全 文 ：第２０卷　第１期
　Ｖｏｌ．２０　 Ｎｏ．１
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１２年　 １月
　 Ｊａｎ．　　２０１２
燕麦种子蛋白质组的ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
王霞霞１，２，柴守玺１＊，常　磊１，柴继宽１，徐智明２
（１．甘肃农业大学，甘肃 兰州　７３００３０；２．安徽农科院，安徽 合肥　２３００３１）
摘要：采用十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电泳结合液相色谱串联质谱方法（ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）对燕
麦（Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）品种白燕２号种子不同溶解性的蛋白质进行分离鉴定，以期建立其种子蛋白质表达谱，为探讨
干燥燕麦种子储藏及萌发的生理生化机理提供基础。结果表明：ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法鉴定出溶解于超纯水、２．５％
ＮａＣｌ和７０％乙醇的燕麦种子蛋白质分别为４０，３３和１５个，共５４个非冗余蛋白，其中２９个蛋白至少可溶于２种
溶剂。通过生物信息学软件对鉴定蛋白的分子功能、细胞组成和生物学功能进行预测，其中４０个蛋白质功能得到
明确的预测，涉及细胞过程、刺激应答及酶调节活性等１２类。这些蛋白质与燕麦种子成熟干燥时期生命活动有
关，为进一步从蛋白质水平探索燕麦种子生理代谢机理提供了理论依据。
关键词：燕麦；蛋白质组；质谱
中图分类号：Ｓ５４３．７３；Ｑ９４６．１　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０１－０１０８－０８
ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　Ｏａｔ　Ｓｅｅｄ　Ｐｒｏｔｅｏｍｅ
ＷＡＮＧ　Ｘｉａ－ｘｉａ１，２，ＣＨＡＩ　Ｓｈｏｕ－ｘｉ　１＊，ＣＨＡＮＧ　Ｌｅｉ　１，ＣＨＡＩ　Ｊｉ－ｋｕａｎ１，ＸＵ　Ｚｈｉ－ｍｉｎｇ２
（１．Ｇａｎｓｕ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ，Ｇａｎｓｕ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　７３００７０，Ｃｈｉｎａ；
２．Ａｎｈｕｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｆｅｉ，Ａｎｈｕｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　２３００３１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｆｏｒ　ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｄｒｙ　ｏａｔ　ｓｅｅｄｓ（Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．
‘ｂａｉｙａｎ　Ｎｏ．２’）ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ＭｉｌＱ　ｗａｔｅｒ，２．５％ ＮａＣｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　７０％ｅｔｈａｎｏｌ　ｔｈｅｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｕ－
ｓｉｎｇ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ａｎｄ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｙ　ａｐｐｒｏａｃｈ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｆｉｆｔｙ－ｆｏｕｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｂｙ　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ，ｈｅｒｅｉｎｔｏ；ｔｗｅｎｔｙ－ｎｉｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｗｏ　ｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｋｉｎｄｓ　ｏｆ
ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｆｏｒｔｙ，ｔｈｉｒｔｙ－ｔｈｒｅｅ　ａｎｄ　ｆｉｆｔｅｅｎ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｄｉｓｓｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ＭｉｌＱ　ｗａｔｅｒ，２．５％ ＮａＣｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ
ａｎｄ　７０％ｅｔｈａｎｏｌ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｃｅｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　ａｎｄ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐａｔｈｗａｙｓ　ｏｆ　ｆｉｆｔｙ－
ｆｏｕｒ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｂｙ　ＧＯ　ｄａｔａｂａｓｅ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｆｏｒｔｙ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｉｎｖｏｌ－
ｖｉｎｇ　ｉｎ　ｔｗｅｌｖｅ　ｍａｊｏｒ　ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｓｔｉｍｕｌａｔｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｎｚｙｍｅ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｃｅｌｕｌａｒ　ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ
ａｎｄ　ｓｏ　ｏｎ．Ｔｈｅｓｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｄｒｉｅｄ　ｒｉｐｅ　ｏａｔ　ｓｅｅｄ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｔｏ
ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｏｆ　ｏａｔ　ｓｅｅｄｓ　ａｔ　ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｌｅｖｅｌ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｕｔｕｒｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｏａｔ；Ｐｒｏｔｅｏｍｅ；Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
　　种子是种子植物生长繁衍的一个时期，是子代
植株体的开始。蛋白质是机体生理活动的调控者，
在种子自身形成、萌发及萌发后幼苗生长的生理生
化反应和代谢过程中扮演着极其重要的角色。因
此，为揭示种子新陈代谢的活动机理，进行种子蛋白
质研究是非常必要的。蛋白质组是指一个生物体基
因组、一个细胞或组织在特定环境下所表达的全部
蛋白质［１］。蛋白质组学是一种研究种子蛋白质组分
的强有力的研究手段。目前，已有许多研究采用蛋
白质组学技术分析了小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、大
麦（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ　Ｌ．）及大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）等
作物的种子蛋白质组分。Ｍａｋ和Ｓｋｙｌａｓ等［２，３］通过
蛋白质组学技术分别构建了小麦种子胚芽、胚乳蛋
白表达谱。Ｂａｋ－Ｊｅｎｓｅｎ和 ｓｔｅｒｇａａｒｄ等［４，５］构建了
大麦种子蛋白质的二维凝胶图谱，并对主要蛋白进
行了鉴定和功能预测。此外，还有研究者对种子贮
藏蛋白组分的发育积累，及种子蛋白组分与生物学
特性间联系做了一定研究［６～９］。这些研究为系统分
收稿日期：２０１１－０９－２１；修回日期：２０１１－１２－０５
基金项目：安徽省博士后基金资助
作者简介：王霞霞（１９７７－），女，甘肃庆阳人，博士研究生，主要从事作物生态生理的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｘｉａｘｉａ１０２９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ；＊通信作者
Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｃｈａｉｓｘ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
第１期 王霞霞等：燕麦种子蛋白质组的ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
析种子蛋白质组分，进而探索种子生长代谢奠定了
基础。然而，目前关于燕麦种子蛋白质组的研究鲜
有报道。
本试验以燕麦品种白燕２号（Ａｖｅｎａ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．
‘ｂａｉｙａｎ　Ｎｏ．２’）干燥种子为研究材料，采用十二烷
基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）电泳结合
液相色谱串联质谱方法（ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）对燕麦种
