系数及遗传距离
T able 4　Pairw ise similar ity co efficient and genetic distance
种群
populat ion
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 * *** 0. 9708 0. 8478 0. 9002 0. 8784 0. 8672 0. 8307 0. 8476 0. 8486 0. 8561 0. 8585 0. 8644 0. 8257 0. 8520 0. 8647 0. 8830
2 0. 0296 * *** 0. 8429 0. 9062 0. 8904 0. 8825 0. 8452 0. 8569 0. 8825 0. 8729 0. 8646 0. 9071 0. 8412 0. 9035 0. 8812 0. 9054
3 0. 1651 0. 1709 *** * 0. 9529 0. 8810 0. 8778 0. 8570 0. 8636 0. 8132 0. 7991 0. 8190 0. 8369 0. 7965 0. 8112 0. 8484 0. 8218
4 0. 1051 0. 0985 0. 0482 *** * 0. 9199 0. 9091 0. 8911 0. 9041 0. 8269 0. 8179 0. 8575 0. 8812 0. 8319 0. 8739 0. 8665 0. 8753
5 0. 1297 0. 1161 0. 1267 0. 0835 *** * 0. 9730 0. 8967 0. 9171 0. 8494 0. 8337 0. 8556 0. 8936 0. 8313 0. 8595 0. 8899 0. 8870
6 0. 1424 0. 1250 0. 1303 0. 0953 0. 0274 ** ** 0. 8988 0. 9104 0. 8582 0. 8411 0. 8583 0. 8879 0. 8069 0. 8575 0. 8845 0. 8715
7 0. 1855 0. 1681 0. 1544 0. 1153 0. 1091 0. 1067 ** ** 0. 9299 0. 8221 0. 7882 0. 8456 0. 8670 0. 7702 0. 8349 0. 8370 0. 8295
8 0. 1654 0. 1545 0. 1466 0. 1008 0. 0865 0. 0939 0. 0727 ** ** 0. 8345 0. 8080 0. 8534 0. 8666 0. 7801 0. 8269 0. 8505 0. 8488
9 0. 1641 0. 1250 0. 2068 0. 1901 0. 1633 0. 1529 0. 1959 0. 1809 * *** 0. 9555 0. 9124 0. 9202 0. 9148 0. 9125 0. 8804 0. 8623
10 0. 1553 0. 1359 0. 2242 0. 2011 0. 1819 0. 1730 0. 2380 0. 2132 0. 0456 * *** 0. 8745 0. 8896 0. 9069 0. 8834 0. 8425 0. 8412
11 0. 1525 0. 1455 0. 1997 0. 1538 0. 1559 0. 1528 0. 1677 0. 1586 0. 0916 0. 1341 * *** 0. 9689 0. 8746 0. 8857 0. 8714 0. 8635
12 0. 1457 0. 0975 0. 1780 0. 1265 0. 1125 0. 1189 0. 1427 0. 1432 0. 0832 0. 1170 0. 0316 *** * 0. 8919 0. 9242 0. 8988 0. 9003
13 0. 1915 0. 1729 0. 2275 0. 1840 0. 1848 0. 2146 0. 2611 0. 2484 0. 0891 0. 0977 0. 1340 0. 1145 *** * 0. 9306 0. 8230 0. 8204
14 0. 1602 0. 1015 0. 2093 0. 1348 0. 1514 0. 1538 0. 1804 0. 1901 0. 0916 0. 1240 0. 1214 0. 0789 0. 0719 *** * 0. 8836 0. 8946
15 0. 1454 0. 1265 0. 1644 0. 1433 0. 1166 0. 1227 0. 1780 0. 1619 0. 1273 0. 1714 0. 1376 0. 1067 0. 1948 0. 1237 ** ** 0. 9776
16 0. 1245 0. 0994 0. 1963 0. 1332 0. 1199 0. 1376 0. 1869 0. 1639 0. 1481 0. 1729 0. 1467 0. 1051 0. 1980 0. 1114 0. 0226 ** **
　　注:右上方是相似系数,左下方是遗传距离
