全 文 ：文章编号: 1007-0435( 2005) 01-0039-04
草地早熟禾农杆菌介导法基因转化条件
佘建明1,张保龙1,何晓兰1 ,陈志一2,倪万潮1
( 1.江苏省农业科学院农业生物遗传生理研究所,南京 210014;
2.浙江绍兴白云建设有限公司草业研究所, 新昌 312500)
摘要: 以大青山草地早熟禾(P oa p ratensis L . cv. Daqingshan)和超级伊克利草地早熟禾 (P oa p ratensis L . cv. T otal
eclipse)成熟种子诱导产生的胚性愈伤组织为材料, 比较抗生素及筛选剂对愈伤组织生长和绿苗分化的影响。结果表明:
500 mg / L 的羧苄青霉素或头孢霉素对愈伤组织的生长与对照间差异不显著; 羧苄青霉素可提高愈伤组织绿苗分化率,
而头孢霉素则有抑制作用; 2 个供试品种 G-418 的筛选浓度分别为 50和 70 mg / L 时, 愈伤组织的褐化率达 100% ; 在幼
苗分化期, G-418 浓度为 20 mg / L 时, 2 个供试品种的试管苗均为白化苗;在观察到愈伤组织周围的培养基上显现菌落
时, 立即转移到筛选培养基上为宜。用农杆菌介导法获得了转苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白( B . t)基因植株。
关键词: 草地早熟禾;胚性愈伤组织; 根癌农杆菌; B . t基因; 转基因植株
中图分类号: Q813. 1; S812　　　文献标识码 A
A Study on the Conditions of Genetic Transformation into
Poa p ratensis L. by Agrobacterium Tumefaciens
SHE Jian-m ing
1
, ZHANG Bao-long
1
, HE Xiao-lan
1
, CHEN Zhi-yi
2
, NI Wan-chao
1
( 1. Ins t itu te of Agrobiological Gen et ics and Physiology , Jiangsu Acad emy of Agricultural Sciences , Nanjing, Jiangsu Province 210014, Ch ina;
2. Ins titute of Forage Indus t ry, Zhejian g S haox ing Baiyun Const ru ct ion C o. Ltd, Xinchang, Zhejiang Province 312500, C hina)
Abstract: Using the embryogenic calli induced from the mature seeds o f Poa p r atensi s L. cv . Daqing shan and
To tal eclipse as recipient materials, authors of the paper studied the ef fect o f carbenicillin, cefotax ime, and
genet icin ( G-418) on the callus g row th and shoot regenerat ion. The result show s that the ef fect of 500 mg / L
carbenicil lin or cefotax ime to the grow th of calli matches that o f the control. Carbenicill in could increase the
rate of shoot regener at ion o f calli, w hile cefotax ime checks it . T he calli of the tw o species, “Daqingshan”and
“T otal eclipse”, screened separ ately w ith 50 mg / L and 70 mg / L of G-418 both turn brow n. During the shoot
regenerat ion period, 20 mg/ L o f G-418 turns al l the shoots w hite. T he t ime needed fo r culturing the
embryogenic callus and agrobacterium tumefaciens tog ether is determined by the appearance of colonies of the
lat ter that could be detected w ith naked eyes. T he callus should be t ransferred immediately to the screening
medium. The recombinant plasm id car rying B . t gene and N PT Ⅱ gene are int roduced into callus of “T otal
eclipse”by means of agr obacterium-mediated t ransformat ion. T ransgenic plants confirmed by PCR analysis are
thus obtained.
Key words : Poa p r atensi s; Embryogenic cal lus; Ag robacterium tumefaciens; B. t . g ene; Transgenic plant
　　在草坪草转基因技术研究方面, 国外运用原生质
体转化系统已在高羊茅( Festuca arundincea)、紫羊茅
( Festuca rubr a)、匍匐翦股颖( A grost is stolonif era)、多
年生黑麦草( Lolium per enne)和一年生黑麦草( Lolium
mul tif lorum)上获得了转基因植株[ 1～5] ;应用硅碳纤维旋
涡介导法在高羊茅、匍匐翦股颖、多年生黑麦草和一年生
黑麦草上得到了转基因植株[ 6] ;用基因枪法在高羊茅、紫
羊茅、匍匐翦股颖、多年生黑麦草、一年生黑麦草、草地早
收稿日期: 2003-12-11; 修回日期: 2004-02-23
基金项目:浙江省科技厅科研项目( 2003C32067) ;江苏省农业科学院重点领域研究项目( 6320301)
作者简介:佘建明( 1945- ) ,男,江苏苏州人,研究员,主要从事作物农业生物技术研究,已发表论文 40余篇, E -mail : S heJM101@ hotmail. com .
