全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2004) 03-0219-05
多花胡枝子基因组 DNA提取与 RAPD反应体系优化
张吉宇1 ,袁庆华2* ,张文淑2,鲁 挺3
( 1. 兰州大学草地农业科技学院 甘肃草原生态研究所, 兰州 730020;
2. 中国农科院畜牧研究所, 北京100094; 3. 甘肃农业大学草业学院, 兰州 730070)
摘要: 以多花胡枝子干种子、萌发种子及开花期叶片三种材料提取基因组 DNA,其中开花期叶片用 CTAB 法提取、干种
子和萌发种子用 SDS 法提取的 DNA 均用于 RAPD 研究。结果表明, 叶片基因组 DNA 的 RAPD 扩增最佳反应体系是:
DNA 模板用量为75 ng, Mg 2+ 浓度2. 1 mmo l/ L , dNTP 浓度200 mo l/ L , 随机引物浓度为0. 2 pm/ L , 10×buffer 2. 5
uL , T aqDNA 聚合酶1. 5个单位, 反应总体积25 uL ; 扩增反应程序: 94℃ 预变性3 min; 94℃ 变性30 s, 36℃退火30 s,
72℃延伸1 min,循环45次, 72℃延伸10 min。
关键词: 草原学; 多花胡枝子; DNA 提取; RAPD
中图分类号: Q943; S541. 5 文献标识码: A
Genomic DNA Extraction and Optimizing RAPD
Procedure of Lespedeza f loribunda
ZHANG Ji-yu
1
, YU AN Qing-hua
2
, ZHANG Wen-shu
2
, LU Ting
3
( 1. College of Pastoral Ag ricul tu re Science an d T echnology of Lanzh ou U nivers ity , Gan su Gr as sland Ecological Research
Inst itute, Lanzh ou 730020 China; 2. Inst itute of Anim al S cien ce, CAAS , Beijing 100094 China;
3. Grass lan d Col lege of Gansu Agricul ture University, Lan zhou 730070, Ch ina)
Abstract: A RAPD analysis w as studied w ith the genomic DNA ex tr act ion of L esp edez a f loribunda f rom its
leaves at the f low ering per iod, it s dried seed, and its germ inat ing seed using the CT AB method and the SDS
method. An opt imal r eaction system and condit ions are composed by 75 ng template DNA, 2. 1 mmo l/ L M g2+ ,
200 mo l/ L dNT P, 0. 2 pmL - 1, 10×buf fer 2. 5 uL , 1. 5 U TaqDNA polymerase, 25 uL total reaction buffer.
Thermal react ion prog ram suitable fo r the RAPD analysis w as devised as followings: an initial denatur at ion
94℃ for 3 minutes; 45 cycles of 94℃ for 30 seconds, 36℃ for 30 seconds, 72℃ for 1 minute; and a f inal ex ten-
tion at 72℃ for 10 minutes。
Key words : Grassland science; L esp edez a f lor ibunda; DNA ex tr act ion; RA PD
由 Williams 等创立的随机扩增多态性 DNA
( Random Amplif ied Po lymo rphic DNA, 简称RAPD)
标记技术, 已广泛应用于遗传标记研究[ 1]。高质量的植
物基因组DNA 提取是RAPD研究及其它基因组研究