子不同溶解性的蛋白质进行分离鉴定，以期建立燕
麦干燥种子蛋白质图谱，进而为探讨干燥燕麦种子
萌发前生理代谢提供科学依据。
１　材料与方法
１．１　材料
所用燕麦品种白燕２号种子由甘肃农业大学提
供。种子饱满、种皮色泽正常。种子烘至恒重后测
定含水量为９．４０％。种子经蒸馏水漂洗３次后，随
机取部分种子置于垫有双层１５ｃｍ定性滤纸的玻璃
培养皿中，每皿１００粒，添加１０ｍＬ蒸馏水，于２０℃
恒温光照培养箱中避光发芽２４ｈ后，以种子胚根突
破种皮２ｎｍ为准统计发芽率。种子平均发芽率大
于９０％，说明试验所选取的燕麦种子是已经度过休
眠期的种子。取３ｇ种子于研钵中加液氮研磨成粉
状，分装于离心管，－２０℃保存。
１．２　蛋白质样品的制备与分离
１．２．１　燕麦种子蛋白的制备　将６０ｍｇ燕麦种子
粉末置于１．５ｍＬ离心管中，分别加入１ｍＬ超纯
水、７０％乙醇和２．５％ＮａＣｌ溶液，涡旋振荡混匀，于
４℃放置１０ｈ后１２０００ｇ离心１５ｍｉｎ。吸取上清
液，即得蛋白质样品液。采用考马斯亮蓝法测定样
品液蛋白质浓度后分装，并置于－８０℃保存备用。
１．２．２　蛋白变性聚丙烯酰胺凝胶电泳　灌制分离
胶浓度为１２％、浓缩胶浓度为５％的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，蛋
白质上样量为１０μｇ。起始电压为８０Ｖ，待样品走
出浓缩胶后，电压增至１２０Ｖ。待溴酚兰指示剂距
电泳槽底部１ｃｍ处停止电泳。经电泳凝胶在考马
斯亮蓝溶液中染色１６ｈ［１０］，并于超纯水漂洗液中脱
色至背景清晰，用 ＵＭＡＸ 扫描仪（ＵＭＡＸ，台湾）
采集图像。
１．２．３　蛋白凝胶的酶解　以染色条带为标准，将
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分离的燕麦种子蛋白条带切割。
置于离心管中用超纯水冲洗２次。然后加入脱色液
（５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１碳酸氢铵和５０％乙氰）冲洗后移除
液体，再加入脱色液过夜，最后加入乙氰脱色以获得
白色不透明的胶粒。脱色干燥后的蛋白质胶粒用
１０ｍｍｏｌ·Ｌ－１二硫苏糖醇于５６℃水浴还原１ｈ，乙
腈脱水干燥后，在避光条件下用５５ｍｍｏｌ·Ｌ－１碘乙
酰胺溶液烷基化１ｈ。干燥胶粒加入１０μＬ的２０
ｎｇ·μＬ
－１胰蛋白酶于３７℃过夜；移去酶解液，加１０
μＬ　５０％乙氰／２％甲酸，超声３０ｍｉｎ。上清夜合并
到酶解液。
１．２．４　蛋白质的质谱鉴定　酶解液用液相色谱串
联离子阱质谱系统（ＬＴＱ　ＸＬ，Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｎｎｉｇａｎ，
ＵＳＡ）在正离子模式下检测混合肽质量。多肽和多
肽碎片的全扫描后（质量电荷比１５～４０００ａｍｕ）采
集１０碎片图谱。原始文件用ＢＩＯＷＯＲＫＳ软件搜
索ＮＣＢＩｎｒ蛋白质数据库（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．
ｎｉｈ．ｇｏｖ），检索结果用Ｓｉｎｇｌｅ　ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ参数筛选，
当Ｃｈａｒｇｅ为＋１时 Ｘｃｏｒｒ≥１．９；当Ｃｈａｒｇｅ为＋２
时Ｘｃｏｒｒ≥２．２；当Ｃｈａｒｇｅ为＋３时Ｘｃｏｒｒ≥３．７５；其
中ｄｅｌｔａ　ＣＮ≥０．１。
１．２．５　生物信息学分析　根据鉴定蛋白质的
ＦＡＳＴＡ格式序列文本，利用Ｃｏｍｐｕｔｅ　ｐＩ／Ｍｗ工具
（ｈｔｔｐ：／／ｕｓ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ）计算
每一个蛋白质的分子量和等电点；采用ＧＯ数据库
的注释（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ．ｏｒｇ／）对鉴定
蛋白质的功能进行分类。
２　结果与分析
　　燕麦种子蛋白经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分离（图１）、考马
斯亮蓝溶液染色，依据蛋白质染色条带将凝胶条带
分别切割，通过凝胶脱色、还原、烷基化和酶解提取
肽混合物，采用高效液相色谱串联离子阱质谱分析。
以至少有２条不同肽段被检出定义为可靠鉴定的标
准，成功鉴定出溶解于超纯水、２．５％ ＮａＣｌ和７０％
乙醇溶液的燕麦种子蛋白数目分别为４０，３３和１５，
去冗余后共５４个蛋白（表１）。图２所示为溶解于
超纯水的第２条切割条带的总离子流图，以及前体
离子质荷比为１２０８．９２的串联质谱模式图，据此可
检测到肽段是ＤＤＱＴＳＴＦＴＣＰＶＧＴＮＹＱＩＶＬＣＰ。
２．１　鉴定蛋白质的物理化学特性
根据溶剂对质谱鉴定的５４个燕麦种子蛋白进
行分类（图３－Ａ），发现２５个蛋白质（４６．３０％）只溶
于１种溶剂，如３－磷酸激酶、逆糖基化多肽和聚（Ａ）
结合蛋白等仅存在于超纯水中，燕麦醇溶蛋白－３和
９０１
草　地　学　报 第２０卷
图１　燕麦种子蛋白ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分离结果
Ｆｉｇ．１　Ｏａｔｓ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
注：１表示７０％的醇溶性蛋白；２表示水溶性蛋白；
３表示２．５％盐溶性蛋白；Ｍ表示蛋白ｍａｒｋｅｒ