第 13卷　第 1期
　Vo l. 13　　No. 1
草　地　学　报
ACT A AGRESTIA SIN ICA
　2005 年　3月
　M arch 　2005
熟禾( Poa p ratensis)上获得成功 [ 7～11]。迄今为止,农杆
菌介导法在草坪草上获得成功的实例不多。Liang
等[ 12 ]首次采用农杆菌介导法在日本结缕草( Zoy sia
j aponica)上得到转基因植株,最近柴宝峰等 [ 13]在早熟
禾上建立了农杆菌介导的转基因方案。
农杆菌介导法具有操作简便、转化效率较高、遗传稳
定性好等特点, 已被广泛用于双子叶植物。由于农杆菌介
导法基因转化技术的不断改进,已在水稻、小麦、玉米等
禾谷类单子叶植物上提高了基因转化的效率。本研究在
已掌握草地早熟禾高频率植株再生技术的基础上, 研究
影响农杆菌介导法基因转化的有关因子, 旨在建立和完
善草地早熟禾农杆菌介导法基因转化技术体系。
1　材料与方法
1. 1　供试材料
1. 1. 1　以大青山草地早熟禾( Poa p ratensis L. cv .
Daqingshan) 和超级伊克利草地早熟禾 ( Poa p rate-
nsis L. cv . T otal eclipse)的成熟种子为供试材料。
1. 1. 2　种子消毒后接种在愈伤组织诱导培养基上, 诱
导产生的浅黄色、颗粒状、胚性愈伤组织作为农杆菌介
导法基因转化的受体材料。
1. 2　质粒与菌株
携带 pGBI4AB 的农杆菌菌株 LBA4404由中国
农业科学院生物技术研究所郭三堆先生惠赠, 其 T -
DNA 区结构简意图如下:
RB-Nos. P-NptII-Nos. T -2E35SP-8 -GFM Bt-
Po lyA-Nos. T -35SP-Gus-Nos. T -LB
1. 3　培养基
基本培养基由 MS 无机盐、B5 维生素组成[ 14, 15] ,
蔗糖 3%, 琼脂条 0. 8%。各种培养基在高压灭菌前调
整 pH值至 5. 8。
1. 3. 1　愈伤组织诱导培养基　附加 2, 4-D 2. 0 mg /
L , BAP 0. 2 mg / L。
1. 3. 2　愈伤组织继代培养基　添加 2, 4-D 1. 5 mg /
L , BAP 0. 5 mg / L。
1. 3. 3　愈伤组织分化培养基　附加 CPPU (苯基脲类
细胞分裂素) 2. 0 mg / L , NAA 0. 05 mg / L。
1. 3. 4　生根培养基　添加 BAP 0. 5 mg/ L , IBA 0. 5
mg / L。
1. 4　农杆菌介导基因转化因子
1. 4. 1　抗生素-羧苄青霉素、头孢霉素试验　胚性愈
伤组织分别转移到附加 500 mg / L 浓度的羧苄青霉
素、头孢霉素的愈伤组织继代培养基和分化培养基上,
观察愈伤组织生长和绿苗分化情况。
1. 4. 2　筛选剂 G-418 浓度试验　设置附加 G-418
30、40、50、60和 70 mg / L 愈伤组织继代培养基, 培养
20 d 后统计抗性愈伤组织的得率; 设置附加 G-418
20、50 mg/ L 愈伤组织分化培养基, 培养 25 d 后统计
绿苗分化率。
1. 4. 3　农杆菌共培养时间试验　农杆菌与胚性愈伤
组织共培养时间分别为1、3和5 d,共培养后的愈伤组
织转到添加 G-418 50和 70 mg / L 的愈伤组织继代培
养基上,培养 20 d后统计抗性愈伤组织的得率。
1. 4. 4　DNA 提取和 PCR 检测　取“超级伊克利”植
株的幼嫩叶片,按 CTAB 法提取DNA [ 16]。多聚酶链式
反映( PCR)扩增所用试剂购自宝生物公司, B . t 基因
检 测正 向引 物 序列 为 CCATACAACT GCT TG-
AGTAACCCDAGAAGTT , 反 向 引 物 序 列 为
GGGCCCGCTGAAT CCAACT GGAGAGGC。PCR 扩
增程序为 94℃ 3 m in, ( 94℃ 30 S、60℃ 50 S、72℃ 90
S) 35个循环。
2　结果与分析
2. 1　羧苄青霉素和头孢霉素对愈伤组织生长和分化
的影响
在附加 500 mg/ L 的羧苄青霉素或头孢霉素的继
代培养基上, 愈伤组织生长的速率和状态与对照比较,
