全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2003) 03-0205-05
苜蓿抗褐斑病遗传资源离体叶筛选及田间评价
袁庆华, 张文淑
(中国农业科学院畜牧研究所, 北京 100094)
摘要: 对 5 个苜蓿遗传材料各 600 株的离体叶, 经过 6 次对苜蓿褐斑病的抗性循环筛选, 在每个遗传材料内筛选出
最抗病的 5 株, 并用同样方法选出最感病和随机单株各 5株以及亲本材料在田间进行抗病性和干物质产量的比较
和评价。结果表明, 所筛选出的抗病组后代病情指数显著低于原始亲本及最感病株和随机组的后代,并且干物质产
量显著高于原始亲本及感病和随机组后代, 证明离体叶接种法是苜蓿抗褐斑病株系筛选的高效而可靠的方法。
关键词: 草原学;苜蓿; 褐斑病;抗性筛选
中图分类号: S 332. 2　　文献标识码: A
Screening for Genetic Resistance of Alfalfa to Pseudop eziza Medicaginis
by Inoculation of Leaf Tissue and Field Evaluation of the Plants
YUAN Qing-hua, ZHANG Wen-shu
( Ins t itute of Animal Science, CAAS, Beijin g 100094, Ch ina)
Abstract: Inoculated excised leaf tissue f rom 600 plants o f each of 5 alfalfa cultivars w er e recurrent ly
screened fo r 6 times for their resistance capacity to Pseudop ez iz a medicaginis. F ive topmost disease resis-
tant plants and f iv e the least disease resistant plants were ident if ied. T ogether w ith five plants cho sen at
random and al l their parent cult ivars, a f ield exper iment w ere conducted to compare and evaluate their dis-
ease resistnace capacity and dry mat ter productivity. T he result show s that the progeny o f the r esistant
gr oup ascertains significant ly low er disease index and higher dr y mat ter yield than the progenies of the dis-
ease susceptible and r andomgr oups and also all their parent cult ivars. T hus validat ing that ino culation of
excised alfalfa leaf t issues fo r select ing the most Pseudop ez iz a medicaginis resistant st rains is a reliable and
effect iv e method.
Key words : Grassland science; Alfalfa; P seudop ez i z a medicag inis; Screening for resistance capacity
　　苜蓿褐斑病是由苜蓿假盘菌 ( P seudop ez iz a
medicaginis)引致的叶部病害,是重要的苜蓿病害之
一。该病在苜蓿的整个生育期都可发生,苗期受害尤
为严重,而成熟期造成的叶片损失较大。许多研究结
果表明 [ 1, 2] , 苜蓿褐斑病引起的产量损失一般在
11%～29%, 严重时高达 60%, 种子损失达 52%。
近十几年来, 抗病遗传资源的利用及抗病育种是植
物病害防治的最有前途的方法。而抗病育种的前提
是筛选和鉴定抗病种质材料。早在 20世纪 70年代
初, 国外学者[ 1, 3]就对苜蓿褐斑病做了大量的调查,
并开展了抗病性筛选等方面的研究。国内一些学
者[ 4]则主要通过田间调查对不同品种的抗性进行比
较。Prett 等[ 5, 6]在对苜蓿其他病害的研究中发现苜
蓿品种内个体间抗病性存在遗传差异, 但对褐斑病
的抗性遗传资源尚缺乏系统、深入的研究。鉴于褐斑
病是影响我国苜蓿生产的一种严重病害,本研究在
对收集到的 250份苜蓿遗传材料进行了褐斑病抗性
筛选的基础上[ 7] ,选出 5个代表性的遗传材料,对各