Ｎｏｔｅ：１，７０％ｅｔｈａｎｏｌ；２，ＭｉｌＱ　ｗａｔｅｒ；
３，２．５％ ＮａＣｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ；Ｍ，ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ
１２Ｓ种子贮藏球蛋白２等蛋白溶于７０％乙醇溶剂
中，球蛋白３和贮藏蛋白等蛋白溶于２．５％ＮａＣｌ溶
液；其余２９个蛋白质（５３．７０％）至少溶于２种溶剂，
其中内切几丁质酶、铜／锌超氧化物歧化酶、１２Ｓ种
子贮藏球蛋白１、α－淀粉酶抑制剂等５个蛋白质
（９．２６％）可溶于３种溶剂。
　　鉴定的５４个燕麦种子蛋白中，相对分子质量最
小的是α－淀粉酶抑制剂为２．７６ｋＤａ；分子质量最大
的是未命名蛋白（ｇｉ：２５７７１６４２９）为９０．１６ｋＤａ；在分
子质量１０～４０ｋＤａ范围内有３８个蛋白质，占鉴定
蛋白的７０．３７％（图３－Ｂ）。等电点最大的蛋白是组
蛋白变异体Ｈ４为１１．４８；等电点最小的蛋白质是钙
调蛋白为４．１１。鉴定蛋白质的等电点主要分布在
４．０～８．０，有４５个（８３．３３％）蛋白质等电点在此范
围内（图３－Ｃ）。
图２　泳带２的ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析结果
Ｆｉｇ．２　ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ　ｐｒｏｆｉｌｅ　ｏｆ　ｌａｎｅ　２
注：Ａ表示总离子流图，ｘ轴代表分析时间，ｙ轴代表能够检测到的离子流；Ｂ表示串联质谱分析前体离子质荷比为１２０８．９２的模式图，
据此可检测到的肽段是ＤＤＱＴＳＴＦＴＣＰＶＧＴＮＹＱＩＶＬＣＰ
Ｎｏｔｅ：Ａ，ｔｏｔａｌ　ｉｏｎ　ｃｕｒｒｅｎｔ　ｏｆ　ｌａｎｅ　２ｕｓｉｎｇ　ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｕｍ；Ｂ，ＭＳ／ＭＳ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｄｏｕｂｌｅ－ｃｈａｒｇｅｄ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｉｏｎｓ　ｗｉｔｈ　ａ　ｍ／ｚ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　１２０８．９２，
ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　ｏｆ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ＤＤＱＴＳＴＦＴＣＰＶＧＴＮＹＱＩＶＬＣＰ
０１１
第１期 王霞霞等：燕麦种子蛋白质组的ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
表１　差异表达蛋白质点的质谱鉴定结果
Ｔａｂｌｅ　１　Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｐｏｔｓ　ｂｙ　ＥＳＩ－Ｑ　ＭＳ／ＭＳ　ａｎｄ　ｄａｔａｂａｓｅ　ｓｅａｒｃｈｉｎｇ
蛋白点
Ｓｐｏｔ
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
蛋白质名称
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｎａｍｅ
等电点
Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔ
分子质量
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ／Ｄａ
溶解性
Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ
覆盖率／％
Ｃｏｖｅｒａｇｅ
１ ｇｉ：４９０３７４７６
钙调蛋白
ＣａＭ
４．１１　 １６８３１．６７ Ｓ，Ｙ　 ３３．５６
２ ｇｉ：３２４０１３８８
１４－３－３蛋白
１４－３－３ｐｒｏｔｅｉｎ
４．７８　 ２８３７９．１１ Ｓ，Ｙ　 １４．４６
３ ｇｉ：１１２６８４
１４－３－３蛋白Ａ
１４－３－３－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ
４．８３　 ２９３５２．０８ Ｓ １１．８３
４ ｇｉ：２２６５３３８６８
热激蛋白７０
Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　７０
４．９４　 ４５１３７．８８ Ｓ，Ｙ　 １０．１７
５ ｇｉ：２５６０８５
α－淀粉酶抑制剂
α－ａｍｙｌａｓｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
４．９４　 ２７５６．１４ Ｓ，Ｙ，Ｃ　 ６６．６７
６ ｇｉ：１３９２５７２８
蛋白质二硫键异构酶３前体
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　３ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
４．９６　 ５６６２９．３３ Ｓ，Ｙ　 ９．５１
７ ｇｉ：２８１７２９１３
３－磷酸激酶
３－ｐｈｏｓｐｈｏｇｌｙｃｅｒａｔｅ　ｋｉｎａｓｅ