Note: Figures on the diagonal upper righ t are pairw ise similarit y coef ficien ts , and those on the diagonal low er left show the genet ic dis tance
3　讨论与结论
3. 1　11个随机引物共检测到 124个位点, 其中多态
位点 103 个, 多态位点高达 83%。这充分说明了
RAPD检测方法的高度灵敏性。通过横向比较 RAPD
检测到的冰草属其他种多态位点百分率发现,冰草比
同属的蒙古冰草( A gr opyr on mongol icom )高[ 9]。
192 草　地　学　报 第 13卷
图 2　16个冰草种群的 UPGMA 系统树
Fig . 2　UPGM A dendrog r am of the 16 populat ions
o f Agropy r on cristatum
3. 2　16个冰草种群的遗传相似度( I )与遗传距离( D )
分析及 U PGMA 系统树构建结果表明, 生境和表型相
似的种群基本聚为一类,和形态学研究的结果基本一
致,说明了基因与环境密切相关。
3. 3　冰草具有丰富的遗传多样性水平,意味其具有较
高的适应生存能力和进化潜能,对保持生态系统的稳
定性和多样性具有重要作用 [ 10～12]。
参考文献
[ 1]　谷安琳, Larry Holzw orth,云锦凤,等. 中美牧草种质资源联合评
价试验网中国试验区试验报告[ J] . 草地学报, 1998, 6( 1) : 1-9
[ 2 ]　云锦凤,李瑞芬,米福贵. 冰草的远缘杂交及杂种分析 [ J] . 草地
学报, 1997, 5( 4) : 221-225
[ 3]　李立会,杨新民, 李秀全,等.通过属间杂交向小麦转移冰草基因
的研究[ J] . 中国农业科学, 1998, 31( 6) : 1-5
[ 4 ]　Williams J G K, Kub elik A R, L ivak K J . et al . DNA polymor-
phism amplif ied by arbit rary primers are usefu l as genet ic marker s
[ J ] .Nu cleic Acids Research , 1990, 18: 6531-6535
[ 5]　张红梅,赵萌莉, 李青丰,等. 内蒙古地区大针茅群体遗传多样性
RAPD研究[ J] . 草地学报, 2003, 2( 11) : 170-178
[ 6]　胡宝忠,刘娣, 胡国富,等.羊草遗传多样性的研究[ J] . 植物生态
学报, 2001, 25( 1) 83-89
[ 7]　Shim amoto Y,Hasegewa A, Abe J, et al. G lycin e soja g ermplasm
in Japan: is ozyme and chloroplast DNA variat ion [ J ] . S oybean
Gen et . New el. 1992, 19: 73-77
[ 8]　Hadr ys H, Balick M , S chierw ater B. Applicat ion of r andom amp li-
f ied polymorph ic DNA( RAPD) in molecular ecology[ J] . M olecu-
lar Ecology, 1992, 16: 45-56
[ 9]　解新明,云锦凤,尹　俊,等. 蒙古冰草遗传多样性的 RA PD 分析
[ J ] . 西北植物学报, 2002, 22( 1) : 56-62
[ 10] Yu H, Kiang Y T. Genet ic var iat ion in South Korean natu ral pop-
ulat ion of w ild s oybean (Glycine soja) [ J ] . E uphyt icn . 1993, 68:
213-221
[ 11] 周立伟. 分子生物学技术在濒危植物多样性研究中的应用[ J] .生
物工程进展, 1995, 15( 4) : 22-25
[ 12] 严华军, 吴乃虎. DNA 分子标记技术及其在植物遗传多样性研
究中的应用[ J] .生命科学, 1996, 8( 3) : 32-36
《草地学报》参加在台北举行的大陆科技期刊展
　　为推进和扩大海峡两岸科技文化和科技期刊出版的交流与合作, 中国科学技术协会与台北市杂志商
业同业公会联合举办的大陆科技期刊展览会于 2005年 9月 6-7日在台北举行。
展览内容包括:中国科学技术协会主管的科技期刊;各省、自治区、直辖市科协主管、主办的重点科技
期刊; 获国家优秀科技期刊奖的出版物;部分优秀科普图书。参加此次展览的科技期刊有 420种, 1万余
册; 还有科普图书 30种, 近160册。《草地学报》名列其中。展会期间,当地科技界、学术界、出版界、印刷界
以及工商界人士前来参观、洽谈;举行了学术论坛、专题演讲会, 并就各类科技出版物的出版、发行、版权合
作等相关内容进行了交流。
193第 3期 李景欣等: 16个天然冰草种群遗传多样性的 RAPD 分析