收稿日期: 2002-12-17; 修回日期: 2003-05-29
基金项目:国家自然科学基金资助项目( 39870559) ;科技部基础性工作专项基金资助项目( 2001～2002)
作者简介:袁庆华( 1959-) ,女,天津市人,副教授,主要从事草地保护及品种资源的研究
第 11卷　第 3期
　Vo l. 11　　No. 3
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2003 年　9月
　Sept. 　2003
遗传材料内苜蓿个体的褐斑病抗性进行了室内离体
接种筛选和田间评价, 目的是筛选出抗病材料, 为抗
病育种奠定基础。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
供试苜蓿遗传材料共 5个, 即沙湾、沙河、泾阳、
伊鲁瑰斯 ( Iroquois)和萨兰斯( Saranac) , 其中前 3
个苜蓿材料分别来源于新疆、河北和陕西, 是当地的
地方品种,而后 2个苜蓿材料是由美国康奈尔大学
育成的。在本试验前期研究中发现,这5个材料产量
较高,有良好的农艺性状, 而对褐斑病只有中等抗
性,因此, 选择它们做为实验材料, 以便从中选出既
有好的农艺性状又有较高抗病性的株系。
供试菌种——苜蓿假盘菌由作者从本所保定苜
蓿上分离获得,并在 V-8碳酸钙琼脂培养基上扩繁
培养 25 d 后作为接种源。
1. 2　实验方法
1. 2. 1　幼苗培育及离体叶接种筛选
1. 2. 1. 1　种子处理　将苜蓿种子用 0. 1%升汞消
毒处理 3 min后,用无菌水冲洗 4次,摆在消毒的培
养皿内的滤纸上并加入适量灭菌水,以保持种子吸
水膨胀。
1. 2. 1. 2　幼苗培育　放入 20℃的生长箱内发芽 2
d,待幼根长 1 cm 时, 移植到装有蛭石和草炭(比例
为 1∶2)的 5 cm×7 cm 的塑料盆中,每盆1株, 并接
种根瘤菌,置于 10～30℃的温室中培养。
1. 2. 1. 3　离体叶接种　幼苗生长 4周后, 从 5个材
料中分别选出生长健壮的幼苗各 600株, 分别取单
株的第 1 片真叶及第 2～第 6片复叶的中间小叶,
采用孢子弹射法接种病菌[ 2, 8]。
1. 2. 1. 4　筛选　接种后 2周,对病害的严重度进行
调查。病害严重度分为 6级,标准分别为, 0级: 无病
斑, 1级: 1～3个病斑, 2级: 4～6个病斑, 3级: 7～
10 个病斑, 4 级: 11～15个病斑, 5级: 16个以上病
斑。按上述方法经6次接种筛选后,从每个苜蓿遗传
材料中分别选出最抗和最感的单株各 5 株, 分别作
为抗病组和感病组。然后,再从剩余的材料中随机筛
选出 5株,作为随机组。
1. 2. 2　苜蓿无性系扦插扩繁及抗病性和产量评价
通过离体叶接种筛选出的抗病、感病及随机组的单
株被移栽到装有肥沃土料的花盆中, 花盆大小为 20
cm×24 cm ,每盆 1株, 进行无性扩繁, 各组保留相
等数量的无性株。无性株于 2001年4月初移栽到田
间小区内,小区面积 10 m 2,随机排列。6月中旬刈割
一次, 8月下旬用发病极为严重的苜蓿枝条均匀覆
盖各小区,并连续喷水 2 d, 4 d后除去病枝, 20 d 后
调查发病率及严重度,并计算病情指数, 9月下旬测
定苜蓿干物质产量, 并进行分析、评价。病情指数计
算公式如下:
病情
指数=
∑(各级病枝数×该级代表数值)
调查总枝数×发病最重级的代表数值×100
1. 2. 3　子代田间抗病性和产量评价　将各材料的
亲本和每个材料的 3个后代组(抗病组、感病组、随
机组)收获的种子( 2001年 6月 25日收种) ,各取相
同数量的种子, 组内混合,田间播种进行抗病性和产
量评价,各 4次重复,小区面积为 1. 5 m×2. 0 m, 播
量 5 g ,随机区组排列。2001年 7月初播种, 进行正
常的田间管理。9月初田间接种, 20 d后进行发病率
和病害严重度调查, 10月中旬测定产量,方法同上。
2　结果与分析
2. 1　抗病、感病及随机单株的筛选
用苜蓿假盘菌接种苜蓿离体叶片,每株经过 6
次接种循环筛选, 分别从各材料的 600 个单株中筛
选出病害严重度最低的 5 株、最高的 5 株和随机的
5株,组成抗病组、感病组和随机组。方差分析表明,
各材料的病害严重度组间差异达到极显著 ( P<
0. 01) ,而且 5个苜蓿材料的抗病、感病和随机组相
互之间存在显著差异(表 1) ( P< 0. 05)。
2. 2　苜蓿无性系田间抗病性及产量评价
为了进一步验证离体叶接种筛选的有效性, 对
各材料的抗病、感病及随机组进行了无性扩繁,在田
间人工接种病菌,进行田间病情指数及产量评价。经
方差分析,各材料的抗病、感病及随机组之间病情指
数存在极显著差异( P< 0. 01) , 干物质产量间也存在
不同程度的差异(表 2)。进一步进行 LSD 测验, 证
明各材料的抗病组、感病和随机组的病情指数差异
达到显著水平( P< 0. 05) (表3)。5个材料综合来看,
