全 文 ：第 15 卷 第 5 期
Vol. 15 No. 5
草 地 学 报
ACTA AGRESTIA SINICA
2007 年 9 月
Sep. 2007
文章编号: 1007-0435( 2007) 05-0418-05
农杆菌介导犁苞滨藜 NHX 基因转化苜蓿
的影响因素
赵红娟, 张 博* , 李培英, 陈爱萍
(新疆农业大学草业工程学院, 新疆草地资源与生态自治区重点实验室, 新疆乌鲁木齐 830052)
摘要: 以新牧 1 号杂花苜蓿( Med icago v ar ia M artin. cv. Xinmu No. 1)和新疆大叶苜蓿( Medicago sativa L. cv.
Xinjiang Daye)无菌苗叶片和子叶为材料,通过根癌农杆菌 EHA105 介导转化犁苞滨藜 NH X 耐盐基因, 提高植株
耐盐性。本文对农杆菌转化条件进行研究, 结果表明: 以预培养 3 d 的子叶为转化受体, 菌液浓度 OD600为 0. 4~
0. 5 时, 浸染 10~ 15 min,然后转入附加 20~ 30 mg / L 乙酰丁香酮的共培养基, 培养 4 d, 可以获得较高的转化效
率;对抗性芽的 PCR检测初步证明, 外源基因整合到苜蓿的基因组中。
关键词: 苜蓿; 农杆菌; N H X 基因; 遗传转化
中图分类号: S541. 035. 03 文献标识码: A
Influencing Factors on Alfalfa Transformation with Atriplex dimorphostegia
NHX Gene Mediated by Agrobacterium tumef aciens
ZHAO Hong- juan, ZHA NG Bo* , LI Pe-i ying, CHEN A-i ping
( Xinjiang Key Lab oratory of Grass land Resou rces and Ecology, College of Gras sland Science,
Xin jiang Agricu ltural U niver sity, U rumqi, Xinjiang 830052, Ch ina)
Abstract: T he leaves and cotyledons of Med icago var ia Mart in cv. Xinmu No. 1 and Med icago sat iv a L.
cv. Xinjiang Daye w ere used as materials and influencing factors on the salt- tolerant gene ( NH X ) t rans-
formation of A tr ip lex d imor phostegia Kar. et. Kir. by Agr obacter ium tumef aciens EHA105 w ere stud-
ied. T he results show ed that the opt imum tr ansformation condition for cotyledon precultured 3 days and
bacterial concentrat ion of OD 600 0. 4~ 0. 5 w as immersing for 10~ 15 minutes, then lay ing cotyledons in co-
culture medium w ith addit ion o f 20~ 30 mg / L acetosy ringone for 4 days. The PCR analy sis show ed that
the NH X gene had been integr ated into the genome of alfalfa.
Key words: Alfalfa; A grobacter ium tumef aciens ; N H X gene; Genet ic tr ansformat ion
土壤盐渍化是影响农业生产和生态环境的重要
因素。全世界的盐碱地约占陆地面积的三分之一,我
国也有大面积的盐碱地,仅海岸、滩涂就达 6. 67 @ 106
hm
2
,且有逐年增加的趋势。苜蓿( Medicago sat iva)
具有营养价值高, 抗逆性强,适口性好等优点, 是生
态环境治理的优良草种。但苜蓿属于中等耐盐植
物,适宜在轻度盐碱地上种植,超过它的耐盐极限时
就不能正常生长, 那么, 如何提高其耐盐性, 扩大种
植范围,是当前苜蓿生产面临的重要研究课题。而
采用传统的育种方法选育耐盐品种进展缓慢, 随着
生物技术的发展和广泛应用,利用转基因技术提高
苜蓿的耐盐性已成为可行的手段。
NH X ( Na+ / H + ant iporter)为液泡膜中的一种
Na
+
/ H
+ 反向运输体, 可促进 N a+ 和 Cl- 在液泡中
的分室效应,不仅可以作为有效的渗透调节剂, 同时
还可减小细胞毒性[ 1, 2]。在转基因拟南芥、油菜和