无明显差异; 在添加 500 mg/ L 的羧苄青霉素或头孢
霉素的分化培养基上,愈伤组织分化绿苗的能力则有
差异,其中羧苄青霉素有利于提高绿苗的分化率,而头
孢霉素则有一定程度的抑制作用(表 1)。
表 1　羧苄青霉素和头孢霉素对愈伤组织绿苗分化率的影响
Table 1　Effect of carbenicillin and cefo tax ime on the r ate o f shoot r eg ener ation from calli
抗生素
An tib iot ics
大青山 Daqingshan 超级伊克利 T otal eclipse
愈伤总数
No. of total
callu s
绿苗愈伤数
No. of
sh oot callu s
分化率
Rate of sh oot
regen erat ion
愈伤总数
No. of total
callus
绿苗愈伤数
No. of shoot
cal lus
分化率
Rate of sh oot
r egen eration
羧苄青霉素
Car benicill in
80 28 35. 0 78 32 41. 0
头孢霉素
Cefotaxime
78 22 28. 2 80 24 30. 0
对照 CK 76 22 29. 0 82 28 34. 2
40 草　地　学　报 第 13卷
2. 2　G-418对愈伤组织生长和绿苗分化的影响
2. 2. 1　胚性愈伤组织接种在附加筛选剂 G-418不同
浓度的继代培养基上, 15 d 左右, 有一定比例的愈伤
组织由黄白色转变成棕褐色(图 1) ,且品种间的愈伤
组织 G-418筛选浓度明显不同(表 2)。G-418浓度为
50 mg / L 时, 大青山愈伤组织的褐化率达 100% ,而伊
克利仅为 47% ;当浓度提高到 70 mg/ L 时,伊克利愈
伤组织的褐化率达 100%。
2. 2. 2　在附加 20 mg/ L G-418 的分化培养基上, 大
青山和伊克利的愈伤组织均全部分化出白化苗, 同时
将已分化的绿苗转移到该培养基上, 15 d 后也全部转
变成白化苗(图 2)。结果表明,同一品种的愈伤组织在
生长和分化时期, G-418 筛选浓度间差异显著
( P< 0. 05)。愈伤组织在增殖生长阶段较耐筛选剂, 而
在绿苗分化和发育阶段对筛选剂较敏感。
图 1　褐化愈伤组织
F ig . 1　Brow n calli
表 2　G-418 对愈伤组织褐化率的影响
Table 2　Effect of G-418 on the r ate of br ow n callus
G-418
浓度( mg/ L)
G-418
Con cen tr at ion
大青山 Daqingshan 超级伊克利 T otal eclipse
愈伤总数
No. of total cal lus
褐化愈伤数
No. of brow n callu s
褐化率( % )
Rate of b rown ing
愈伤总数
No. of total callus
褐化愈伤数
No. of brow n callus
褐化率( % )
Rate of br ow nin g
30 72 66 91. 7 76 18 23. 7
40 68 64 94. 1 78 24 30. 8
50 76 76 100. 0 84 40 47. 6
60 72 48 66. 7
70 80 80 100. 0
图 2　白化苗
Fig . 2　White shoo ts
2. 3　农杆菌处理时间对愈伤组织的影响
试验中发现, 不论较高 ( OD 600约 0. 6 )或较低
( OD600约 0. 3)浓度的农杆菌, 若感染时间、与愈伤组
织共培养时间较长时,处理过的愈伤组织转移到附加
抗生素的筛选培养基上之后, 农杆菌的生长都难以抑
制。对共培养后的愈伤组织采取先用无菌水冲洗 3～4
次, 500 mg / L 头孢霉素或羧苄青霉素溶液浸泡 1 h 后
再用无菌水冲洗, 农杆菌的生长仍难以完全抑制。低浓
度农杆菌感染愈伤组织 2～5 min, 在共培养过程中,
当观察到在愈伤组织周围培养基上出现农杆菌菌落
时,应及时将愈伤组织转移到筛选培养基上,农杆菌的
生长才能得到有效控制。
2. 4　转 B. t基因植株的获得
挑选具有 G-418 抗性的“超级伊克利”的愈伤组