206 草　地　学　报 第 11卷
感病组的病情指数是抗病组的 4. 2～26. 0倍,是随
机组的 1. 2～1. 9倍。这说明离体叶接种筛选是有效
的,与田间观测的结果一致。
表 1　抗病、感病及随机组病害严重度的方差分析
T able 1　Disease sever ity of r esistant , susceptible and random g roups of alfalfa cultiv ar s
and significance differ ences among g roups
品种
C ult ivar
组别
group
病害严重度(平均值)
Diseas e severity( average)
L SD 测验
L SD T es t
泾阳
Jin gyang
抗病组 Resistant g roup 0. 9000 a
随机组 Random group 2. 5000 b
感病组 Suscep tib le group 3. 8333 c
沙河
Shah e
抗病组 Resistant g roup 1. 1667 a
随机组 Random group 2. 5333 b
感病组 Suscep tib le group 3. 5000 c
沙湾
Shaw an
抗病组 Resistant g roup 1. 6250 a
随机组 Random group 2. 6333 b
感病组 Suscep tib le group 3. 7333 c
伊鲁瑰斯
Iroquois
抗病组 Resistant g roup 0. 8333 a
随机组 Random group 2. 7667 b
感病组 Suscep tib le group 4. 2667 c
萨兰斯
S aranac
抗病组 Resistant g roup 1. 5000 a
随机组 Random group 2. 7000 b
感病组 Suscep tib le group 4. 3000 c
　　注:标有不同字母间显著差异( P< 0. 05)
Note : Means with different letter s are significantly differ ent ( P< 0. 05)
表 2　抗病、感病及随机组无性系的方差分析
Table 2　Var iance ana ly sis on the differences among clones of r esistant, susceptible and random g roups
品种
Cu lt ivar
病情指数 Diseas e index
F 值 P
总干物质 T otal dry mat ter
F 值 P
泾阳 Jing yang 22. 37 < 0. 01 20. 13 < 0. 01
沙河 Shahe 9. 49 < 0. 01 7. 48 < 0. 05
沙湾 Shaw an 12. 17 < 0. 01 4. 53 < 0. 05
伊鲁瑰斯 I roquois 17. 33 < 0. 01 7. 88 < 0. 05
萨兰斯 Sar anac 75. 79 < 0. 01 4. 55 < 0. 05
表 3　抗病、随机及感病 3 组无性系的病情指数及产量
Table 3　Compar isons of disease index and yield among clones of r esistant, random and suscept ible g roups
品种
Cult ivar
组别
group
病情指数
Diseas e index
总干重( g·m - 2)
T otal dry mat ter
叶干重( g·m- 2)
Leaf dry mat ter
茎干重( g·m- 2)
S tem dry m at ter
泾阳 抗病组 Resis tant group 11. 838 a 280. 692 a 132. 553 a 148. 138 a
J ingyang 随机组 Random group 27. 575 b 175. 833 b 82. 057 b 93. 777 b
感病组 Susceptib le group 50. 013 c 156. 099 b 69. 787 b 86. 312 b
沙河 抗病组 Resis tant group 4. 928 a 306. 892 a 134. 105 a 172. 787 a
S hahe 随机组 Random group 34. 818 b 234. 105 b 102. 297 b 131. 807 a
感病组 Susceptib le group 41. 288 b 153. 429 c 67. 365 b 86. 064 b
沙湾 抗病组 Resis tant group 3. 093 a 287. 837 a 130. 567 a 157. 270 a
S haw an 随机组 Random group 24. 163 b 234. 309 ab 93. 138 b 141. 170 a