的基础。目前, 国内外植物基因组 DNA 的提取方法较
多, 并在植物的各种组织上获得成功[ 2～5]。本试验用常
见的 CT AB (十六烷基三甲基溴化铵) 法和 SDS (十
二烷基硫酸钠) 法, 对多花胡枝子开花期叶片、干种
子及萌发种子三种不同时期材料的总基因组 DNA 进
行提取, 旨在获得快速提取高质量基因组 DNA 的方
法;同时, 使用叶片获得的基因组DNA 进行 RAPD 扩
增反应体系的优化, 为进一步开展多花胡枝子 DNA
分子水平上的研究奠定基础。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
材 料 为 多 花 胡 枝 子 ( L esp edez a f loribund a
Bunge) , 种子由中国农科院畜牧研究所牧草种质资源
课题组提供, 是2001年采自北京八大处的野生种子。
投稿日期: 2003-06-12; 修回日期: 2003-11-24
基金项目:国家“十五”科技部基础性工作专项资助项目( 2001～2003年)
作者简介:张吉宇( 1978-) ,男,甘肃民乐人,硕士,主要从事牧草育种及草地生态研究, E -m ail : zjyf rank@ 163. net ; * 通讯作者 Author for corre-
spondence yuanqingh ua@ hotmail . com
第12卷 第3期
Vo l. 12 No. 3
草 地 学 报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
2004年 9月
Sept. 2004
2002年开展本试验,试验地设在畜牧所内, 叶片在
开花期采集, 种子在室内萌发3～4 d 后用于试验。
1. 2 DNA提取方法
采用 CTAB 法和 SDS 法两种方法从多花胡枝子
中提取 DNA。叶片提取方法采用 CTAB 法, 萌发种子
提取方法用 SDS 法, 干种子提取方法采用 SDS 法和
CTAB 法(其中 CT AB 法提取缓冲液多加1%的2-巯
基乙醇)。
1. 2. 1 SDS法 参照 McDonald等 [ 2]的方法
取0. 1 g 多花胡枝子干种子(或萌发种子) , 去除种
荚, 置于折叠的锡铂纸中, 用普通工具钳钳成粉末后,放
入1. 5 mL 离心管中, 立即加入900 mL 提取缓冲液
( 100mmol / l Tr is-HCl, pH8. 0; 50 mmo l/ L EDT A,
pH8. 0; 0. 5 mol / L NaCl; 1. 5% w / v SDS; 1% v / v 2-
mercaptothanol, ) ; 65℃水浴中保温30 min 后, 取出,
12 000rpm / min、4℃条件下离心10 min;取上清液置于
新的离心管中,加入与上清液等体积的氯仿:异戊醇( 24
1)摇匀, 12 000 rpm/ m in、4℃条件下离心10 min; 取
上清液置于新的离心管中, 再加入等体积的异丙醇, 轻
摇至出现絮状沉淀, 12 000rpm / min、4℃条件下离心10
min;倒掉上清液,用70%酒精、无水酒精各清洗1次, 在
室温下风干;加入200 uL TE 缓冲液, 65℃水浴中保温
30 min溶解DNA,置于4℃冰箱存放。
1. 2. 2 CT AB法 参照袁庆华等[ 6]的方法
取100 mg 胡枝子幼嫩叶片(干种子处理同 SDS
法) ,冲洗干净后,放入1. 5 mL 离心管内, 将装有叶片
的离心管直接放入液氮内冷冻1～2 min 后, 打开离心
管向内装满液氮, 拿出后用特制研棒迅速研磨至粉末;
向管内加入900 L 预热到65℃的2×CT AB 缓冲液( 2
mol / L T ris-HCl, pH8. 0; 5 mol / L NaCl; 0. 5 mol/ L
EDT A, pH8. 0; 2% w / v CTAB )。放入65℃水浴 20
min (每隔2 m in摇匀1次) , 取出放凉。加入500 L 氯
仿: 异戊醇( 241) , 轻摇5 min; 4℃条件下7500 rpm /
min 离心10 min;氯仿/异戊醇再抽提1次。取出上清液
置于另一新的离心管中,加入1/ 10体积3 mo l/ L NaAc
( pH 5. 2) , 再加入等体积的异丙醇, 轻摇至出现絮状
沉淀; 4℃条件下12 000 rpm / min 离心5 m in, 弃去上
清液, 用75%乙醇清洗两次;室温下干燥1～2 h; 溶于