西红柿中过量表达 A tNH X 1 可在液泡膜中积累大
量的运输体,并且极大地提高了它们的耐盐性[ 3~ 5] 。
本研究以农杆菌介导犁苞滨藜 NH X 基因转
入苜蓿基因组中为目标,对影响农杆菌转化的因素
收稿日期: 2007-06-04; 修回日期: 2007-07-03
基金项目: 新疆维吾尔自治区教育厅高校重点研究项目( XJEDU 2004118)
作者简介: 赵红娟( 1979-) ,女,宁夏人,硕士研究生,主要从事牧草生物技术育种研究; * 通讯作者 Auth or for corr espondence, E- mail :
xjauzb@ 126. com
第 5期 赵红娟等:农杆菌介导犁苞滨藜N H X 基因转化苜蓿的影响因素
进行研究,优化转化体系, 以提高转化效率, 为培育
耐盐苜蓿新品种提供技术参考。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 试验材料 供试材料为新牧 1号杂花苜蓿
(Medicago v ar ia Mart in. cv. Xinmu No. 1)和新疆
大叶苜蓿(Medicago sativa L. cv. Xinjiang Daye) ,
由新疆农业大学草业工程学院牧草与草坪教研室提
供。将种子在 70% 乙醇中浸泡 30 s, 0. 1% HgCl2
消毒 10 min,无菌水清洗 3~ 5次,接种到含琼脂 0.
7%和蔗糖 3%的 1/ 2 M S固体培养基上, 25 e , 12 h
光照下培养。切取无菌苗 5~ 7 d龄子叶和 15~ 20
d 龄叶片, 用于遗传转化试验。根癌农杆菌
( A grobacter ium tumef aciens )菌株为 EHA105, 植
物表达载体为 pBin438, 该载体含新霉素磷酸转移
酶基因( N PTⅡ)和犁苞滨藜 NH X 基因 [ 6] , 基因克
隆、质粒构建及转化均在新疆大学新疆生物资源基
因工程实验室完成。
1. 1. 2 培养基 以苜蓿叶片为外植体,预培养培养
基( M S1) : MS+ 2 mg/ L 2, 4-D+ 1 mg/ L NAA + 1
mg/ L KT + 3% 蔗糖+ 0. 7% 琼脂[ 7] ; 共培养基:
MS1+ 20 mg/ L AS;脱菌培养基: M S1+ 200 mg/ L
Carb;抗性愈伤组织筛选培养基: MS1 + 40 mg/ L
Kan+ 200 mg/ L Carb。
以苜蓿子叶为外植体, 预培养培养基 ( MS2) :
MS+ 2 mg/ L 2, 4-D+ 0. 5 mg/ L KT + 3%蔗糖+
0. 7% 琼脂; 分化培养基 ( M S3) : M S + 0. 1 mg/ L
NAA+ 0. 5 mg/ L 6-BA + 3%蔗糖+ 0. 7%琼脂; 共
培养基: M S2+ 20 mg/ L AS; 脱菌培养基: M S2 +
200 mg / L Carb; 抗性愈伤组织筛选培养基: MS2+
50 mg/ L Kan + 200 mg/ L Carb; 抗性芽筛选培养
基: M S3+ 10 mg/ L Kan+ 200 mg / L Carb。
1. 2 试验方法
挑取单菌落接种于含有 50 mg/ L 卡那霉素
( Kan)的 YEB 液体培养基[ 8] , 28 e 振荡培养 16 h,
以液体诱导培养基稀释菌液。外植体预培养后浸入
稀释的菌液中, 取出置于无菌滤纸上, 吸干表面菌
液,接种到共培养基上,外植体和农杆菌共培养后转
入脱菌培养基, 2周后把外植体愈伤组织转至筛选
培养基,再过 3周将抗性愈伤组织转至抗性芽筛选
培养基,诱导抗性绿芽的发生。
1. 2. 1 选择培养基中 Kan选择压的确定 取无菌
苗 15~ 20 d龄叶片和 5~ 7 d龄子叶, 接种于含 0、
10、20、30、40、50、60、80、100 mg/ L Kan的 MS 诱导
培养基中。取叶片和子叶的胚性愈伤组织转至含
0、10、20、30、40、50 mg/ L Kan的分化培养基上。
1. 2. 2 影响苜蓿转化效果因子的设计 主要因子
有:不同品种(新牧 1号杂花苜蓿、新疆大叶苜蓿)、
外植体类型(叶片、子叶)、农杆菌浓度( OD600值分别
为 0. 1、0. 3、0. 4、0. 5、0. 6、0. 7、0. 9)、乙酰丁香酮
( AS)浓度( 0、10、20、30、50 mg / L )、浸染时间( 1、5、
10、15、20、25 min)、预培养时间( 0、1、3、5 d)、共培
养时间( 1、2、3、4、5、6 d)。各处理设 3次重复。采
用 DPS数据处理系统 3. 01进行显著性分析。
1. 2. 3 转化效率评价指标 抗性愈伤率( % ) = 抗
性愈伤组织数/浸染的外植体总数@ 100
1. 2. 4 PCR检测 抗性愈伤组织不定芽的 DNA提
取( CTAB 法)和 PCR检测参照王关林和方宏筠的方
法[ 8]。对根据 NH X 基因和 N PTⅡ基因已知序列设
计引物,扩增其片段大小分别为 1008 bp和 462 bp。