织,经增殖培养后在分化培养基上再生出 14株植株。
转化植株移栽成活后(图 3) ,从中选择 11 株, 对其基
因组 DNA 进行 PCR扩增, 其中 5株与阳性对照质粒
的条带一致(图 4) ,证明 B . t 基因已整合到部分转化
植株的基因组中。
图 3　转化植株
F ig . 3　T ransfo rm ed plant
41第 1期 佘建明等:草地早熟禾农杆菌介导法基因转化条件研究
图 4　转化植株 DNA PCR 检测
Fig . 4　PCR assay of B . t gene in tr ansfo rm ed plants
1: CK( unt ransformed plan t) ; 2: 2～12 t ransformed
plants; 13: pGBI4AB; 14: Marker
3　讨　论
3. 1　在禾谷类作物上,农杆菌介导法以愈伤组织为受
体材料时,除应选择具有绿苗分化能力的愈伤组织, 还
需要选择干燥、紧密、颗粒状结构的愈伤组织作为外植
体材料。笔者通过对诱导愈伤组织培养基的渗透压调
控,从草地早熟禾的成熟种子诱导出颗粒状胚性愈伤
组织, 为开展草地早熟禾农杆菌介导法基因转化工作
奠定了基础[ 17]。
3. 2　农杆菌介导法基因转化过程包括农杆菌感染外植
体材料、与外植体共培养、转化体筛选等步骤。在本试验
中, 草地早熟禾的愈伤组织经过农杆菌处理后转到筛选
培养基后,出现农杆菌难以抑制的状况,直接影响到愈
伤组织的生长和绿苗分化。在水稻等作物也出现类似情
况, 与农杆菌共培养后采用无菌水多次冲洗,再用含抗
生素的溶液浸泡、冲洗, 才能有效控制农杆菌的生
长[ 18]。笔者认为用较低浓度的农杆菌、较短时间感染愈
伤组织,在共培养过程中当愈伤组织周围培养基上呈现
菌落时即转移至筛选培养基上为宜。抑制农杆菌生长的
抗生素种类, 应考虑到对愈伤组织分化能力的影响, 可
选用羧苄青霉素与头孢霉素( 1∶1)组合。草地早熟禾不
同品种之间对筛选剂G-418敏感性有显著差异, 尤其是
在愈伤组织生长阶段。在应用农杆菌介导法开展草地早
熟禾转基因工作时,必须确定所选品种适宜的筛选剂浓
度, 本试验 2个供试品种愈伤组织适宜的筛选剂浓度分
别为 30和 60 mg / L , 绿苗分化适宜的筛选浓度为 20
mg / L ,这样才能淘汰大量的非转化体,得到一定数量的
再生植株,保证从中选择出转基因植株。
3. 3　本试验采用农杆菌介导法成功地将 B. t基因导
入草地早熟禾品种,获得了转基因工程植株。在此基础
上,拟进一步完善农杆菌介导法基因转化技术体系, 提
高基因转化效率。
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(下转 70页)
42 草　地　学　报 第 13卷
3　结论与建议
3. 1　土壤 C、N养分
苜蓿地土壤 C、N 各组分随种植年限的延长,变化
趋势相同:连续种植 5年, 苜蓿生长达到高峰期, 土壤
养分消耗较严重, C、N 组分含量最低, 随年限延长生
长趋于平稳, 各组分含量有所提高,种植 10年后,苜蓿
生长开始衰退,处于衰退初期的 15龄苜蓿各组分含量
有所提高,而 23龄苜蓿地土壤肥力达到一定程度的恢
复,各组分含量较其他年限高。
3. 2　土壤 P养分
土壤 P 组分的变化与 C、N 有所不同, Ca2-P 和
Fe-P 含量随年限延长逐渐降低,到 23年时又呈升高
趋势, Ca8-P、Al-P 和 O-P 变化趋势则相反; Ca10-P 型
磷变化与其他几种磷不同, 10 龄较 5龄降低, 15龄含
量提高, 23龄急剧下降; 5龄苜蓿地以中活性有机磷为
主, 10、15和 23龄苜蓿地土壤有机磷组分的变化均表
现为: 中稳性有机磷> 中活性有机磷> 高稳性有机磷
> 活性有机磷。
3. 3　建议
为了保持高原沟壑区苜蓿地稳定的产草量, 在苜
蓿利用第 4～5年,实施粮草轮作,种植 3～5年粮食作
物,即在苜蓿未发生衰退之前,种植禾本科作物, 恢复
土壤水分, 缩短苜蓿生长年限; 在连作苜蓿中增施化
肥,以培肥地力、提高苜蓿产草量。
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70 草　地　学　报 第 13卷