200 L T E缓冲液中( pH 8. 0) ,在65℃水浴10 m in, 于
4℃下贮存。
1. 3 基因组 DNA检测
分别采用紫外分光光度检测法、琼脂糖凝胶电泳
和 RA PD扩增反应检测DNA 的浓度和纯度。
1. 3. 1 紫外分光光度检测法 用 TE 对待测 DNA
样品做120倍的稀释后,先将 T E作为空白,在波长为
260 nm、280 nm、230 nm 处调节紫外分光光度计读数
至零,加入稀释过 DNA样品分别读出三处波长的 OD
值,重复3次。在260 nm 的读数用于计算样品中的核酸
浓度, OD值为1相当于大约50 g/ mL 双链 DNA, 根
据在260 nm 以及在280 nm 的读数间的比值估计核酸
的纯度。
1. 3. 2 琼脂糖凝胶电泳检测 用含有0. 5 g/ L 溴
化乙锭的0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量。
1. 3. 3 RAPD 扩增 扩增反应体系包括1 uL 模板
DNA , MgCl2 ( 15 mmol / L ) 4. 5 uL , 0. 375 uL 4×
dNT P ( 10 mmol/ L ) , 0. 6 uL Primer( 8 pmol/ L ) , 0. 4
uL T aqDN A Polymer ase ( 5 U / uL ) , 2. 5 uL 10×
buf fer 缓冲液,最后用 ddH 2O 将总体积补至25 L。扩
增反应程序: 94℃预变性3 m in; 94℃变性30 s, 36℃退
火30 s, 72℃延伸1 min; 45次循环; 72℃延伸10 m in。将
扩增产物用含有0. 5 g/ L 溴化乙锭的1. 2%琼脂糖
凝胶电泳检测, 电压4～5 V/ cm 条件下电泳, 凝胶成
像系统上观察并拍照。
1. 4 RAPD扩增反应条件优选
为探索出适于多花胡枝子 RAPD 扩增反应的最
优体系,对扩增反应体系的各因子设置了如下梯度: 模
板 DNA 用量设置50、75、100、125、150、175 ng 共6个
梯度;随机引物设置0. 05、0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、0. 30
pm / L 共6个浓度梯度; dNTP 浓度设置50、100、150、
200、250、300、350 mol/ L 共7个浓度梯度; M g2+ 浓度
设置1. 2、1. 5、1. 8、2. 1、2. 4、2. 7、3. 0 mmo l/ L 共7个
浓度梯度; TaqDNA 聚合酶设置1. 0、1. 25、1. 5、1. 75、
2. 0、2. 25、2. 5 U 共7个浓度梯度。
在整个反应过程中,除对上述比较因素进行梯度
设置而变动外,其余参数和反应条件不变, 并相应地调
整 ddH2O 量以保持反应体系为25 L。
2 结果与分析
2. 1 基因组 DNA检测
2. 1. 1 紫外分光光度检测 紫外分光光度计上分别
读出260 nm、280 nm、230 nm 三处波长的OD值,重复
三次, 平均值如表1所示。在前三种情况下提取的多花
胡枝子植物基因组 DNA 的 A260/ A280均高于1. 8,说
明所提取的 DNA 没有蛋白质和酚的污染, 但含有一
定浓度的 RNA 杂质,少量的 RNA 对 PCR 扩增结果
并无显著影响 [ 7] ; 干种子用 CTAB 法提取的基
220 草 地 学 报 第12卷
因组 DNA 的 A260/ A280略小于1. 8。DNA 浓度因提
取材料和实验方法不同而差异较大, 其中开花期叶片
的产量最大,达到117. 50 ng / L, 萌发种子比干种子
所获得的产量大。调整每种供试材料的 DNA 浓度为
50 ng/ L,用于以后的 RAPD分析。
2. 1. 2 琼脂糖凝胶电泳检测 从图1可以看出,四种
情况下都得到了较高质量的 DNA, 没有拖尾现象。但本
试验都未经 RNase 处理, 除显示一条 DNA 带外, 还有
RAN 带,说明对 RNA 的去除并不彻底。但少量的RNA
对 PCR 扩增结果并无显著影响。干种子提取基因组
DNA 处理中, SDS 法获得了比 CT AB法更高的质量。
选取前三种情况下的模板DNA 进行RAPD扩增。
表1 分光光度法测定胡枝子 DNA 含量
Table 1 Concentra tion o f genomic DNA detected by UV absorpt ion
方法
Methods
材料
Material