犁苞滨藜 NH X 基因 PCR扩增引物:
P rimer 1 5c-GAACGAGT CCAT CACT GCC-
CTA C-3c;
P rimer 2 5c-GACAATCT GCTGGT TGAAAG-
T GA-3c。
N PTⅡ基因 PCR扩增引物:
P rimer 1 5c-CGT T GT CA CT GAAGCGGGA-
AGG-3c;
P rimer 2 5c-GAGCGGCGATACCGTAAAGC-
ACC-3c。
2 结果与分析
2. 1 确定培养基中 Kan选择压
由图 1 可知, 在不同 Kan 浓度的诱导培养基
上, 30 d后叶片和子叶都出现不同程度的白化, Kan
浓度超过 40和 50 mg/ L 时, 叶片和子叶都没有愈
伤组织形成, 外植体全部死亡。愈伤组织分化胚状
体时期,对 Kan较为敏感。本试验中随 Kan浓度的
升高,愈伤组织分化率降低, 在 Kan为 20 mg/ L 和
10 mg/ L 时,叶片和子叶形成的小植株多数白化,不
能发育为正常的再生苗。在愈伤组织形成时期, 叶
片以 40 mg/ L Kan, 子叶以 50 mg/ L Kan对转化体
进行筛选; 在胚状体形成时期, 叶片以 20 mg / L
Kan, 子叶以 10 mg/ L Kan对转化体进行筛选。
419
草 地 学 报 第 15卷
图 1 Kan对愈伤组织诱导率( A)和分化率(B)的影响
F ig . 1 Effect o f kanamycin on callus ratio ( A ) and different iation r atio ( B)
a:子叶 b:叶片 a: Cotyledon; b: L eaf
2. 2 转化体系的优化
2. 2. 1 品种及外植体类型对转化效率的影响 由
表1可知,在相同培养条件下, 新牧 1号杂花苜蓿抗
性愈伤率为 33. 1% ,新疆大叶苜蓿为 31. 5% , 两者
差异不显著。以新疆大叶苜蓿的叶片和子叶为材
料,叶片的抗性愈伤率为 15. 8% ,子叶为 36. 4%, 两
者的差异极显著( P< 0. 01) , 故本试验中采用苜蓿
子叶为转化受体。
表 1 品种和外植体类型对转化效率的影响
T able 1 Effects of var iety and explant type on
tr ansfo rmation efficiency
品种
Variety

抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
resistant callus
外植体类型
E xplants typ e

抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
resis tant cal lus
XM 33. 1aA 叶片 Leaf 15. 8bB
DY 31. 5aA 子叶 Cotyledon 36. 4aA
注: XM 新牧 1号杂花苜蓿; DY新疆大叶苜蓿;同列中不同小写
字母间差异显著( P< 0. 05) ,不同大写字母间差异极显著(P < 0. 01)
Note: XM: Med icago. varia Mart in. cv. Xinm u No. 1; DY:
M edicag o sa ti v a L. cv. Xinjian g Daye; Dif ferent let ters in th e sam e
column indicate sign ificant diff erences at level
2. 2. 2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响 分别
以不同 OD 600值的根癌农杆菌浸染苜蓿子叶, 结果
见表 2。OD600值为 0. 4~ 0. 5 时, 抗性愈伤率超过
40% ,转化效率较高, 差异极显著 ( P < 0. 01 )。
OD 600值过高或过低转化效率都不高, OD600值为
0. 1时, 转化率仅为 12. 5%, 菌液浓度过低, 不利于
农杆菌附着于外植体的伤口上; OD600 > 0. 7时, 在
后期的筛选培养中农杆菌过度繁殖,抑菌较为困难,
而且过高的菌液浓度往往使外植体褐化, 影响其生
长发育。因此, 在转化中应控制好菌液浓度, 本试验
中适宜的菌液浓度 OD600值为 0. 4~ 0. 5。
表 2 农杆菌菌液浓度对转化效率的影响
Table 2 Effect s o f bacter ial concentration on
transformat ion efficiency
菌液浓度 ( OD600 )
A gr obacte rium
concent rat ion
接种外植体总数
Numbers of
explants
抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
resistan t callu s
0. 1 196 12. 5cD