５．０５　 ３１３２１．３２ Ｓ １９．１３
８ ｇｉ：２５７７１６４２９
未命名蛋白
Ｕｎｎａｍｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ
５．１５　 ９０１５７．６６ Ｙ ４．４３
９ ｇｉ：６１３６１１１
ＵＤＰ－葡萄糖焦磷酸化酶
ＵＤＰ－ｇｌｕｃｏｓｅ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ
５．２　 ５１６４４．２５ Ｓ，Ｙ　 １７．３４
１０ ｇｉ：１１７４７４９
磷酸丙糖异构酶
Ｔｒｉｏｓｅｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ
５．２４　 ２６９２６．７６ Ｓ １３．０４
１１ ｇｉ：２０９９４４１２７
磷脂酶Ｄ－α－１－前体
Ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ　Ｄ　ａｌｐｈａ　１ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
５．３　 ６１７８４．１９ Ｓ ６．４３
１２ ｇｉ：１２５８５３２６
葡糖磷酸变位酶
Ｇｌｕｃｏｓｅ　ｐｈｏｓｐｈｏｍｕｔａｓｅ
５．３４　 ６２６７３．０１ Ｓ ４．６５
１３ ｇｉ：２８３９６９６８５ β
－淀粉酶２
β－ａｍｙｌａｓｅ　２
５．３４　 ５７１１３．７７ Ｓ，Ｙ　 １６．０４
１４ ｇｉ：２５９６６２３８３
未命名蛋白
Ｕｎｎａｍｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ
５．３９　 ２６７７８．７ Ｓ １３．０４
１５ ｇｉ：４１７７４５
Ｓ－腺苷 －Ｌ－半胱氨酸水解酶
Ｓ－ａｄｅｎｏｓｙｌ－Ｌ－ｈｏｍｏｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｌａｓｅ
５．６５　 ５３４３６．４６ Ｓ ４．７４
１６ ｇｉ：２９１０４７６７８
未命名蛋白
Ｕｎｎａｍｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ
５．８２　 ５４５０５．９４ Ｓ ９．０９
１７ ｇｉ：４１５８２３２
逆糖基化多肽
Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｙ　ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
５．８２　 ４１４９８．８２ Ｓ １１．９６
１８ ｇｉ：２５９０１７８１０
脱氢抗坏血酸还原酶
Ｄｅｈｙｄｒｏａｓｃｏｒｂａｔｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
５．８８　 ２３３５７．７１ Ｓ，Ｙ　 １５．５７
１９ ｇｉ：４８６８１２７
嘌呤吲哚蛋白前体
Ｐｕｒｏｉｎｄｏｌｉｎｅ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
５．９１　 １７０３２．６２ Ｓ ２９．２５
２０ ｇｉ：６９３７９４
醇溶燕麦蛋白－３
Ａｌｃｏｈｏｌ－ｓｏｌｕｂｌｅ　ａｖｅｎｉｎ－３
６．０６　 ２３２７６．９９ Ｃ ３４．３３
２１ ｇｉ：２２４７１２０４０
内切几丁质酶
Ｅｎｄｏｃｈｉｔｉｎａｓｅ
６．０８　 ２１７２８．１８ Ｓ，Ｙ，Ｃ　 ３５．００
２２ ｇｉ：２５７７８１２２２
铜／锌超氧化物歧化酶
Ｃｕ／Ｚｎ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ
６．１３　 １５１３２．７７ Ｓ，Ｙ，Ｃ　 １５．１３
２３ ｇｉ：１１５５２１３
醛糖还原酶相关蛋白
Ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ
６．２８　 ３５７７７．７８ Ｓ，Ｙ　 ２４．１４
２４ ｇｉ：３３２８２２１
硫氧还蛋白过氧化物酶
Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
６．３４　 ２８１３３．２８ Ｙ １２．４０
２５ ｇｉ：｜２２６３１６４３９
果糖二磷酸醛缩酶
Ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ
６．３９　 ３８８５４．２６ ＳＹ　 ２１．５１
２６ ｇｉ：｜１１３５９５
醛糖还原酶
Ａｌｄｏｓｅ　ｒｅｄｕｃｔａｓｅ
６．５１　 ３５８０６．９ Ｓ，Ｙ　 １１．８８
２７ ｇｉ：７４３１０２２
葡萄糖和核糖醇脱氢酶类似物
Ｇｌｕｃｏｓｅ　ａｎｄ　ｒｉｂｉｔｏｌ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ
６．５４　 ３１６４６．９３ Ｓ，Ｙ　 １６．０４
２８ ｇｉ：１７３７４９２
聚（Ａ）结合蛋白
Ｐｏｌｙ（Ａ）－ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ
６．６　 ７０８２３．４４ Ｓ ８．７６
１１１
草　地　学　报 第２０卷
续表１
蛋白点
Ｓｐｏｔ
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
蛋白质名称
Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｎａｍｅ
等电点
Ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ
ｐｏｉｎｔ
分子质量
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ／Ｄａ
溶解性
Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ
覆盖率／％
Ｃｏｖｅｒａｇｅ
１２９ ｇｉ：１４９３９３０１６
甘油醛－３－磷酸脱氢酶
Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ－３－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
６．６３　 ２８２５１．１９ Ｓ，Ｙ　 ２２．５２
３０ ｇｉ：１２３９７５
内源性α－淀粉酶
Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓα－ａｍｙｌａｓｅ
６．７７　 １９６３３．０９ Ｓ １６．１１
３１ ｇｉ：１７０６９６
贮藏蛋白
Ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
６．８　 ７２２５３．０７ Ｙ ４．８７
３２ ｇｉ：１６９９９０８９４
几丁质酶
Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
６．８９　 ３３２０２．０３ Ｓ，Ｙ　 １０．９７
３３ ｇｉ：２９５４２２６３３
未命名蛋白
Ｕｎｎａｍｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ
６．９６　 ２６２２４．３２ Ｓ，Ｙ　 １３．６９
３４ ｇｉ：２９５５０１
热休克蛋白１６．９Ｃ
Ｈｅａｔ　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１６．９Ｃ
６．２３　 １４３８４．２５ Ｓ ２２．３１
３５ ｇｉ：７５１０７１６６
醇溶蛋白
Ｐｒｏｌａｍｉｎ
７．４４　 ２１０３６．２２ Ｃ，Ｓ　 １４．８４
３６ ｇｉ：１１４７２０
燕麦蛋白前体
Ａｖｅｎｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
７．５４　 ２４２２９．５９ Ｃ ２３．８３
３７ ｇｉ：１６６５６８
种子贮藏蛋白
Ｓｅｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
７．５４　 ２４０６６．０４ Ｃ １１．００
３８ ｇｉ：１３４９１９
１２Ｓ种子贮藏球蛋白２
１２Ｓｓｅｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　２
７．６４　 ５８６７５．６９ Ｃ ９．６５
３９ ｇｉ：４５１１９３
Ｗａｌｉ７
Ｗａｌｉ７
７．６４　 ２９５００．９４ Ｓ，Ｙ　 １０．７４
４０ ｇｉ：２１５３９８４７０
球蛋白３
Ｇｌｏｂｕｌｉｎ　３
７．７８　 ６６３４９．９９ Ｙ ５．２７
４１ ｇｉ：５４１９９９０
果糖二磷酸醛缩酶
Ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｆｒｕｃｔｏｓｅ－ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｌｄｏｌａｓｅ
７．７９　 ２４８１５．３２ Ｙ ２１．１５
４２ ｇｉ：２０２５７４０９
类甜蛋白
Ｔｈａｕｍａｔｉｎ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
７．８５　 ２３５９７．７２ Ｓ，Ｙ　 ２４．４４
４３ ｇｉ：１２０３８３２ β
－Ｄ－葡聚糖同工酶
β－Ｄ－ｇｌｕｃａｎ　ｅｘｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ
７．９６　 ６７４２２．３ Ｙ ４．３３
４４ ｇｉ：１６６５５７
燕麦蛋白
Ａｖｅｎｉｎ
８．１５　 ２５４７１．５２ Ｃ，Ｓ　 １２．１６
４５ ｇｉ：２１２２８３６５８
Ｉ类几丁质酶
Ｃｌａｓｓ　Ｉ　ｃｈｉｔｉｎａｓｅ
８．２５　 ３３２４１．１４ Ｓ，Ｙ　 １１．０８
４６ ｇｉ：４８４２６６９３
未命名蛋白
Ｕｎｎａｍｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ
８．２６　 ３９４５９．５１ Ｓ，Ｙ　 ６．２３
４７ ｇｉ：１５５７３３２３５
Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎ
Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｉｎ
８．３４　 １５９０１．４７ Ｃ ２３．９４
４８ ｇｉ：１３７３３９２
醇溶蛋白前体
Ｐｅｒｍａｔｉｎ　ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ
８．４５　 ２３６７６．０４ Ｓ，Ｙ，Ｃ　 ５５．２６
４９ ｇｉ：１３４９１８
１２Ｓ种子贮藏球蛋白１
１２Ｓｓｅｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｇｌｏｂｕｌｉｎ　１
８．７８　 ５８５４４．６ Ｓ，Ｙ，Ｃ　 １８．１５