A230 A260 A280 A260/ A280 A260/ A230
DNA 浓度( n g/ L)
Concent rat ion of genomic DNA
SDS 干种子 Dry seeds 0. 107 0. 119 0. 062 1. 92 1. 11 59. 50
萌发种子 Germ inat ing s eeds 0. 139 0. 127 0. 063 2. 02 0. 92 63. 50
CT AB 开花期叶片 Leaves at fl owering stage 0. 114 0. 235 0. 109 2. 15 2. 07 117. 50
干种子 Dry seeds 0. 051 0. 086 0. 048 1. 79 1. 68 43. 17
图1 不同方法及材料的 DNA 质量比较
F ig . 1 DNA quality of differ ent m ethods w it h differ ent mater ial
Lane 1-SDS法 从萌发种子中提取; Lan e 2-CTAB法 从开花期
幼嫩叶片中提取; Lane 3-SDS 法 从干种子中提取;
Lane 4-CT AB法 从干种子中提取
Lane 1-DNA ext raction f rom germ inat ing s eeds using CT AB;
Lane 2-DNA ext raction f rom younger leaves at f low erin g s tage
using C TAB; Lan e 3-DNA ext ract ion f rom d ry s eeds using SDS ;
Lane 4-DNA ext raction f rom dry seeds us ing C TAB
图2 引物 OpA-18(Ⅰ)和 OpC-01(Ⅱ)的 RAPD 扩增结果
Fig. 2 RAPD products der iv ed fr om t emplates of t hr ee
ext racting methods with prim er OpA-18(Ⅰ) and OpC-01(Ⅱ)
1.干种子 SDS 法 2.开花期叶片 CT AB法 3. 萌发种子 SDS法
Lane 1. Dr y s eed s SDS m ethod Lane 2. Leaves at f low ering stage
CT AB method Lane 3. Germin at ing seeds SDS method
2. 1. 3 RAPD扩增 随机引物选用美国 Opron 公司
的 OpA -18 ( 5′AGGT GACCGT3′) 和 OpC-01 ( 5′
TT CGAGCCAG 3′)用于扩增。结果表明,这两个引物
在这三种情况下所获得的 DNA 模板上均可扩增出谱
带 (图2)。总体上, 开花期叶片的获得的基因组 DNA
的扩增谱带最清晰, 说明此种情况下所获得的基因组
DNA 的质量最高;干种子所获得的谱带最丰富, 主要
是因为提取时使用较多的个体所至, 更多的个体可以
包括物种较全面的基因组 DNA, 因此可以扩增出更丰
富的谱带来。
2. 2 RAPD扩增反应体系
采用CT AB法获得的叶片基因组 DNA 进行多花
胡枝子 RAPD扩增反应体系的优化(图3)。
从理论上讲, 一个细胞中的 DNA 量足够用做
RAPD 扩增反应的模板, 模板分子数越多,错误扩增
越少,因而模板也需一定的数量。
2. 2. 1 实验结果发现(图3-Ⅰ) , 不同浓度模板 DNA
所扩增出的带型差异较大。当 DNA 用量小于75 ng
时,扩增出的产物少、条带弱;当 DNA 用量为75～125
ng 时,扩增出的条带清晰、稳定,分辩率高;当DNA 用
量超过125 ng 时, 出现非特异性扩增, 并有弥散状背
景。这是因为模板 DNA 用量过少时, 扩增效率低, 而
且模板和引物不能有效配对;当 DNA 模板过多时, 过
早耗尽引物, 使退火发生在 PCR 产物3′-OH 端和模板
DNA 间或 PCR产物之间,从而进行随机延伸或中止,
出现弥散状背景,但这种情况可以通过增加引物用量
或减少循环次数加以控制[ 8] (图3)。
2. 2. 2 DNA 提取质量对扩增结果也有较大影响。例
如在模板 DNA 的抽提、纯化过程中的某些残留成份
SDS、CTAB、氯仿、乙醇等会影响扩增结果。但模板
DNA 中的蛋白质、多糖、RNA 对扩增无多大影响[ 7]。
221第3期 张吉宇等:多花胡枝子基因组DNA 提取与 RAPD 反应体系优化*
建议在扩增反应总体积为25 uL 时, 胡枝子属植物