感病组 Susceptib le group 37. 685 b 230. 603 b 90. 887 b 139. 716 a
伊鲁瑰斯 抗病组 Resis tant group 7. 872 a 231. 740 a 115. 118 a 116. 622 a
Iroquois 随机组 Random group 22. 550 b 164. 797 b 69. 476 b 95. 321 a
感病组 Susceptib le group 43. 950 c 149. 628 b 55. 135 b 94. 493 a
萨兰斯 抗病组 Resis tant group 2. 438 a 251. 081 a 119. 510 a 131. 571a
S ar anac 随机组 Random group 36. 608 b 172. 331 b 74. 392 b 97. 939 a
感病组 Susceptib le group 63. 498 c 160. 067 b 67. 128 b 92. 939 a
　　注:标有不同字母的平均值之间存在显著差异( P< 0. 05)
Note: Mean s with dif f erent let ters are s ignif icant ly diff erent ( P< 0. 05)
207第 3期 袁庆华等:苜蓿抗褐斑病遗传资源离体叶筛选及田间评价
　　对各材料的抗病、感病和随机组的经济性状进
行比较,发现总干重、叶干重均差异显著( P< 0. 05) ;
茎干重在材料间有所不同,泾阳苜蓿和沙湾苜蓿的
抗病、感病和随机组间存在显著差异( P< 0. 05) ,其
余 3个材料组间无显著差异(表 3) ( P> 0. 05)。各材
料抗病组的总干物质产量是感病组的 1. 24～2. 00
倍,是随机组的 1. 23～1. 46倍; 抗病组的叶干重是
感病组的 1. 4～2. 1倍,是随机组的 1. 3～1. 7倍。
2. 3　子代田间抗病性及产量的评价
各材料的抗病、感病和随机组的植株隔离种植,
分别收获种子,田间种植, 以原始亲本材料为对照,
对所选各组后代的抗病性和经济性状进行比较实
验。结果表明, 每个材料的抗病、感病和随机组后代
及原始亲本的病情指数存在极显著差异( P< 0. 01) ,
总干物质、叶干物质和茎干物质产量的差异也达到
显著或极显著水平(表 4、表 5)。5个材料的抗病组
后代病情指数远低于原始亲本,而感病组后代病情
指数则远高于原始亲本。从这些结果可以看出,用离
体叶接种法筛选出的抗病组后代病害最轻、损失最
低, 而干物质产量最高, 这进一步说明, 该方法用于
苜蓿抗病性筛选具有相当高的可靠性。
表 4　抗病、感病、随机后代及原始亲本的方差分析
T able 4　Var iance analy sis on the differ ences among pro genies of r esistant,
suscept ible and random g roups and t he par ent cultiv ar s
品种
Cu lt ivar
病情指数 Diseas e index
F 值 P
总干物质 T otal dry mat ter
F 值 P
泾阳 Jing yang 66. 23 < 0. 01 3. 88 < 0. 05
沙河 Shahe 16. 10 < 0. 01 5. 87 < 0. 05
沙湾 Shaw an 129. 00 < 0. 01 8. 01 < 0. 01
伊鲁瑰斯 I roquois 31. 99 < 0. 01 7. 04 < 0. 01
萨兰斯 Sar anac 16. 60 < 0. 01 9. 54 < 0. 01
表 5　抗病、感病及随机组后代及原始亲本的病情指数和产量
Table 5　Compar isons o f disease index and yield between progenies o f resistant ,
r andom and susceptible g roups and the par ent cultiv ar
品种
Cult ivar
组别
r roup
病情指数
Diseas e index
总干重( g·m - 2)
T otal dry mat ter
叶干重( g·m- 2)
Leaf dry mat ter
茎干重( g·m- 2)
S tem dry m at ter
泾阳 抗病组 Resis tant group 8. 435 a 73. 342 a 55. 105 a 18. 237 a
J ingyang 亲　本 Parental grou p 27. 043 b 54. 130 b 40. 508 b 13. 623 a
随机组 Random group 22. 235 b 54. 721 b 40. 065 b 14. 656 a