５０ ｇｉ：８７１９８２
１１Ｓ球蛋白
１１Ｓｇｌｏｂｕｌｉｎ
９．２　 ６１８６２．５２ Ｃ，Ｙ　 ８．５３
５１ ｇｉ：３０６９２０８９
１，３－β葡聚糖酶
１，３－β－ｇｌｕｃａｎａｓｅ
９．３５　 ３５２５７．８９ Ｓ，Ｙ　 ３２．７３
５２ ｇｉ：２７６４７９８
１２Ｓ球蛋白
１２Ｓｇｌｏｂｕｌｉｎ
９．３６　 ５３４２８．４２ Ｃ，Ｙ　 １５．６８
５３ ｇｉ：５５９７７０４３
组蛋白 Ｈ３．２
Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３．２
１１．２９　 １５２８３．９ Ｙ ２８．６８
５４ ｇｉ：７８１００００２
组蛋白 Ｈ４变异体
Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ４ｖａｒｉａｎｔ
１１．４８　 １１４０９．３３ Ｓ，Ｙ　 ３８．８３Ｎ
　　注：Ｓ，Ｙ，Ｃ分别代表超纯水、２．５％ＮａＣｌ和７０％乙醇溶液
Ｎｏｔｅ：Ｓ，Ｙ，Ｃ　ｐｒｅｓｅｎｔ　ＭｉｌＱ　ｗａｔｅｒ，２．５％ ＮａＣｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄ　７０％ｅｔｈａｎｏｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
２１１
第１期 王霞霞等：燕麦种子蛋白质组的ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
图３　鉴定蛋白质的物理化学特性
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
注：Ａ为鉴定蛋白质在不同溶剂中的溶解性，Ｂ为鉴定蛋白质的分子质量分布图，Ｃ为鉴定蛋白质的等电点分布图
Ｎｏｔｅ：Ａ，ｔｈｅ　ｒａｔｉｏｓ　ｏｆ　ｏａｔ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｒｅｅ　ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ；Ｂ，ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏａｔ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ；
Ｃ，ｔｈｅ　ｐＩ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｏａｔ　ｓｅｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
２．２　鉴定蛋白质功能的预测分类
蛋白质组学研究的主要目标是鉴定一个生物体
所表达的全部蛋白质，分析蛋白质的功能以及蛋白
质间的相互作用。为初步了解鉴定的燕麦种子蛋白
功能，本试验用ＧＯ数据库的注释对鉴定蛋白质从
分子功能、细胞组成和生物学途径３个方面进行了
预测。发现鉴定的５４个蛋白质中有４０个（７４．０７％）
蛋白 质 至 少 预 测 到 一 个 方 面 的 功 能；１４ 个
（２５．９３％）蛋白质未能得到预测。
由图４可知，所鉴定蛋白质在生物学途径方面
涉及细胞组成和起源、细胞过程、生物学调节等功
能，其中涉及代谢过程的蛋白最多（３３．３３％），包括
１，３－β葡聚糖酶、醛糖还原酶、β－淀粉酶２、磷酸丙糖
异构酶等蛋白；所鉴定蛋白质在分子功能方面主要
涉及结合和催化活性等功能，其中涉及结合功能蛋
白最多（２９．６３％），例如钙调蛋白和热激蛋白７０等；
在生物学细胞组成方面主要涉及细胞成分和胞外区
域，大部分鉴定的蛋白（５１．８５％）关于细胞组成方面
的功能还处于未知状态。
３　讨论
蛋白质样品的制备直接关系到后续蛋白的分离
鉴定。燕麦种子不同于其他谷类种子，以球蛋白为
主，其次是醇溶蛋白，清蛋白和谷蛋白含量很低［１１］。
蔺瑞等［１２］提取裸燕麦球蛋白，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳分
离，发现蛋白质分子量分布范围在４４～１４ｋＤａ区间。
刘刚等［１３］采用稀碱溶液（ｐＨ１０．０）提取燕麦种子蛋白
电泳分离，认为燕麦种子蛋白质分布于分子量６６．２～
１４．４ｋＤａ区间。但这些研究仅确定了燕麦种子蛋白
质的分子量分布范围，而未能对蛋白质组分进行分析
鉴定。鉴于此，本试验采用３种溶剂对燕麦种子蛋白
质分别提取，经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶分离串联ＬＣ－ＭＳ／
ＭＳ鉴定分析。结果显示：鉴定所得５４个蛋白质中
２５个蛋白质（４６．３０％）仅溶于１种溶剂，铜／锌超氧化
物歧化酶等５个蛋白质（９．２６％）在３种溶剂中都可
以溶解。燕麦种子蛋白分子量范围为９０．１６～２．７６
ｋＤａ；蛋白质等电点分布范围为１１．４８～４．１１。由此
发现，采用多溶剂提取较单一溶剂能更完整的获得燕
麦种子蛋白表达谱。
３１１
草　地　学　报 第２０卷
图４　鉴定蛋白质的功能分类图
Ｆｉｇ．４　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
注：Ａ表示鉴定蛋白的生物学途径分类图；Ｂ表示鉴定蛋白的分子功能预测预测分类图；Ｃ表示鉴定蛋白的细胞组成预测分类图