RAPD扩增反应的 DNA 模板用量为75 ng。
2. 2. 3 Mg 2+ 是 PCR扩增反应中的一个重要因素。
Mg2+ 浓度不但会影响酶的活性及合成的真实性,而且
还会影响引物与模板的结合效率、模板与 PCR 产物的
解链温度以及产物的特异性和引物二聚体的形成
等[ 8]。扩增结果(图3-Ⅱ)表明, M g2+ 浓度在2. 1、2. 4和
2. 7 mmol/ L 时均能扩增出较好的条带, 但以2. 1
mmol/ L 时扩增出的带较多,主带最清晰。当 Mg 2+ 浓
度大于2. 4 mmol/ L , 主带亮度明显减弱,并出现非特
异性扩增。Mg2+ 浓度的较小变动可导致扩增产物的较
大差异,可见 Mg2+ 浓度是PCR 成功与否的关键因素。
综合考虑,本实验 Mg2+ 浓度定在2. 1 mmol/ L。dNT P
作为PCR反应的原料, 其量的多少直接影响产物的产
量、特异性及合成的真实性。实验结果(图3-Ⅲ)表明,
dNT P 浓度为50～150 mol/ L 时, 产生的条带较弱,
200～300 mol/ L 时差异不显著, 可见 PCR 反应对
dNT P 用量的要求不是很严格, 150 mo l/ L 以上即可
满足扩增所需,随着用量的增加, 扩增产物增多, 但过
高时,容易与 Mg 2+ 结合而降低游离 Mg2+ 浓度, 从而
影响 T aq 酶的活性。建议 dNTP 终浓度使用200
mol/ L 为宜。
2. 2. 4 随着引物浓度的增加,产生的条带数也相应增
多。引物浓度为0. 15、0. 20、0. 25和0. 30 pm / L 时均
能扩增出较好的条带,以0. 2和0. 25 pm / L 浓度扩增
的谱带最为清晰;当引物浓度为0. 30 pm/ L 以上时,
扩增的主带清晰度减弱,并出现非特异性扩增条带。这
是因为引物浓度过高时,将促使引物错误引导非特异
性扩增产物的合成。此外,过量的引物浓度还会导致引
物二聚体的形成。非特异性扩增产物和引物二聚体亦
是 PCR 的底物, 与靶序列竞争 DNA 聚合酶和底物
dNT P,从而使靶序列的扩增量降低。本实验使用的最
佳随机引物浓度为0. 2 pm / L(图3-Ⅲ)。
图3 模板 DNA、随机引物、dNTP、Mg2+ 浓度和 TaqDNA 聚合酶不同浓度梯度的 RAPD扩增结果
Fig . 3 RAPD result s w it h differ ent concent rat ion o f template DNA , random primers, Mg 2+ , dNTP and TaqDNA po lymerase
Ⅰ 模板 DNA 用量: 50、75、100、125、150、175 n g 共6个梯度;Ⅱ Mg2+浓度: 1. 2、1. 5、1. 8、2. 1、2. 4、2. 7、3. 0 mmol/ L 共7个浓度梯度
Ⅲ dNT P 浓度: 50、100、150、200、250、300、350 m ol / L 共7个浓度梯度;Ⅳ 随机引物: 0. 05、0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、0. 30 pm / L 共6个浓度梯度;
Ⅴ T aqDNA 聚合酶: 1. 0、1. 25、1. 5、1. 75、2. 0、2. 25、2. 5 U 共7个浓度梯度
Ⅰ S ix template DNA concen trat ion of 50, 75, 100, 125, 150, 175 ng, respect ively;Ⅱ Seven concent rat ion of Mg2+
of 1. 2, 1. 5, 1. 8, 2. 1, 2. 4, 2. 7, 3. 0 mmol/ L, respect ively;Ⅲ Seven concent rat ion of dNTP of 50, 100, 150, 200, 250, 300,
350 m ol/ L, respect ively;Ⅳ Six concent rat ion of random prim er of 0. 05, 0. 10, 0. 15, 0. 20, 0. 25, 0. 30 pm/ L, respectively;
Ⅴ Seven concent rat ion of TaqDNA ploymerase of 1. 0, 1. 25, 1. 5, 1. 75, 2. 0, 2. 25, 2. 5 U , respect ively
2. 2. 5 DNA 聚合酶浓度和种类影响 PCR 扩增反应。