0. 3 205 24. 8bcBC
0. 4 210 41. 8aAB
0. 5 202 45. 1aA
0. 6 198 34. 7abBC
0. 7 203 21. 6bcBC
0. 9 198 16. 4cCD
注:同列中不同小写字母间差异显著( P< 0. 05) ,不同大写字母
间差异极显著( P< 0. 01) ,下同
Note: Dif ferent small let ters in the same column indicate s ignif-i
cant dif f erences at ( P< 0. 05) level, an d dif ferent capital letters in the
same column indicate signif icant diff erences at ( P< 0. 01) level, the
same as below
表 3 AS浓度和预培养时间对转化效率的影响
T able 3 Effects of AS concentration and pre-culture time
on transformat ion efficiency
AS浓度
AS concent rat ion
( mg/ L)
抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
resis tant callus
预培养时间
Pr e- culture
t ime( d)
抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
res istan t callu s
0 21. 9 cB 0 11. 2cC
10 22. 0 bcB 1 22. 0bcB
20 41. 7 aA 3 45. 6aA
30 36. 3 abAB 5 31. 7abB
50 26. 3 bcB
2. 2. 3 不同 AS 浓度对转化效率的影响 许多研
究表明, AS可以激活农杆菌 T i质粒Vir 基因, 提高
转化效率。由表 3 可知, 共培养基中加入 20 ~ 30
mg/ L AS,抗性愈伤率较高,达到 36%以上, 与其他
处理比较差异极显著; 不加 AS, 抗性愈伤率仅为
21. 9% ;当 AS浓度为 50 mg/ L 时,转化效率降低至
26. 3%。本试验结果初步表明: 添加酚类物质 AS
420
第 5期 赵红娟等:农杆菌介导犁苞滨藜N H X 基因转化苜蓿的影响因素
可提高转化效率,过量则抑制转化。
2. 2. 4 预培养时间对转化效率的影响 关于植物
外源基因的转化,许多研究认为预培养使植物组织
代谢活跃,可促进细胞分裂,而分裂状态下的细胞更
易整合外源 DNA, 促进酚类物质的产生,酚类物质
可活化 Vir 基因, 有助于提高转化效率[ 9, 10] 。本试
验中(表 3) ,预培养 3 d,转化效率为 45. 6%, 差异极
显著( P< 0. 01) ; 预培养 0 d, 转化效率为 11. 2%; 预
培养 5 d 的抗性愈伤率下降为 31. 7% ,可能时间过
长,酚类物质失去活性,不利于T-DNA整合到植物基
因组中[ 9]。
表 4 浸染时间和共培养时间对转化效率的影响
T able 4 Effects of infection time and co-culture time
on tr ansfo rmation efficiency
浸染时间
Infect ion t ime
( min )
抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
resistant callus
共培养时间
Co-cul tu re
t im e( d)
抗性愈伤率( % )
Rate of Kan-
resis tant cal lus
1 22. 9bC 1 8. 7cD
5 33. 3abBC 2 18. 9bcC
10 41. 4aAB 3 24. 2abB
15 44. 3aA 4 35. 0aA
20 39. 4aBC 5 22. 9abB
25 25. 0bC 6 13. 5cCD
2. 2. 5 浸染时间对转化效率的影响 在农杆菌
对植物材料的浸染过程中, 浸染时间的长短影响着
植物材料的抗性愈伤组织率和生长状态。短时间的
浸染转化率较低, 但长时间的浸染,植物材料会发黄
腐烂,农杆菌污染严重, 抑菌较困难, 不利于后期转
化培养。由表 4可知: 浸染 10~ 15 m in, 抗性愈伤
率超过 40%,高于其他处理, 差异极显著, 在后继的
培养中脱菌效果也较理想; 浸染时间大于 25 min
时,植物材料发黄腐烂,受毒害较重。试验结果表明
浸染时间在 10~ 15 m in较适宜。
2. 2. 6 共培养时间对转化效率的影响 共培养时
间过短或过长都不利于外源基因转化。过短, T-
DNA 转移过程不能完成,过长则农杆菌会对与之共
培养的植物材料造成伤害,不能再生出植株[ 8]。由
表 4可知, 苜蓿子叶共培养 1 d的转化效率仅为 8.