Ｎｏｔｅ：Ａ，ｔｈｅ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ；Ｂ，ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ；
Ｃ，ｔｈｅ　ｃｅｌ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
　　种子蛋白质在种子生长发育直至幼苗早期生长
的过程中都扮演着极其重要的角色。不仅为种子自
身呼吸代谢和萌发提供营养，负责幼苗早期生长发
育的养料供给［１４］；同时，还调控着机体各种生理生
化反应和代谢过程。生物体在不同的发育阶段会合
成类型数量不同的蛋白质。这些蛋白质代表着机体
某时刻特征性生命活动的基础［１５］。已有研究将不
同成熟度的种子蛋白质组进行比较，为解析种子蛋
白质的沉淀积累提供了科学依据［３，６，１６，１７］。Ｆｉｎｎｉｅ
等［１８］在大麦种子研究中发现大约８０％大麦种子的
蛋白都是在发育时期合成的贮藏蛋白。通过２－ＤＥ
分离了不同发育阶段大麦种子蛋白，发现种子蛋白
的存在与种子发育进程有关系。如胞质苹果酸脱氢
酶、ａ－淀粉酶／胰蛋白酶抑制剂存在于大麦种子发育
的整个过程，而ａ－淀粉酶／胰蛋白酶抑制剂、丝氨酸
蛋白酶抑制剂和抗氧化酶等低分子量蛋白在籽粒发
育过程中就已经开始积累，抗坏血酸过氧化物酶只
存在于早期籽粒灌浆中。
此外，Ｎａｔａｒａｊａｎ等［８］首次报道了野生型大豆和
栽培型大豆种子主要贮藏蛋白β－伴大豆球蛋白和大
豆球蛋白的表达谱，发现二者表达图谱相似，主要差
异体现在蛋白质点的丰度和数量方面；例如β－伴大
豆球蛋白的α亚基在野生型大豆中有７个点，而在
栽培型大豆中有５个点。李春梅等［９］也对不同品种
野生型和栽培型大豆种子贮藏蛋白做了分析，平均
分离到５５０个蛋白点；ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳ鉴定表达
量高的主要蛋白，得到５个蛋白，分别是大豆血凝
素、种子成熟蛋白ＰＭ２４、糖结合蛋白、胰蛋白酶抑
制剂ｐ２０以及成熟多肽；发现糖结合蛋白和成熟多
肽在栽培大豆中表达量较高与种子易于萌发相关，
胰蛋白酶抑制剂ｐ２０在野生大豆中表达量较高可能
与野生大豆种子抗逆性有关。说明种子蛋白质组分
数量与丰度还影响着植株体生物学性状。Ｃｈｍｅｌｉｋ
等［１９］采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结合ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ在大麦种
子中分离鉴定到β－淀粉酶、Ｂ３－大麦醇溶蛋白、α－淀
粉酶／枯草杆菌蛋白酶抑制因子的前体及５４ｋＤａ信
４１１
第１期 王霞霞等：燕麦种子蛋白质组的ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析
号识别蛋白等蛋白。Ｂａｋ－Ｊｅｎｓｅｎ等［４］通过二维凝
胶分别在大麦种子和胚中分离到３８０和５００蛋白
点，对其中分布于６０个蛋白点的３７个蛋白功能进
行预测，发现大部分蛋白与糖酵解、碳水化合物代
谢、氮代谢、胁迫反应或者蛋白质的合成与折叠等有
关。ｓｔｅｒｇａａｒｄ［５］通过二维凝胶结合质谱在大麦种
子中分离鉴定到１０３个蛋白，发现鉴定的蛋白涉及
持家蛋白酶、成熟脱水蛋白、氧化胁迫蛋白酶及热激
蛋白等６大类。Ｍａｋ等［２］采用二维凝胶方法在小
麦胚芽中分离到６１２个蛋白点，通过肽指纹质量图
谱成功鉴定到３４７个蛋白，包括脱氧还原酶、转移酶
和水解酶等６大酶类，大部分酶类在大麦萌发时储
藏能量物质动员利用中发挥重要作用。Ｇａｌａｒｄｏ
等［２０］在拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）种子中分离
到１３００个蛋白质，确定其中７４个蛋白质与种子萌
发有关联。本试验用ＧＯ数据库的注释对鉴定蛋白
质的功能进行分类发现，在分子功能方面主要涉及
结合、催化和营养物质储藏活性等；在生物学途径方
面涉及代谢过程、生物学调节和刺激应答等；关于蛋
白细胞组成的分类较少，仅预测到细胞成分和胞外
区域２大类。可见，成熟干燥种子内蛋白组分多，功
能多样，不仅能够维持自身生命活动，避免受到恶劣
环境伤害，保持活力；同时还为种子萌发储备了相关
部分蛋白，以保证种子在适宜环境中快速萌发。
４　结论
本试验采用ＧｅＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法鉴定了溶于超
纯水、２．５％ＮａＣｌ和７０％乙醇的５４个燕麦种子蛋
白质。鉴定蛋白的分子量范围为９０．１６～２．７６
ｋＤａ，等电点范围为１１．４８～４．１１。通过ＧＯ数据库
注释将蛋白质进行分类，发现鉴定蛋白涉及细胞过
程、刺激应答及酶调节活性等。它们体现了燕麦种
子萌发前干燥状态下部分生命活动特征，为进一步
从蛋白质水平来探索燕麦种子萌发的生理代谢机理
提供了依据。
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
ｅｈｕｌｋａ　Ｐ，ＳｔｅｌｃｏｖáＭ，ｅｔ　ａｌ．ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ
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（责任编辑　李美娟）
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