实验结果(图3-Ⅴ)表明, T aqDNA 聚合酶用量在1. 0
个单位以上都可以扩增出较清晰的谱带。量太少,则导
致产物量减少;量太多, 成本高,易出现非特异性扩增
条带。综合考虑,本实验使用的 TaqDNA 聚合酶用量
为1. 5个单位每扩增体系。
3 讨论
3. 1 二种方法对多花胡枝子叶片、萌发种子和干种子
基因组 DNA 的提取结果表明: 开花期叶片用 CTAB
法提取的基因组 DNA 获得较高的质量; 萌发种子用
SDS 法提取效果较好; 而干种子用 SDS 法比 CTAB
法提取获得了更好的效果。因此建议干种子提取使用
SDS 法。
3. 2 叶片提取时使用液氮研磨, 操作要快, 以防止
DNA 片段的降解。本试验电泳检测显示, 没有拖尾现
象,说明没有产生降解小片段。干种子提取的基因组
DNA 检测结果表明, 其 RNA 带弱于叶片提取的
结果。说 明 在干 种 子中, 其 存 留的 RNA 量 很
少[ 9]。SDS法提取干种子基因组DNA获得了较好的结
(下转230页)
222 草 地 学 报 第12卷
基础,营养损失量从小到大的排列为晒后烘干、晒干和
阴干。这说明干燥速度快,牧草的营养物质被微生物和
自身酶降解少,因此营养物质损失少。
3. 4 在干燥过程中, 鸭茅的WSC 损失量与 DM、CP
和 NFE 的损失量有一定相关。说明干燥过程中, 鸭茅
WSC 损失的速度与其它营养损失的速度有一定的相
关性, 在某种程度上可以用WSC 的损失量来衡量牧
草总的营养损失程度, 而且WSC 的含量又与牧草的
DM、OM、NDF 和 ADF 降解率高度相关[ 5]因此, 在某
种程度上可以用鸭茅干草的WSC 的含量来评价其营
养价值。
参考文献
[ 1] Humphreys M O. Water-soluble carb oh ydrate in perennial rye-
grass breeding .Ⅰ. Gen et ic dif feren ces among cu lt ivars and hy-
brid progeny grow n as spaced plants [ J ] . Grass and Forage Sci-
en ce, 1989, 44: 231～236
[ 2] Humphreys M O. Water-soluble carb oh ydrate in perennial rye-
grass breeding .Ⅱ. Cu lt ivar an d h ybrid progeny per formance in
cu t plot s [ J] . Gras s and Forage Science, 1989, 44: 237～244
[ 3] Radojevic I, Simpson R J, S t John J A, Humphreys M O. Chem-
ical com posit ion and in vit ro digest ibili ty of lines of L ol ium
p erenne selected for high con cen tr at ion of water-soluble carbohy-
drate[ J ] . Aust ralian J ou rnal of Agricultural Research, 1994, 45:
901～912
[ 4] Wilman D, Gao Y, Alt imim i M A K. Dif ferences betw een rated
grass es , t imes of year and plant part s in digest ibilit y and chemi-
cal com posit ion[ J ] . Journal of Agricul tural Science , Cambridge,
1996, 127: 311～318
[ 5] 裴彩霞,董宽虎, 范华.不同干燥方法对牧草 WSC及降解率的影
响[ A] ,见:洪绂曾. 21世纪草业科学展望-国际草业(草地)学术大
会论文集[ C] .北京: 2001, 467～470
[ 6] Gonzalez B, Bou caud J, Salet te J, Langlois J . Fructan and cry-
oprotection in ryegrass ( L olium p erenne L. ) [ J ] . New Phytolo-
gist , 1990, 115: 2, 319～323.