7% ;共培养6 d,转化率为 13. 5%, 且农杆菌过度繁
殖,造成外植体褐化腐烂,无法进行后期培养。本试
验中共培养4 d,农杆菌没有对苜蓿子叶愈伤组织造
成伤害,转化效率为 35. 0%,差异极显著( P< 0. 01) ,
因此共培养 4 d较适宜。
2. 3 抗性愈伤组织的 PCR检测
随机抽取 20块经过 Kan筛选具有 Kan抗性绿
芽的愈伤组织进行 PCR检测。结果表明(图 2) : 19
块扩增出了与阳性对照一致的特异条带, 同时阴性
对照没有扩增出任何条带。初步证明外源基因已经
整合到了苜蓿抗性芽基因组中。
图 2 抗性愈伤组织分化出绿芽( A) ; NPT-Ⅱ基因( B)和 NHX基因( C) PCR 电泳检测
F ig . 2 Green buds from Kan resistant callus( A) : NPT-Ⅱ gene( B) and N H X gene( C) PCR detection
M : DL2000 bp M ark er; 1.阳性对照; 2.阴性对照; B 3~ 6, 8:转基因愈伤组织系; 7:未转化成功的愈伤组织系; C 3~ 16:转基因愈伤组织系
M: DL2000 bp Marker; 1: Posit ive cont rol ; 2: Negat ive cont rol; B 3~ 6, 8: Posit ive call; 7: Non- t rans genic call i; C 3~ 16: T ran sgen ic cal li
421
草 地 学 报 第 15卷
3 讨 论
在相同的转化体系中, 新牧 1号杂花苜蓿和新
疆大叶苜蓿的转化效率差异不显著,可能是所用材
料对农杆菌敏感性和细胞潜在的转化能力较为一
致[ 8]。苜蓿不同类型外植体的转化率差异很大, 子
叶受体比茎段、叶柄和叶片更为理想,这与子叶组织
细胞生长快、体胚分化力强的特点有关[ 11]。本试验
子叶转化率为 36. 4% ,高于叶片, 重复性较好。遗
传转化中,菌液浓度直接影响着转化效率, 梁慧敏
等[ 12]对 5种无性系叶片进行转化,农杆菌最适浓度
OD 600值为 0. 3~ 0. 5; 试验结果表明菌液浓度为 0. 4
~ 0. 5转化效率较高, 与梁慧敏等人的研究结果较
一致。乙酰丁香酮( AS)是一种常用的诱导 Vir 基
因活化的酚类化合物,可促进 T-DNA 的转移, 提高
转化效率。本试验将 20~ 30 mg/ L AS加入农杆菌
和外植体的共培养基中, 转化效率较高, 这在葡萄 [ 9]
的遗传转化研究中有类似的效果。在苜蓿外源基因
转化中,许多研究表明不同外植体预培养时间不同,
草原 1 号苜蓿 ( Medicago v ar ia Mart in. cv. Ca-
oyuan N o. 1)子叶 [ 13] 和新疆大叶苜蓿下胚轴 [ 13] 无
需预培养, 苜蓿叶片预培养 5 d[ 12] , 都可得到较好的
转化效果;本试验中预培养 3 d转化效率较高。农
杆菌和外植体共培养是整个转化过程中非常重要的
环节, T-DNA 的转移及整合都在此时期内完成, 苜
蓿不同转化受体共培养最适时间不同,梁慧敏等 [ 12]
以叶片为转化受体, 共培养 3 d转化效率较高;而马
晖玲等[ 14]将子叶、下胚轴、叶片、叶柄分别共培养 1、
2和 3 d,其转化效率没有体现出差异。本试验中子
叶与农杆菌共培养 4 d 得到了较好的转化效果, 可
能是所用菌株的不同造成了试验结果的差异。
选择培养基中加入抗生素,愈伤组织的生成率
和愈伤组织分化率都低于对照。在愈伤组织诱导阶
段不加入选择压,获得愈伤组织后,转至选择培养基
中进行转化体的筛选, 愈伤组织分化过程中适当降
低选择压,可以提高愈伤组织的分化率和不定芽的
生成率, PCR检测结果显示, 这种选择方法对转化
效果影响不大。
参考文献
[ 1] Apse M P, Aharon G S , Snedden W A, e t al . Salt t olerance