感病组 Susceptib le group 51. 928 c 52. 082 b 36. 850 b 15. 232 a
沙河 抗病组 Resis tant group 4. 748 a 61. 024 a 45. 234 a 15. 790 a
S hahe 亲　本 Parental grou p 26. 475 b 40. 778 b 30. 063 b 10. 715 b
随机组 Random group 30. 290 bc 39. 312 b 28. 660 b 10. 652 b
感病组 Susceptib le group 39. 010 c 44. 130 b 25. 040 b 10. 616 b
沙湾 抗病组 Resis tant group 6. 323 a 42. 328 a 31. 649 a 10. 679 a
S haw an 亲　本 Parental grou p 24. 318 c 29. 904 b 22. 154 b 7. 750 b
随机组 Random group 12. 368 b 31. 594 b 23. 344 b 8. 250 b
感病组 Susceptib le group 52. 940 d 29. 212 b 21. 454 b 7. 757 b
伊鲁瑰斯 抗病组 Resis tant group 2. 693 a 71. 576 a 55. 543 a 16. 033 a
Iroquois 亲　本 Parental grou p 20. 589 b 51. 687 b 39. 999 b 11. 688 b
随机组 Random group 27. 438 bc 49. 946 b 38. 804 b 11. 141 b
感病组 Susceptib le group 33. 613 c 47. 101 b 35. 752 b 11. 350 b
萨兰斯 抗病组 Resis tant group 1. 170 a 31. 087 a 23. 986 a 7. 101 a
S ar anac 亲　本 Parental grou p 25. 363 b 20. 600 b 15. 890 b 4. 710 b
随机组 Random group 25. 735 b 19. 864 b 15. 163 b 4. 701 b
感病组 Susceptib le group 28. 095 b 15. 815 b 11. 495 b 4. 321 b
　　注:标有不同字母的平均值之间存在显著差异( P< 0. 05)。
Note: Mean s with dif f erent let ters are s ignif icant ly diff erent ( P< 0. 05) .
208 草　地　学　报 第 11卷
3　结论与讨论
3. 1　利用苜蓿离体叶组织接种苜蓿假盘菌,筛选苜
蓿的抗褐斑病株系, 其方法是有效的, 结果是可靠
的。本试验从 600个单株中筛选出 5株抗病株, 筛选
概率为 0. 8%。
3. 2　用离体叶组织接种方法筛选出的抗病组后代
病情指数显著低于原始亲本及感病和随机组后代,
而产量(总干重、叶干重和茎干重)则显著高于原始
亲本及感病和随机组后代。这充分说明,离体叶接种
筛选可以作为筛选苜蓿抗褐斑病遗传资源的一种行
之有效的方法而推广应用。
3. 3　在实验室条件下利用离体叶接种方法筛选出
的抗病株系, 在田间感病条件下同样表现出显著的
抗病性。
3. 4　离体叶人工接种筛选的另一个优点是能够对
个体植株的寄主反应进行多次检验( mult iple as-
says)。由于多次检验使一个群体中最具抗性的植株
被选中的机率明显增加,因而所达到的选择效果更
为显著。这一点对苜蓿尤为重要,因为苜蓿的许多病
害是由多基因控制的, 从最抗到最感之间存在连续
的变异[ 9]。有时, 植物个体、群体之间在抗病性上可
能只有轻微的差异, 而整株筛选只允许单次检验
( single assay ) , 结果的可靠性较差, 因此较难筛选
出最具抗性的植株。
3. 5　为了比较抗病、感病组相互间在蛋白质水平上
的差异,作者还对离体叶接种筛选出的抗病、感病组
苜蓿植株进行了超氧化物歧化酶、过氧化物酶和多
酚氧化酶活性的测定[ 1 0] ,发现接种后 2～17天内抗
病株三种酶的活性显著高于感病株。同时还对苜蓿
各材料内抗病株和感病株的亲代和子代进行RAPD
标记, 比较亲代和子代的 RAPD 图谱, 在引物
OPF01和 OPC02的扩增产物中各发现一条能够稳
定遗传的特异性 谱带, 分别 记为 OPF01700 和
OPC021400
[ 11] ,这些都充分地说明离体叶筛选出的抗
病株与感病株之间不仅仅只在表型上(病情指数和
牧草产量)存在差异,在遗传上(蛋白质、DNA )也存
在差异。这就更进一步地验证了离体叶接种筛选苜
蓿抗褐斑病单株的可靠性与有效性。
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209第 3期 袁庆华等:苜蓿抗褐斑病遗传资源离体叶筛选及田间评价