[ 7] 高安社,章祖同,安玉亮.六种调制牧草方法的模糊评价[ J] . 中国
草地, 1996,卷( 2) : 56～59
[ 8] 高崇岳,金岭梅, P Hick . 不同调制方法对青干草品质的影响及调
制过程中水分变化动态[ J] ,甘肃畜牧兽医, 1990, ( 2) : 6.
[ 9] 董宽虎,王常慧,牧原. 干燥方法对苜蓿草粉营养价值的影响[ J] .
草地学报, 2003, ( 4) : 334～337
(上接222页)
果,这对没有幼叶条件下 DNA 的提取提供了依据; 同
时为多花胡枝子种子纯度检测的应用提供了可行的方
法。
3. 3 对提取的基因组 DNA 进行了初步的 RAPD 扩
增, 开花期叶片用 CT AB 法、萌发种子和干种子用
SDS 法, 三种情况提取的基因组 DNA 用于 RAPD 分
析都获得了较好的结果。
3. 4 实验筛选出的适合多花胡枝子的 RAPD扩增反
应体系为: 反应体系总体积25 L, 200 mol/ L
dNT P,引物0. 2 pm/ L, 50 mmol/ L 10×Buf fer ,每扩
增体系含1. 5单位 T aqDNA 聚合酶, M gCl2浓度为
2. 1 mmol/ L , 75 ng 模板 DNA,其余体积以 ddH 2O 补
足。扩增反应程序: 94℃预变性3 min; 94℃变性30 s,
36℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 循环45次; 72℃延伸10
min。
参考文献
[ 1] Wil liams J G K, Kubel ik A R, L ivak K J, et al. DNA polym or -
phisms am plif ied by arb itr ary primers are u seful as genet ic mark-
ers [ J] . Nu cleic Acids Research , 1990, 18: 6531～6535
[ 2] McDonald M B, Ell iot L J, Sw eeney P M . DNA ext raction f rom
dry seeds for RAPD analyses in variety ident ificat ion studies [ J] .
Seed Sci. & T echnol . , 1994, 22: 171～176
[ 3] 王得元,彭世清,刘志昕,等.辣椒基因组 DNA 提取与 RAPD 分
析[ J] .江西农业大学学报, 1998, 20( 2) : 180～183
[ 4] 郭景伦,赵久然,孔艳芳,等.玉米单粒种子 DNA 提取新方法及在
玉米种质鉴定中的应用研究[ J] .种子, 1999, 101( 2) : 37～38
[ 5 ] 彭锁堂,颜启传,王学德,等.水稻单粒种子 DNA 提取及 RAPD
程序优化研究[ J ] .上海交通大学学报 (农业科学版) , 2002, 20
( 1) : 34～37, 41
[ 6] 袁庆华,桂枝, 张文淑.苜蓿基因组 DNA 提取和RAPD 反应条件
优选[ J ] .草地学报, 2001, 9(2) : 99～105
[ 7] 汪小全,邹喻萍, 张大明,等. RAPD 应用于遗传多样性和系统学
研究中的问题[ J ] .植物学报, 1996, 38( 12) : 954～962
[ 8] 林万明主编. PCR技术操作和应用指南[ M ] .北京:人民军医出版
社, 1993. 7～14
[ 9] 乔爱民,傅家瑞.直接从人工老化的菜心干种子中提取基因组
DNA 用于 RA PD 分析[ J] .植物学通报, 1999, 16( 6) : 701～704
230 草 地 学 报 第12卷