confer red by over expression of a vacuolar Na+ / H + ant iporter
in Arab idopsis[ J ] . Science, 1999, 285( 4) : 1256-1258
[ 2] Gaxiola R A, Rao R, S herm an A, et al . T he Arabidopsis
thalian a proton t ransporters A tNH X 1 and A vp 1 can function
in cat ion detoxif icat ion in y east [ J ] . Proc Nat l Acad Sci. ,
1999, 96: 1480- 1485
[ 3] Quintero F J, Blat t M R, Pardo J M . Funct ion al conservation
betw een yeast and plant endosomal Na+ / H+ an tiporters [ J ] .
FEBS Let t . , 2000, 471: 224-228
[ 4] Zhang H X, Blumw ald E. T ransgenic salt-tolerant tomato
plants accumulate salt in foliage b ut n ot in f ruit [ J] . Nat Bio-
tech nol, 2001, 19: 765-768
[ 5] Zh ang H X, H odson J N, W illiams J P, e t al . Engineerin g
Salt- Toleran t Brassica Plan ts : Characteriz at ion of yield an d
seed oil qual ity in t ransgenic plants w ith in creased vacuolar s o-
dium accumu lat ion [ J ] . Proc. Nat l. Acad. Sci. , 2001, 98:
12832-12836
[ 6] 李金耀,张富春,马纪,等. 采用 RT- PCR 扩增方法从犁苞滨藜
中扩增 NH X 基因[ J] .植物生理学通讯, 2003, 39( 6) : 585-588
[ 7] 兰妍,张博,李培英.水解酪蛋白对诱导苜蓿愈伤组织的影响
[ J] .新疆农业大学学报, 2006, 29( 1) : 87- 89
[ 8] 王关林,方宏筠.植物基因工程 [ M ] . 北京:科学出版社, 2002.
744, 757-758
[ 9] 孙仲序,陈受宜,王建设,等.农杆菌介导 BADH 基因转化葡萄
的研究[ J] .果树学报, 2003, 20( 2) : 89-92
[ 10] 赵桂兰,刘艳芝,李俊波,等.影响农杆菌介导的大豆基因转化
因素的研究[ J] .大豆科学, 2001, 20( 2) : 84- 88
[ 11] 吕德扬,范云六,俞梅敏,等.苜蓿高含硫氨基酸蛋白转基因植
株再生[ J] .遗传学报, 2000, 27( 4) : 331-337
[ 12] 梁慧敏,夏阳,孙仲序,等.根癌农杆菌介导苜蓿遗传转化体系
的建立[ J] .农业生物技术学报, 2005, 13( 2) : 152-156
[ 13] 刘艳芝,王玉民,刘莉,等. Bar 基因转化草原 1 号苜蓿的研究
[ J] .草地学报, 2004, 12( 4) : 273-275
[ 14] 马晖玲,卢欣石,曹致中,等.紫花苜蓿基因转化的影响因素分
析[ J] .草业学报, 2006, 15( 5) : 94-102
(责任编辑 马丽萍)
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